一种磷酸化改性的鳕鱼胶原蛋白肽的制备方法与流程

1.本技术涉及水产品加工领域，特别涉及一种磷酸化改性的鳕鱼胶原蛋白肽的制备方法。


背景技术：

2.鳕鱼是我国重要的海洋经济鱼种之一，年加工量可达400,000～500,000t，约可产生28,000～40,000t的鳕鱼皮，大约有95％用于加工成饲料，而仅有不到5％用于提取胶原蛋白或加工成临床医用食品。鳕鱼皮皮厚且宽，主要含有大量的胶原蛋白。所以对鱼肉分割加工过程中产生的大量鱼皮，如果充分利用提取，可以提高水产加工的附加值。
3.胶原蛋白具有低免疫活性、可生物降解性等优点，是优良的食品、生物医用材料。但同时，胶原的生物活性很难保持，溶解性、乳化性等性质不能满足工业使用要求，这些限制了胶原的应用，因此，对胶原进行改性是十分必要的。
4.磷酸化改性是磷酸盐选择性地与蛋白质中特定的活性基团，如丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸的羟基以及赖氨酸的氨基发生酯化反应，将带负电荷的磷酸根基团引入蛋白质分子中，对蛋白质的溶解性、疏水性、乳化性产生显著地改善效果。但是由于反应大多在溶液中进行，反应很剧烈难以控制，蛋白质很容易在反应中聚合和变性。另外磷酸化试剂难以除去等问题，使得用pocl3、p2o5等作为磷酸化试剂的应用受到限制，而且磷酸化蛋白不易被消费者所接受。


技术实现要素：

5.鉴以此，本技术提出一种磷酸化改性的鳕鱼胶原蛋白肽的制备方法，以解决磷酸化改性的鳕鱼胶原蛋白肽的聚合变性问题。
6.本技术的技术方案是这样实现的：
7.一种磷酸化改性的鳕鱼胶原蛋白肽的制备方法，包括以下步骤：
8.(1)将鳕鱼皮经过预处理清洗后，经过酶解、离心所得上清液经过脱盐、冻干后制得鳕鱼胶原蛋白肽粉；
9.(2)将鳕鱼胶原蛋白肽粉溶于70-80℃的水中，再加入磷酸缓释物反应2-5h后，经过滤、透析，制成磷酸化改性的鳕鱼胶原蛋白肽；
10.所述鳕鱼胶原蛋白肽粉与水的重量比为1:150-200，所述鳕鱼胶原蛋白肽粉与磷酸缓释物的重量比为20:2-5。
11.采用磷酸缓释物与鳕鱼鱼胶原蛋白肽粉反应能够降低磷酸化改性的速率，从而避免了鳕鱼鱼胶原蛋白肽的聚合和变性。
12.进一步的技术方案时，步骤(1)中的预处理是将鳕鱼皮剪碎，并在40-50℃温度下在质量浓度为5-10％的碳酸钠溶液中脱脂30-60min。
13.进一步的技术方案时，所述步骤(2)中的磷酸缓释物为磷酸缓释材料或磷酸缓释微球。
14.进一步的技术方案时，所述磷酸缓释材料包括磷酸盐玻璃。
15.进一步的技术方案时，所述磷酸缓释微球的制备方法为将载体材料溶于二氯甲烷作为油相，将磷酸化试剂溶于水中作为水相，所述油相和水相在冰浴条件下采用超声乳化制备成油/水乳液，然后在20-35℃下挥发除去二氯甲烷固化成微球，所述微球经过离心洗涤干燥制成磷酸缓释微球。
16.再进一步的技术方案时，所述载体材料为聚乙烯、聚氯乙烯、丙烯酸树脂、聚四氟乙烯、有机硅高分子、聚丙烯酰胺中的一种或多种。
17.再进一步的技术方案时，所述的磷酸化试剂包括磷酰氯、环状磷酸三钠、 p2o5、h3po4、三聚磷酸钠中的一种。
18.再进一步的技术方案时，所述油相中载体材料的浓度为25-30g/l,所述水相中磷酸化试剂的浓度为10-20g/l，所述油相与水相的体积比为1:2-5。
19.再进一步的技术方案时，所述超声乳化的超声功率为1000-1500w,超声时间为2-5min。
20.再进一步的技术方案时，所述磷酸缓释微球的粒径为0.9-1.1μm。
21.与现有技术相比，本技术的有益效果是：
22.(1)本技术所述的磷酸化改性的鳕鱼胶原蛋白肽的制备方法中，采用磷酸缓释物改性鳕鱼胶原蛋白肽，克服了磷酸化化学试剂在改性鳕鱼胶原蛋白肽的过程中反应过于剧烈，使得蛋白质聚合变性的问题；同时由于磷酸化试剂缓慢释放，并定时终止反应，避免了鳕鱼胶原蛋白肽中的磷酸化试剂残留问题。
23.(2)本技术所述的磷酸化改性的鳕鱼胶原蛋白肽的制备方法，采用磷酸缓释物作为改性试剂，提高了磷酸化化学试剂在改性胶原蛋白肽中的应用。
具体实施方式
24.为了更好理解本技术技术内容，下面提供具体实施例，并对本技术做进一步的说明。
25.实施例1
26.一种磷酸化改性的鳕鱼胶原蛋白肽的制备方法，包括以下步骤：
27.(1)将鳕鱼皮经过预处理清洗后，经过碱性蛋白酶酶解(鳕鱼皮、碱性蛋白酶和水的质量比为200:1:500，酶解温度55℃，酶解时间5h，ph为8.5)、离心所得上清液经过脱盐至溶解液电导率《1ms/cm，并在-30至-20℃下冻干24h后制得鳕鱼胶原蛋白肽粉；
28.(2)将鳕鱼胶原蛋白肽粉溶于70℃的水中，再加入磷酸缓释物反应5h后，经过滤、透析，制成磷酸化改性的鳕鱼胶原蛋白肽；
29.所述鳕鱼胶原蛋白肽粉与水的重量比为1:150，所述鳕鱼胶原蛋白肽粉与磷酸缓释物的重量比为10:1。
30.步骤(1)中的预处理是将鳕鱼皮剪碎，并在40℃温度下在质量浓度为5％的碳酸钠溶液中脱脂30min。
31.所述步骤(2)中的磷酸缓释物为磷酸盐玻璃。
32.实施例2
33.一种磷酸化改性的鳕鱼胶原蛋白肽的制备方法，包括以下步骤：
34.(1)将鳕鱼皮经过预处理清洗后，经过碱性蛋白酶酶解(鳕鱼皮、碱性蛋白酶和水的质量比为200:1:500，酶解温度55℃，酶解时间5h，ph为8.5)、离心所得上清液经过脱盐至溶解液电导率《1ms/cm，并在-30至-20℃下冻干24h后制得鳕鱼胶原蛋白肽粉；
35.(2)将鳕鱼胶原蛋白肽粉溶于80℃的水中，再加入磷酸缓释物反应2h后，经过滤、透析，制成磷酸化改性的鳕鱼胶原蛋白肽；
36.所述鳕鱼胶原蛋白肽粉与水的重量比为1:200，所述鳕鱼胶原蛋白肽粉与磷酸缓释物的重量比为4:1。
37.步骤(1)中的预处理是将鳕鱼皮剪碎，并在50℃温度下在质量浓度为10％的碳酸钠溶液中脱脂60min。
38.所述步骤(2)中的磷酸缓释物为磷酸盐玻璃。
39.实施例3
40.一种磷酸化改性的鳕鱼胶原蛋白肽的制备方法，包括以下步骤：
41.(1)将鳕鱼皮经过预处理清洗后，经过碱性蛋白酶酶解(鳕鱼皮、碱性蛋白酶和水的质量比为200:1:500，酶解温度55℃，酶解时间5h，ph为8.5)、离心所得上清液经过脱盐至溶解液电导率《1ms/cm，并在-30至-20℃下冻干24h后制得鳕鱼胶原蛋白肽粉；
42.(2)将鳕鱼胶原蛋白肽粉溶于70℃的水中，再加入磷酸缓释物反应2h后，经过滤、透析，制成磷酸化改性的鳕鱼胶原蛋白肽；
43.所述鳕鱼胶原蛋白肽粉与水的重量比为1:150，所述鳕鱼胶原蛋白肽粉与磷酸缓释物的重量比为10:1。
44.步骤(1)中的预处理是将鳕鱼皮剪碎，并在40℃温度下在质量浓度为5％的碳酸钠溶液中脱脂30min。
45.所述步骤(2)中的磷酸缓释物为磷酸缓释微球。
46.所述磷酸缓释微球的制备方法为将载体材料溶于二氯甲烷作为油相，将磷酸化试剂溶于水中作为水相，所述油相和水相在冰浴条件下采用超声乳化制备成油/水乳液，然后在20℃下挥发除去二氯甲烷固化成微球，所述微球经过离心洗涤干燥制成磷酸缓释微球。
47.所述载体材料为聚乙烯，所述的磷酸化试剂磷酰氯，所述油相中载体材料的浓度为25g/l,所述水相中磷酸化试剂的浓度为10g/l，所述油相与水相的体积比为1:2。所述超声乳化的超声功率为1000w,超声时间为5min。所述磷酸缓释微球的粒径为0.9μm。
48.实施例4
49.一种磷酸化改性的鳕鱼胶原蛋白肽的制备方法，包括以下步骤：
50.(1)将鳕鱼皮经过预处理清洗后，经过碱性蛋白酶酶解(鳕鱼皮、碱性蛋白酶和水的质量比为200:1:500，酶解温度55℃，酶解时间5h，ph为8.5)、离心所得上清液经过脱盐至溶解液电导率《1ms/cm，并在-30至-20℃下冻干24h后制得鳕鱼胶原蛋白肽粉；
51.(2)将鳕鱼胶原蛋白肽粉溶于80℃的水中，再加入磷酸缓释物反应2h后，经过滤、透析，制成磷酸化改性的鳕鱼胶原蛋白肽；
52.所述鳕鱼胶原蛋白肽粉与水的重量比为1:200，所述鳕鱼胶原蛋白肽粉与磷酸缓释物的重量比为4:1。
53.步骤(1)中的预处理是将鳕鱼皮剪碎，并在50℃温度下在质量浓度为10％的碳酸钠溶液中脱脂60min。
54.所述步骤(2)中的磷酸缓释物为磷酸缓释微球。所述磷酸缓释微球的制备方法为将载体材料溶于二氯甲烷作为油相，将磷酸化试剂溶于水中作为水相，所述油相和水相在冰浴条件下采用超声乳化制备成油/水乳液，然后在35℃下挥发除去二氯甲烷固化成微球，所述微球经过离心洗涤干燥制成磷酸缓释微球。
55.所述载体材料为聚丙烯酰胺。所述的磷酸化试剂为三聚磷酸钠。所述油相中载体材料的浓度为30g/l,所述水相中磷酸化试剂的浓度为20g/l，所述油相与水相的体积比为1:5。所述超声乳化的超声功率为1500w,超声时间为2min。所述磷酸缓释微球的粒径为1.1μm。
56.实施例5
57.一种磷酸化改性的鳕鱼胶原蛋白肽的制备方法，包括以下步骤：
58.(1)将鳕鱼皮经过预处理清洗后，经过碱性蛋白酶酶解(鳕鱼皮、碱性蛋白酶和水的质量比为200:1:500，酶解温度55℃，酶解时间5h，ph为8.5)、离心所得上清液经过脱盐至溶解液电导率《1ms/cm，并在-30至-20℃下冻干24h后制得鳕鱼胶原蛋白肽粉；
59.(2)将鳕鱼胶原蛋白肽粉溶于75℃的水中，再加入磷酸缓释物反应3h后，经过滤、透析，制成磷酸化改性的鳕鱼胶原蛋白肽；
60.所述鳕鱼胶原蛋白肽粉与水的重量比为1:180，所述鳕鱼胶原蛋白肽粉与磷酸缓释物的重量比为5:1。
61.步骤(1)中的预处理是将鳕鱼皮剪碎，并在45℃温度下在质量浓度为8％的碳酸钠溶液中脱脂45min。
62.所述步骤(2)中的磷酸缓释物为磷酸缓释微球。
63.所述磷酸缓释微球的制备方法为将载体材料溶于二氯甲烷作为油相，将磷酸化试剂溶于水中作为水相，所述油相和水相在冰浴条件下采用超声乳化制备成油/水乳液，然后在3℃下挥发除去二氯甲烷固化成微球，所述微球经过离心洗涤干燥制成磷酸缓释微球。
64.所述载体材料为丙烯酸树脂和聚四氟乙烯，所述丙烯酸树脂和聚四氟乙烯的重量比为1:1。所述的磷酸化试剂h3po4。所述油相中载体材料的浓度为28g/l, 所述水相中磷酸化试剂的浓度为15g/l，所述油相与水相的体积比为1:3。所述超声乳化的超声功率为1200w,超声时间为4min。所述磷酸缓释微球的粒径为 1.0μm。
65.对比例1
66.将磷酸盐玻璃替换为三聚磷酸钠，其他与实施例1相同。
67.对比例2
68.将磷酸缓释微球替换为磷酰氯，其他与实施例3相同。
69.对比例3
70.将磷酸缓释微球替换为h3po4，其他与实施例5相同。
71.试验检测
72.将实施例1-5、对比例1-3所述的磷酸化改性的鳕鱼胶原蛋白肽溶于水中搅拌均匀，观察8个试验组的溶液情况；然后再在上述8组试验组中边缓慢搅拌边滴加硝酸银，再次观察8个试验组的溶液情况，试验结果见表1。
73.溶液透明度设为三个等级，1级为透明，2级为微浑，3级为浑浊，以1g鳕鱼胶原蛋白肽溶于100ml蒸馏水得到的鳕鱼胶原蛋白肽溶液作为试样，并以蒸馏水在分光光度计上校
正透光率为100％，其中60％《试样透光率≦100％为1级， 35％《试样透光率≦60％为2级，试样透光率≦35％为3级。
74.表1
[0075][0076]
通过试验结果表1得知，实施例1-5的试样的透光率在80％-89％之间，试样溶液透明，而对比例1-3的试样透光率在29％-32％之间，试样溶液浑浊，表明实施例1-5的鳕鱼胶原蛋白肽溶液不存在蛋白质聚集、变性情况，其中磷酸盐玻璃作为磷酸缓释物的试样透光率均高于磷酸缓释微球，而对比例1-3中的鳕鱼胶原蛋白肽溶液存在蛋白质聚集、变性现象；上述水溶液经过滴加硝酸银后，实施例1-5无明显沉淀，表明实施例1-5中的鳕鱼胶原蛋白肽溶液中无磷酸根离子(磷酸化试剂)残留。而对比例1-3有黄色沉淀生成，而再次滴加硝酸溶液后，沉淀消失；表明对比例1-3中的鳕鱼胶原蛋白肽溶液中含有磷酸根离子(磷酸化试剂)残留。
[0077]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。