嗜热链球菌JMCC0032及其应用的制作方法

嗜热链球菌jmcc0032及其应用
技术领域
1.本发明属于生物工程领域，涉及一种菌株，具体地说是嗜热链球菌 jmcc0032及其应用。


背景技术：

2.酸奶的香气，主要由香精香料产生的香气、奶香气和发酵过程中产生的挥发性气体混合而成，酸奶的香气是提升酸奶口感的关键因素。随着消费者对于健康饮食需求的提高，各厂家对于香精香料的添加更加谨慎，与此同时人们越来越热衷于低脂饮食，而低脂牛奶由于脂肪含量较低而导致奶香气大幅度减弱。因此，提升发酵过程中挥发性气体的香气成为了研究的热点。
3.目前，嗜热链球菌(streptococcus thermophilus)是我国规定的可用于食品中的常用益生菌菌株之一，可广泛应用于食品发酵、工业乳酸发酵、饲料行业和医疗保健等领域。


技术实现要素：

4.本发明的目的，是要提供一株嗜热链球菌jmcc0032，以作为发酵剂的辅助菌株，实现提高发酵乳的发酵香气的目的；
5.本发明的另一个目的，是要提供上述嗜热链球菌jmcc0032的应用。
6.为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
7.一种嗜热链球菌jmcc0032，它保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2021 年5月18日，保藏编号为cgmcc no.22559，拉丁文名称为streptococcusthermophilus。
8.作为一种限定，上述嗜热链球菌jmcc0032的16srrna基因序列如下：
9.accgacttcgggtgttacaaactctcgtggtgtgacgggcggtgtgtacaaggcccgggaacgt attcaccgcggcgtgctgatccgcgattactagcgattccgacttcatgtaggcgagttgcagcctac aatccgaactgagattggctttaagagattagctcgccgtcaccgactcgcaactcgttgtaccaacc attgtagcacgtgtgtagcccaggtcataaggggcatgatgatttgacgtcatccccaccttcctccg gtttattaccggcagtctcgctagagtgcccaactgaatgatggcaactaacaataggggttgcgctc gttgcgggacttaacccaacatctcacgacacgagctgacgacaaccatgcaccacctgtcaccgatg taccgaagtaactttctatctctagaaatagcatcgggatgtcaagacctggtaaggttcttcgcgtt gcttcgaattaaaccacatgctccaccgcttgtgcgggcccccgtcaattcctttgagtttcaacctt gcggtcgtactccccaggcggagtgcttaatgcgttagcttcggcactgaatcccggaaaggatccaa cacctagcactcatcgtttacggcgtggactaccagggtatctaatcctgttcgctccccacgctttc gagcctcagcgtcagttacagaccagagagccgctttcgccaccggtgttcctccatatatctacgca tttcaccgctacacatggaattccactctccccttctgcactcaagtttgacagtttccaaagcgaac tatggttgagccacagcctttaacttcagacttatcaaaccgcctgcgctcgctttacgcccaataaa tccggacaacgctcgggacctacgtattaccgcggctgctggcacgtagttagccgtccctttctggt aagctaccgtcacagtgt
gaactttccactctcacacccgttcttgacttacaacagagctttacgat ccgaaaaccttcttcactcacgcggcgttgctcggtcagggttgcccccattgccgaagattccctac tgctgcctcccgtaggagtctgggccgtgtctcagtcccagtgtggccgatcaccctctcaggtcggc tatgtatcgtcgcctaggtgagccattacctcacctactagctaatacaacgcaggtccatcttgtag tggagcaattgcccctttcaaataaatgacatgtgtcatccattgttatgcggtattagctatcgttt ccaatagttatcccccgctacaaggcaggttacctacgcgttactcacccgttcgcaactcatccaag aagagcaagctcctctctt。
10.作为另一种限定，上述嗜热链球菌jmcc0032的phes基因序列如下：
11.catacaagtcctgtccaagctcgtacacttgataaacatgatttttctaaaggtcctcttaaga tgatctcaccaggacgtgttttccgtcgtgataccgatgatgcgactcacagccaccagtttcaccaa atcgaaggtttggtcgttggtaaaaacatctcaatgggtgatctgaagggaacgcttgagatgattat tcaaaaaatgtttggtgcagaacgtcaaatccgtttgcgtccttcttacttcccattcactgaacctt ccgttgaggttgacgtgtcatgcttcaagtgtggtggtaaaggatgtaacgtatgcaagaagacaggt tggattgagatccttggtgctggtatggttcacccacaagtgcttgagatgtcaggtgttgattctga agaatattc。
12.作为第三种限定，上述嗜热链球菌jmcc0032是从新疆传统发酵乳中分离筛选出来的。
13.本发明还提供了上述嗜热链球菌jmcc0032的一种应用，该菌用于制备发酵剂。
14.作为一种限定，所述发酵剂用于提高发酵乳的发酵香气。
15.由于采用了上述技术方案，本发明与现有技术相比，所取得的技术进步在于：
16.本发明获得的嗜热链球菌jmcc0032，作为发酵剂的辅助菌株，提高了发酵乳的发酵香气。
17.本发明适用于分离嗜热链球菌jmcc0032，分离得到的嗜热链球菌 jmcc0032，可以作为发酵剂的辅助菌株，提高发酵乳的发酵香气。
附图说明
18.下面结合附图及具体实施例对本发明作更进一步详细说明：
19.图1为本发明实施例6中各菌株的发酵曲线图。
具体实施方式
20.下面通过具体实施例对本发明做进一步详细说明。应当理解，所描述的实施例仅用于解释本发明，并不限定本发明。
21.实施例1 一种嗜热链球菌jmcc0032及其分离纯化方法
22.一、菌种信息
23.嗜热链球菌jmcc0032是从新疆传统发酵乳中分离筛选出来的，其菌株于 2021年5月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为cgmcc no.22559，拉丁文名称是streptococcus thermophilus。
24.二、嗜热链球菌jmcc0032的分离纯化方法
25.该分离纯化方法按照以下步骤依次进行：
26.s1.采集样品
d-核糖-n-乙酰-葡糖胺-木糖醇-d-木糖-苦杏仁甙-龙胆二糖-l-木糖-熊果甙-d-松二糖-阿东醇-七叶灵-d-来苏糖-β-甲基-d-木糖甙-水杨苷-d-塔格糖-d-半乳糖-纤维二糖-d-岩藻糖-d-葡萄糖+麦芽糖-l-岩藻糖-d-果糖-乳糖+d-阿拉伯糖醇-d-甘露糖-蜜二糖-l-阿拉伯糖醇-l-山梨糖-蔗糖+葡萄糖酸盐-l-鼠李糖-海藻糖-2-酮基-葡萄糖酸盐-卫茅醇-菊糖-肌醇-49.注：“+”表示发酵利用；
“‑”
表示不发酵利用。
50.实施例4 嗜热链球菌jmcc0032的分子生物学鉴定
51.取嗜热链球菌jmcc0032进行分子生物学鉴定，通过dna提取、pcr扩增、16srdna、phes基因测序，于ncbi网站blast最终确定为嗜热链球菌；
52.其16srdna测序结果如下：
53.accgacttcgggtgttacaaactctcgtggtgtgacgggcggtgtgtacaaggcccgggaacgt attcaccgcggcgtgctgatccgcgattactagcgattccgacttcatgtaggcgagttgcagcctac aatccgaactgagattggctttaagagattagctcgccgtcaccgactcgcaactcgttgtaccaacc attgtagcacgtgtgtagcccaggtcataaggggcatgatgatttgacgtcatccccaccttcctccg gtttattaccggcagtctcgctagagtgcccaactgaatgatggcaactaacaataggggttgcgctc gttgcgggacttaacccaacatctcacgacacgagctgacgacaaccatgcaccacctgtcaccgatg taccgaagtaactttctatctctagaaatagcatcgggatgtcaagacctggtaaggttcttcgcgtt gcttcgaattaaaccacatgctccaccgcttgtgcgggcccccgtcaattcctttgagtttcaacctt gcggtcgtactccccaggcggagtgcttaatgcgttagcttcggcactgaatcccggaaaggatccaa cacctagcactcatcgtttacggcgtggactaccagggtatctaatcctgttcgctccccacgctttc gagcctcagcgtcagttacagaccagagagccgctttcgccaccggtgttcctccatatatctacgca tttcaccgctacacatggaattccactctccccttctgcactcaagtttgacagtttccaaagcgaac tatggttgagccacagcctttaacttcagacttatcaaaccgcctgcgctcgctttacgcccaataaa tccggacaacgctcgggacctacgtattaccgcggctgctggcacgtagttagccgtccctttctggt aagctaccgtcacagtgtgaactttccactctcacacccgttcttgacttacaacagagctttacgat ccgaaaaccttcttcactcacgcggcgttgctcggtcagggttgcccccattgccgaagattccctac tgctgcctcccgtaggagtctgggccgtgtctcagtcccagtgtggccgatcaccctctcaggtcggc tatgtatcgtcgcctaggtgagccattacctcacctactagctaatacaacgcaggtccatcttgtag tggagcaattgcccctttcaaataaatgacatgtgtcatccattgttatgcggtattagctatcgttt ccaatagttatcccccgctacaaggcaggttacctacgcgttactcacccgttcgcaactcatccaag aagagcaagctcctctctt
54.其phes测序结果如下：
55.catacaagtcctgtccaagctcgtacacttgataaacatgatttttctaaaggtcctcttaaga tgatctcaccaggacgtgttttccgtcgtgataccgatgatgcgactcacagccaccagtttcaccaa atcgaaggtt
tggtcgttggtaaaaacatctcaatgggtgatctgaagggaacgcttgagatgattat tcaaaaaatgtttggtgcagaacgtcaaatccgtttgcgtccttcttacttcccattcactgaacctt ccgttgaggttgacgtgtcatgcttcaagtgtggtggtaaaggatgtaacgtatgcaagaagacaggt tggattgagatccttggtgctggtatggttcacccacaagtgcttgagatgtcaggtgttgattctga agaatattc。
56.实施例5 嗜热链球菌jmcc0032的产香气实验
57.本实施例为嗜热链球菌jmcc0032产香气性能的实验，具体实验方法如下：
58.s1.取40kg的生牛乳和2.8kg的白砂糖混合均匀，制得发酵基料，将发酵剂料平均分为4份，得发酵基料a-d；
59.s2.分别向发酵基料a-d中接入0.6g的嗜热链球菌jmcc0031、嗜热链球菌 jmcc0032、嗜热链球菌jmcc0033和发酵剂jlb-1510，42℃条件下发酵5.5h，降温至25℃后搅拌均匀，在4℃条件下放置24h，得酸奶a-d；
60.其中，嗜热链球菌jmcc0031已于2021年5月18日保藏至中国微生物菌种 保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3 号，保藏编号为cgmcc no.22558，拉丁文名称是streptococcus thermophilus；
61.嗜热链球菌jmcc0031的16srrna基因序列如下：
62.accgacttcgggtgttacaaactctcgtggtgtgacgggcggtgtgtacaaggcccgggaacgt attcaccgcggcgtgctgatccgcgattactagcgattccgacttcatgtaggcgagttgcagcctac aatccgaactgagattggctttaagagattagctcgccgtcaccgactcgcaactcgttgtaccaacc attgtagcacgtgtgtagcccaggtcataaggggcatgatgatttgacgtcatccccaccttcctccg gtttattaccggcagtctcgctagagtgcccaactgaatgatggcaactaacaataggggttgcgctc gttgcgggacttaacccaacatctcacgacacgagctgacgacaaccatgcaccacctgtcaccgatg taccgaagtaactttctatctctagaaatagcatcgggatgtcaagacctggtaaggttcttcgcgtt gcttcgaattaaaccacatgctccaccgcttgtgcgggcccccgtcaattcctttgagtttcaacctt gcggtcgtactccccaggcggagtgcttaatgcgttagcttcggcactgaatcccggaaaggatccaa cacctagcactcatcgtttacggcgtggactaccagggtatctaatcctgttcgctccccacgctttc gagcctcagcgtcagttacagaccagagagccgctttcgccaccggtgttcctccatatatctacgca tttcaccgctacacatggaattccactctccccttctgcactcaagtttgacagtttccaaagcgaac tatggttgagccacagcctttaacttcagacttatcaaaccgcctgcgctcgctttacgcccaataaa tccggacaacgctcgggacctacgtattaccgcggctgctggcacgtagttagccgtccctttctggt aagctaccgtcacagtggtgaactttccactctcacacccgttcttgacttacaacagagctttacga tccgaaaaccttcttcactcacgcggcgttgctcggtcagggttgcccccattgccgaagattcccta ctgctgcctcccgtaggagtctgggccgtgtctcagtcccagtgtggccgatcaccctctcaggtcgg ctatgtatcgtcgcctaggtgagccattacctcacctactagctaatacaacgcaggtccatcttgta gtggagcaattgcccctttcaaataaatgacatgtgtcatccattgttatgcggtattagctatcgtt tccaatagttatcccccgctacaaggcaggttacctacgcgttactcacccgttcgcaactcatccaa gaagagcaagctcct；
63.嗜热链球菌jmcc0031的phes基因序列如下：
64.catacaagtcctgtccaagctcgtacacttgataaacatgatttttctaaaggtcctcttaaga tgatctcaccaggacgtgttttccgtcgtgataccgatgatgcgactcacagccaccagtttcaccaa atcgaaggtttggtcgttggtaaaaacatctcaatgggtgatctgaagggaacgcttgagatgattat tcaaaaatgtttggtgcagaacgtcaaatccgtttgcgtccttcttacttcccattcactgaaccttc cgttgaggttgacgtgtcatgctt
caagtgtggtggtaaaggatgtaacgtatgcaagaagacaggtt ggattgagatccttggtgctggtatggttcacccacaagtgcttgagatgtcaggtgttgattctgaa gaatat；
65.嗜热链球菌jmcc0033已于2021年5月18日保藏至中国微生物菌种保藏管 理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保 藏编号为cgmcc no.22560，拉丁文名称是streptococcus thermophilus；
66.嗜热链球菌jmcc0033的16srrna基因序列如下：
67.accgacttcgggtgttacaaactctcgtggtgtgacgggcggtgtgtacaaggcccgggaacgt attcaccgcggcgtgctgatccgcgattactagcgattccgacttcatgtaggcgagttgcagcctac aatccgaactgagattggctttaagagattagctcgccgtcaccgactcgcaactcgttgtaccaacc attgtagcacgtgtgtagcccaggtcataaggggcatgatgatttgacgtcatccccaccttcctccg gtttattaccggcagtctcgctagagtgcccaactgaatgatggcaactaacaataggggttgcgctc gttgcgggacttaacccaacatctcacgacacgagctgacgacaaccatgcaccacctgtcaccgatg taccgaagtaactttctatctctagaaatagcatcgggatgtcaagacctggtaaggttcttcgcgtt gcttcgaattaaaccacatgctccaccgcttgtgcgggcccccgtcaattcctttgagtttcaacctt gcggtcgtactccccaggcggagtgcttaatgcgttagctgcggcactgaatcccggaaaggatccaa cacctagcactcatcgtttacggcgtggactaccagggtatctaatcctgttcgctccccacgctttc gagcctcagcgtcagttacagaccagagagccgctttcgccaccggtgttcctccatatatctacgca tttcaccgctacacatggaattccactctccccttctgcactcaagtttgacagtttccaaagcgaac tatggttgagccacagcctttaacttcagacttatcaaaccgcctgcgctcgctttacgcccaataaa tccggacaacgctcgggacctacgtattaccgcggctgctggcacgtagttagccgtccctttctggt aagctaccgtcacagtgtgaactttccactctcacacccgttcttgacttacaacagagctttacgat ccgaaaaccttcttcactcacgcggcgttgctcggtcagggttgcccccattgccgaagattccctac tgctgcctcccgtaggagtctgggccgtgtctcagtcccagtgtggccgatcaccctctcaggtcggc tatgtatcgtcgcctaggtgagccattacctcacctactagctaatacaacgcaggtccatcttgtag tggaacaattgcccctttcaaataaatgacatgtgtcatccattgttatgcggtattagctatcgttt ccaatagttatcccccgctacaaggcaggttacctacgcgttactcacccgttcgcaactcatccaag aagagcaagctcctctcttcagc
68.嗜热链球菌jmcc0033的phes基因序列如下：
69.ctcatacaagtcctgtccaagctcgtacacttgataaacatgatttttctaaaggtcctcttaa gatgatctcaccaggacgtgttttccgtccgtgataccgatgatgcgactcacagccaccagtttcac caaatcgaaggtttggtcgttggtaaaaacatctcaatgggtgatctgaagggaacgcttgagatgat tattcaaaaaatgtttggtgcagaacgtcgaatccgtttgcgtccttcttacttcccattcactgaac cttccgttgaggttgacgtgtcatgcttcaagtgtggtggtaaaggatgtaacgtatgcaagaataca ggttggattgagatccttggtgctggtatggttcacccacaagtgcttgagatgtcaggtgttgattc tgaagaatattc；
70.发酵剂jlb-1510购自河北一然生物科技有限公司；
71.s3.召集专家级感官评价人员10人对酸奶a-d的香气进行评价；香气评价方法中，用10点强度标度法(10
→
0表示极强
→
察觉不到)进行标示；
72.s4.用气相色谱法分别对酸奶a-d中香味物质乙醛、双乙酰(2，3-丁二酮) 进行定量分析，分别取4ml酸奶a-d样品，置于四个离心管中，标记为离心管
ⅰ‑ⅳ
，将离心管
ⅰ‑ⅳ
置于转速为6000r/min的离心机中离心15min，分别取上清液，用孔径为0.22μm的微孔滤膜过滤后，得滤液
ⅰ‑ⅳ
，分别取1μl 的滤液
ⅰ‑ⅳ
进行气相色谱分析，结果如表3所示；
73.色谱条件为：
74.①
色谱柱：db-wax毛细管(0.25mm
×
30mm
×
0.25μm)；
75.②
升温条件：程序升温，初始温度为40℃，保持2min后，以3℃/min 的升温速率升温至100℃保持到结束；
76.③
fid检测器：温度为300℃，进样口温度为260℃；
77.④
载气：由空气、氢气和氮气以300∶30∶30的质量比混合而成，其中氮气流速为1.5ml/min，分流为50∶1；
78.⑤
乙醛和双乙酰的标准样品质量浓度均为25mg/l，利用气相色谱法测定乙醛标准样品和双乙酰标准样品的峰面积；通过计算公式计算出酸奶a-d中香气成分乙醛和双乙酰的质量浓度；
79.计算公式为ci＝(ai
÷
a0)
×
c0
80.式中：ci为样品中香气成分质量浓度；
81.ai为样品色谱峰面积；
82.a0表示标准样品色谱峰面积；
83.c0表示标准样品的外标浓度；
84.表3
[0085][0086]
乙醛是构成酸奶特征风味的物质之一,而双乙酰使发酵乳品具有奶油味，其产生的数量与柠檬酸盐代谢有关，乙醛和双乙酰的质量浓度不是越高越好,质量浓度及比例在一定范围时,才会得到比较好的感官评价，一般认为乙醛、双乙酰质量浓度比为0.3左右最佳，由表3可知，嗜热链球菌jmcc0031和嗜热链球菌jmcc0032发酵产生的酸奶中乙醛、双乙酰质量浓度比较接近0.3，同时嗜热链球菌jmcc0032产生的酸奶中乙醛和双乙酰含量明显高于其他菌株和发酵剂产生的酸奶；因此，嗜热链球菌jmcc0032具有改善酸奶香气效果。
[0087]
实施例6 嗜热链球菌jmcc0032对酸奶发酵和香气的影响
[0088]
本实施例为检测嗜热链球菌jmcc0032对酸奶发酵和香气影响的实验，具体实验方法如下：
[0089]
取活化后的jmcc0032菌株，按1
×
106cfu/ml的接种量接种于灭菌生牛乳，采用ph值在线监测的方式，对嗜热链球菌jmcc0032在灭菌乳中的ph值变化情况进行检测；
[0090]
以嗜热链球菌jmcc0033作为参照菌株，验证嗜热链球菌jmcc0032对于发酵菌株嗜热链球菌jmcc0033发酵特性的影响，结果如图1所示；
[0091]
由图1可知，嗜热链球菌jmcc0032单独发酵至ph＝4.5需要9h，发酵结束后ph为4.2，发酵速度较慢；通过对比嗜热链球菌jmcc0033单菌和组合发酵菌剂(嗜热链球菌jmcc0032与嗜热链球菌jmcc0033以1:1的生物量比例复配而成)的发酵曲线可以得知，嗜热
链球菌jmcc0032对嗜热链球菌jmcc0033的发酵速度没有明显的影响，且对最终ph没有显著影响，由此可知，嗜热链球菌 jmcc0032具有发酵速度慢、后酸弱，对其他菌株发酵不产生发酵影响的特性；
[0092]
其中，嗜热链球菌jmcc0033单菌和组合发酵菌剂中嗜热链球菌jmcc0033 的接种浓度均为1
×
107cfu/ml。
[0093]
实施例7 嗜热链球菌jmcc0032对发酵乳香气改善的效果检测
[0094]
本实施例为嗜热链球菌jmcc0032对发酵乳香气改善的效果检测，具体实验方法如下：
[0095]
s1.取70kg的生牛乳和4.9kg的白砂糖混合均匀，制得发酵基料，将发酵剂料平均分为3份，得发酵基料e、f、g；
[0096]
s2.分别向发酵基料e、f、g中依次接入复合发酵剂x(450mg嗜热链球菌 jmcc0031和150mg嗜热链球菌jmcc0032)、复合发酵剂y(450mg嗜热链球菌 jmcc0033和150mg嗜热链球菌jmcc0032)和复合发酵剂z(450mgjlb-1510和 150mg嗜热链球菌jmcc0032)，42℃条件下发酵5.5h，降温至4℃并放置24h，得酸奶e、f、g；
[0097]
s3.对酸奶e、f、g的香气进行综合检测，结果如表4所示；
[0098]
表4
[0099][0100]
由表4可知，单菌株嗜热链球菌jmcc0031、嗜热链球菌jmcc0033和发酵剂jlb-1510与嗜热链球菌jmcc0032的复配以后，发酵产生的酸奶中乙醛与双乙酰比值都较其单独发酵时更接近与0.3，感官评审中香气评分有所提高，因此，嗜热链球菌jmcc0032在不影响发酵乳后酸的情况下，可以提高发酵乳香气。