一种生防菌制剂及其应用

1.本发明属于生物农药技术领域，具体涉及一种含贝莱斯芽孢杆菌hab
‑
2的生防菌制剂、及其制备方法和应用。


背景技术：

2.植物真菌病害包括橡胶树炭疽病、番茄灰霉病、西瓜蔓枯病、水稻稻瘟病、芒果炭疽病、黄皮炭疽、香蕉叶斑病等，目前有关该病的防治主要采用化学药剂防治，然而过度用药不可避免地导致农药残留、病原菌抗药性以及环境污染等问题。根据中国农药信息网有关报道，截至2020年5月底，中国有效期内登记在案的农药41614种中，微生物农药仅登记47种，实际登记产品数量434个，仅占总农药产品的2.9％。由此可知，生物农药的研究与开发潜力巨大。
3.生物农药是利用有益微生物杀死或降低病原生物的数量以控制植物病害发生、发展。土壤为微生物的生存提供了良好的环境，大量具有相互拮抗作用的微生物生存在土壤中。植物与微生物之间存在着密切的相互作用关系，拮抗微生物被筛选出来接种后，在植株根表面有很好的定殖能力。因此，从植物根表面或根圈土壤中筛选生防菌株已经成为生防菌株筛选的研究重点。
4.芽孢杆菌类中解淀粉芽孢杆菌是生防菌的一个重要类群。解淀粉芽孢杆菌前期分为两个亚种，其一为bacillus amyloliquefaciens subsp.amyloliquefaciens，以模式菌株dsm7为代表，其二为b.amyloliquefaciens subsp.plantarum，以模式菌株fzb42为代表。2016年dunlap等发文认为b.amyloliquefaciens subsp.plantarum和b.velezensis被视为异型同义词。后来，解淀粉芽孢杆菌的类群进一步细化为三种，第一，解淀粉芽孢杆菌(b.amyloliquefaciens)，主要能够生产工业酶，包括淀粉酶，葡聚糖酶和蛋白酶等；第二，暹罗芽孢杆菌(b.siamensis)，主要在亚洲的一些食物中发现；第三，贝莱斯芽孢杆菌(b.velezensis)，主要作为生防菌株用于植物保护。其中贝莱斯芽孢杆菌(b.velezensis)由于其强大的抑制植物病原菌的能力，成为芽孢杆菌属中应用最广泛的商业生防制剂。
5.20世纪50年代gutter等人首次报道了一株枯草芽孢杆菌对引起柑橘的多种真菌病害有很强的抑制作用，由此打开了芽孢杆菌作为生物防治的局面。由于芽孢杆菌具有抑制病原菌、促进植物生长、诱导产生植物抗性等特性，引起了国内外众多科研团队的关注。
6.解淀粉芽孢杆菌大多数特性与其他芽孢杆菌相似，但也有其独特的特点并且用途十分广泛，可以生产多种酶类、核苷类等抗菌物质。国内外很多学者都在探究解淀粉芽孢杆菌在生防中的作用及其作用机制。例如德国abitep gmbh公司将模式菌株解淀粉芽孢杆菌fzb42作为植物生长促进剂，该菌株不仅促进植物生长，还对多种病原真菌有很好的防治效果。
7.但是解淀粉芽孢杆菌在生防应用的过程中，发现存在很多问题，芽孢杆菌定殖在土壤中活性下降，土壤中受到诸多因素的影响达不到人们的预期效果，在野生环境下难以维持种群的数量等一系列问题。因此单独采用解淀粉芽孢杆菌作为生防菌剂，实际应用时
活性保持时间较短，不利于工业上的大规模生产和应用。


技术实现要素：

8.针对现有技术的以上缺陷或改进需求中的一种或者多种，本发明提供了一种生防菌制剂、其制备方法及应用，对植物真菌病害具有较好的抑制作用，且环境友好、无毒害。
9.为实现上述目的，按照本发明的第一个方面，提供一种生防菌制剂，采用贝莱斯芽孢杆菌hab
‑
2制备得到，所述贝莱斯芽孢杆菌hab
‑
2，于2015年1月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为cctcc no:m2015070。
10.作为本发明的进一步改进，采用的贝莱斯芽孢杆菌hab
‑
2，其液体培养后的总活菌数≥5
×
107cfu/ml。
11.作为本发明的进一步改进，该生防菌制剂还包括纳他霉素、玉米醇溶蛋白、山梨酸及辅料。
12.作为本发明的进一步改进，所述辅料包括丙三醇、吐温20、农乳500
#
的一种或多种。
13.作为本发明的进一步改进，所述纳他霉素、玉米醇溶蛋白、山梨酸及辅料的含量为：
14.纳他霉素8
‑
10wt％
15.玉米醇溶蛋白1.0
‑
1.2wt％
16.山梨酸4
‑
5wt％
17.丙三醇3wt％
18.吐温20 2.5wt％
19.农乳500
#
3.5wt％。
20.所述生防菌制剂通过将贝莱斯芽孢杆菌hab
‑
2菌液、纳他霉素、玉米醇溶蛋白和山梨酸混匀得到，优选在室温保存。
21.按照本发明的第二个方面，提供一种生防菌制剂的制备方法，包括如下步骤：
22.采用lb液体培养基制备贝莱斯芽孢杆菌hab
‑
2菌液；
23.将贝莱斯芽孢杆菌hab
‑
2菌液与适量纳他霉素、玉米醇溶蛋白、山梨酸、丙三醇、吐温以及农乳500
#
混合，即制备得到所述生防菌制剂。
24.作为本发明的进一步改进，所述lb液体培养基的制备方法为：取胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，nacl10g，溶解后，用5mol/lnaoh调ph至7.0，用去离子水定容至1l，在15psi高压下蒸汽灭菌20min。
25.作为本发明的进一步改进，所述贝莱斯芽孢杆菌hab
‑
2菌液中，总活菌数≥5
×
107cfu/ml。
26.作为本发明的进一步改进，所述纳他霉素、玉米醇溶蛋白、山梨酸、丙三醇、吐温以及农乳500
#
的含量为：
27.纳他霉素8
‑
10wt％
28.玉米醇溶蛋白1.0
‑
1.2wt％
29.山梨酸4
‑
5wt
30.丙三醇3wt％
31.吐温20 2.5wt％
32.农乳500
#
3.5wt％。
33.按照本发明的第三个方面，提供一种所述的生防菌制剂在防治植物真菌病害中的应用，应用方法为：将所述生防菌制剂稀释500～900倍对发病初期的植物进行喷雾，喷施药液量为60l/亩～120l/亩。
34.总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：
35.本发明的生防菌制剂，含贝莱斯芽孢杆菌hab
‑
2、纳他霉素、玉米醇溶蛋白和山梨酸，应用范围广泛，其作为杀菌剂可对土壤中导致土传病害的病原菌如尖孢镰刀菌、丝核菌、黄萎轮枝孢，对引发作物常见病害的病原菌如橡胶树炭疽病菌、番茄灰霉病菌、西瓜蔓枯病菌、水稻稻瘟病菌、芒果炭疽病菌、黄皮炭疽菌、香蕉叶斑病菌等有显著的杀菌效果。
36.本发明的生防菌制剂，其有效成分属于不同作用机理的活性成分，协同作用下对植物真菌病害防效更好，且各组分均属于绿色的、环境友好的、无毒害的、兼有药效功能的活性成分。
37.本发明杀菌剂通常采用喷雾的方法，当然也可根据农业实际生产需要采取其他实用技术。
具体实施方式
38.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
39.本发明的生防菌制剂，采用贝莱斯芽孢杆菌hab
‑
2制备得到，贝莱斯芽孢杆菌hab
‑
2，于2015年1月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为cctcc no:m 2015070。采用的贝莱斯芽孢杆菌hab
‑
2，其液体培养后的总活菌数≥5
×
107cfu/ml。
40.进一步地，本发明的生防菌制剂还包括纳他霉素、玉米醇溶蛋白、山梨酸和辅料。其中辅料包括丙三醇、吐温20、农乳500
#
的一种或多种，并且按重量份计，各组份的含量为：纳他霉素8
‑
10wt％、玉米醇溶蛋白1.0
‑
1.2wt％、山梨酸4
‑
5wt％、丙三醇3wt％、吐温20为2.5wt％、农乳500
#
为3.5wt％。
41.另外，贝莱斯芽孢杆菌hab
‑
2通过lb液体培养基制备得到，纳他霉素为市售，有效含量为≥95％；玉米醇溶蛋白为市售，其有效含量为≥99.7％，山梨酸为市售，其有效含量为≥99％。
42.需要说明的是，贝莱斯芽孢杆菌hab
‑
2，前期鉴定认为是解淀粉芽孢杆菌，后来由于多个菌株的基因组分析及分子生物学技术的发展，归类为贝莱斯芽孢杆菌。菌种保藏编号为cctcc no:m 2015070。
43.纳他霉素是一种由恰塔努加链霉菌、纳塔尔链霉菌和褐黄孢链霉菌等链霉菌经过深层发酵产生的多烯大环内酯物。是一种无臭、无味、低剂量且安全性高的食品防腐剂，在《国家食品安全使用标准》gb2760
–
2014中有11个食品类别应用，防腐防霉效果十分显著，在食品、药品等方面具有良好的应用前景。其作用机理为：依靠其内酯环结构与真菌细胞膜上
的甾醇化合物作用，形成抗生素—甾醇化合物，从而破坏真菌的细胞质膜的结构。大环内脂的亲水部分(多醇部分)在膜上形成水孔，损伤细胞膜通透性，进而引起菌内氨基酸，电解质等物质渗出，菌体死亡。当某些微生物细胞膜上不存在甾醇化合物时，纳他霉素就对其无作用，因此纳他霉素只对真菌产生抑制，对细菌和病毒不产生抗菌活性。
44.玉米醇溶蛋白(zein)是玉米胚乳中的一种贮藏蛋白质，约占胚乳总蛋白质的35
‑
60％。作为醇溶类蛋白质zein中约有50％的非极性疏水氨基酸，包括亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、缬氨酸，这使其具有独特的溶解性，它可以溶解于一些非极性溶剂中，比如一定浓度的低级脂肪醇、高浓度的尿素、火碱溶液等溶剂中，但不溶于水，这使得zein在药物运载体系及生物活性物质方面有天然的优势。zein作为一种安全、绿色的食品材料，因为其独特的溶解性，可以利用反溶剂将溶解在醇中的zein以纳米颗粒的方式析出。将疏水性药物或营养素包埋于zein纳米颗粒中，以提高营养的生物利用率，保证食品的稳定性，提高药物在运输方面的价值。由于纳他霉素易光解，虽然具有较好的防腐效果，但是稳定性不佳，本发明采用玉米醇溶蛋白米颗粒包埋纳他霉素，能够提高纳他霉素水分散性和光稳定性，避免在田间应用时，因光照的原因降低纳他霉素的防效。
45.山梨酸是一种食品添加剂，对酵母、霉菌等许多真菌都具有抑制作用，在贝莱斯芽孢杆菌和纳他霉素的基础上，本发明添加山梨能够进一步增强生防菌制剂的防腐作用，并且保持贝莱斯芽孢杆菌的长效性。
46.本发明将贝莱斯芽孢杆菌hab
‑
2和纳他霉素组合物用于植物真菌病害防治农药技术领域，并与玉米醇溶蛋白、山梨酸一定比例混合共同使用，相比于现有技术，解决了单独使用芽孢杆菌作为生防菌制剂活性持久性较差的问题，适用于大规模的生产和工业化的应用。
47.本发明的生防菌制剂的制备方法，包括如下步骤：
48.(1)采用lb液体培养基制备贝莱斯芽孢杆菌hab
‑
2菌液；
49.(2)将贝莱斯芽孢杆菌hab
‑
2菌液与适量纳他霉素、玉米醇溶蛋白、山梨酸、丙三醇、吐温以及农乳500
#
混合，即制备得到所述生防菌制剂。
50.步骤(1)中，贝莱斯芽孢杆菌hab
‑
2菌液采用lb液体培养基进行摇床培养，lb液体培养基的制备方法为：取胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，nacl10g，溶解后，用5mol/lnaoh调ph至7.0，用去离子水定容至1l，在15psi高压下蒸汽灭菌20min。贝莱斯芽孢杆菌hab
‑
2在lb液体培养基中震荡培养，28℃、180
‑
200r/min恒温震荡培养24h，使贝莱斯芽孢杆菌hab
‑
2的总活菌数≥5
×
107cfu/ml。
51.步骤(2)中，将贝莱斯芽孢杆菌hab
‑
2菌液与适量纳他霉素、玉米醇溶蛋白、山梨酸、丙三醇、吐温以及农乳500
#
混合，贝莱斯芽孢杆菌hab
‑
2菌液中的总活菌数≥5
×
107cfu/ml，其他各组份的含量为：纳他霉素8
‑
10wt％、玉米醇溶蛋白1.0
‑
1.2wt％、山梨酸4
‑
5wt％、丙三醇3wt％、吐温20 2.5wt％、农乳500
#
3.5wt％、余量为水。
52.为更好的理解本发明的生防菌制剂及其制备方法，提供如下具体实施例；实施例1
53.本实施例的生防菌制剂，按1000ml计算，含有700ml总活菌数≥5
×
107cfu/ml的贝莱斯芽孢杆菌hab
‑
2培养物、80g纳他霉素(以纯的纳他霉素计算)、10g玉米醇溶蛋白(以纯的玉米醇溶蛋白计算)、40g山梨酸(以纯的山梨酸计算)、30g的丙三醇、25g的吐温20、35g的农乳500
#
，余量为水；
54.本实施例的生防菌制剂的制备方法，包括如下步骤：
55.(1)采用lb液体培养基制备贝莱斯芽孢杆菌hab
‑
2菌液；
56.将胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，nacl10g，溶解后，用5mol/lnaoh调ph至7.0，用去离子水定容至1l，在15psi高压下蒸汽灭菌20min。贝莱斯芽孢杆菌hab
‑
2在lb液体培养基中震荡培养，28℃、180
‑
200r/min恒温震荡培养24h，使菌液中贝莱斯芽孢杆菌hab
‑
2的总活菌数≥5
×
107cfu/ml。
57.(2)将700ml总活菌数≥5
×
107cfu/ml的贝莱斯芽孢杆菌hab
‑
2培养物、80g纳他霉素(以纯的纳他霉素计算)、10g玉米醇溶蛋白(以纯的玉米醇溶蛋白计算)、40g山梨酸(以纯的山梨酸计算)、30g的丙三醇、25g的吐温20、35g的农乳500
#
均匀混合，补充灭菌水定容到1000ml。
58.实施例2
59.本实施例的生防菌制剂，按1000ml计算，含有700ml总活菌数≥5
×
107cfu/ml的贝莱斯芽孢杆菌hab
‑
2培养物、90g纳他霉素(以纯的纳他霉素计算)、11g玉米醇溶蛋白(以纯的玉米醇溶蛋白计算)、45g山梨酸(以纯的山梨酸计算)、30g的丙三醇、25g的吐温20、35g的农乳500
#
，余量为水；
60.本实施例的生防菌制剂的制备方法，包括如下步骤：
61.(1)采用lb液体培养基制备贝莱斯芽孢杆菌hab
‑
2菌液，
62.将胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，nacl10g，溶解后，用5mol/lnaoh调ph至7.0，用去离子水定容至1l，在15psi高压下蒸汽灭菌20min。贝莱斯芽孢杆菌hab
‑
2在lb液体培养基中震荡培养，28℃、180
‑
200r/min恒温震荡培养24h，使菌液中贝莱斯芽孢杆菌hab
‑
2的总活菌数≥5
×
107cfu/ml。
63.(2)将700ml总活菌数≥5
×
107cfu/ml的贝莱斯芽孢杆菌hab
‑
2培养物、90g纳他霉素(以纯的纳他霉素计算)、11g玉米醇溶蛋白(以纯的玉米醇溶蛋白计算)、45g山梨酸(以纯的山梨酸计算)、30g的丙三醇、25g的吐温20、35g的农乳500
#
均匀混合，补充灭菌水定容到1000ml。
64.实施例3
65.本实施例的生防菌制剂，按1000ml计算，含有700ml总活菌数≥5
×
107cfu/ml的贝莱斯芽孢杆菌hab
‑
2培养物、100g纳他霉素(以纯的纳他霉素计算)、12g玉米醇溶蛋白(以纯的玉米醇溶蛋白计算)、50g山梨酸(以纯的山梨酸计算)、30g的丙三醇、25g的吐温20、35g的农乳500
#
，余量为水；
66.本实施例的生防菌制剂的制备方法，包括如下步骤：
67.(1)采用lb液体培养基制备贝莱斯芽孢杆菌hab
‑
2菌液，
68.将胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，nacl10g，溶解后，用5mol/lnaoh调ph至7.0，用去离子水定容至1l，在15psi高压下蒸汽灭菌20min。贝莱斯芽孢杆菌hab
‑
2在lb液体培养基中震荡培养，28℃、180
‑
200r/min恒温震荡培养24h，使菌液中贝莱斯芽孢杆菌hab
‑
2的总活菌数≥5
×
107cfu/ml。
69.(2)将700ml总活菌数≥5
×
107cfu/ml的贝莱斯芽孢杆菌hab
‑
2培养物、90g纳他霉素(以纯的纳他霉素计算)、11g玉米醇溶蛋白(以纯的玉米醇溶蛋白计算)、45g山梨酸(以纯的山梨酸计算)、30g的丙三醇、25g的吐温20、35g的农乳500
#
均匀混合，补充灭菌水定容到
1000ml。
70.上述实施例以橡胶树炭疽病菌为靶标的抑制效果测定如下：
71.将pda培养基于高压蒸汽灭菌锅中121℃灭菌20min后取出，在培养皿中分别加入不同质量浓度3种实施组合物和pda培养基充分混匀，使每个平板培养基中3种实施组合物溶液的浓度分别为0、50、100、200、400、600μl/l，备用。从用pda培养基培养7d的橡胶树炭疽菌菌落边缘取直径为4mm的菌饼，将菌饼分别接种于平板培养基正中央，每个平板接种一个菌饼，菌丝面朝下，28℃培养箱中培养7d。每组重复4次。以10％纳他霉素(以纯的纳他霉素计算)0、50、100、200、400、600μl/l和5％山梨酸(以纯的山梨酸计算)0、50、100、200、400、600μl/l作对照，以浓度的对数值作为横坐标，菌丝体生长抑制率为纵坐标，计算3种实施组合物对橡胶树炭疽菌菌丝体生长的毒力方程和半最大效应浓度ec
50
。
72.菌落增长直径(mm)＝测量菌落平均值
–
菌饼直径
[0073][0074]
表1纳他霉素和山梨酸及3种混剂对橡胶树炭疽病菌的室内毒力测定结果
[0075][0076]
根据表1的测定结果，本发明实施例1至实施例3的生防菌制剂半最大效应浓度ec
50
均小于对照组纳他霉素和山梨酸；因此以橡胶树炭疽病菌为靶标，与单独的纳他霉素或山梨酸相比，本发明的生防菌制剂抑制效果较好，其中实施例3的抑制效果最佳，为本发明优选配方。
[0077]
进一步地，本发明的微生物生防菌制剂在田间具体实施应用如下：
[0078]
应用实施例1
[0079]
本实施例为本发明的防菌制剂在防治橡胶树炭疽病方面的应用。
[0080]
本试验安排在海南省儋州市海南大学植物保护学院试验基地，试用地为平地块，土壤为沙土。栽培管理按照农药田间药效试验统一进行规范。
[0081]
(1)供试材料
[0082]
药剂：应用实施例3组合物的可溶液剂。对照药剂为250g/l吡唑醚菌酯乳油，稀释700倍液使用，喷清水为空白对照。
[0083]
病原物：橡胶树炭疽病(colleetotrichum gloeosporioides)
[0084]
寄主植物：橡胶树
[0085]
(2)试验方法
[0086]
试验小区面积为40平方米，四次重复。于橡胶树炭疽病发病初期(零星发病时)第一次兑水喷雾，连喷2次，间隔5
‑
7天，喷施药液量为120l/亩。
[0087]
(3)调查方法
[0088]
每小区随机取样，每点调查4株，每株对称取中部2蓬叶，每蓬查顶端5片小叶，共计200片，记录调查各级病叶数，然后计算病情指数和防治效果。
[0089]
调查发病分级标准参照防治橡胶树炭疽病行业标准，分为7个级别：
[0090]
0级：无病斑；
[0091]
1级：0＜病斑面积占整个叶面积＜1/16；
[0092]
2级：1/16≤病斑面积占整个叶面积≤1/8；
[0093]
3级：1/8≤病斑面积占整个叶面积≤1/4；
[0094]
4级：1/4≤病斑面积占整个叶面积＜1/2；
[0095]
5级：1/2＜病斑面积占整个叶面积＜3/4；
[0096]
6级：病斑面积占整个叶面积的≥3/4，或叶片畸形，落叶。
[0097]
(4)药效计算方法
[0098][0099][0100]
(5)试验结果
[0101]
各处理变化病情指数和防效如下：
[0102][0103][0104]
应用实施例2
[0105]
本实施例为本发明的防菌制剂在防治番茄灰霉病方面的应用。
[0106]
试验在海南省海口市海南大学农科试验基地进行。试验地土壤为红土，肥力中等，排灌良好。栽培管理按照农药田间药效试验统一进行规范。
[0107]
(1)供试材料
[0108]
药剂：应用实施例3的可溶液剂。对照药剂为250g/l吡唑醚菌酯乳油，稀释700倍液使用，喷清水为空白对照。
[0109]
病原物：番茄灰霉病(botrytis cinerea pers)
[0110]
寄主植物：番茄
[0111]
(2)试验方法
[0112]
试验小区面积为30平方米，四次重复。在番茄定植缓苗后或发病初期常规兑水喷雾，连喷2次，间隔5
‑
7天，喷施药液量为60l/亩。
[0113]
(3)调查方法
[0114]
每小区采用五点取样，每点调查2株，调查每株的全部叶片，计算发病率，并根据以下分级方法分别予以记录。
[0115]
调查发病分级标准参照防治番茄灰霉病行业标准，分为6个级别：
[0116]
0级：无病斑；
[0117]
1级：单叶片有病斑3个；
[0118]
3级：单叶片有病斑4～6个；
[0119]
5级：单叶片有病斑7～10个；
[0120]
7级：单叶片有病斑11～20个，部分密集成片；
[0121]
9级：单叶片有病斑密集占叶面积四分之一以上。
[0122]
(4)药效计算方法
[0123][0124][0125]
(5)试验结果
[0126]
各处理变化病情指数和防效如下
[0127][0128]
应用实施例3
[0129]
本实施例为本发明的防菌制剂在防治香蕉叶斑病方面的应用。
[0130]
试验在海南省儋州市海南大学儋州校区实验基地香蕉地进行。试验地土壤为沙壤土，肥力中等，排灌良好。栽培管理按照农药田间药效试验统一进行规范。
[0131]
(1)供试材料
[0132]
药剂：应用实施例3的可溶液剂。对照药剂为250g/l吡唑醚菌酯乳油，稀释700倍液使用，喷清水为空白对照。
[0133]
病原物：香蕉叶斑病(cercosporam usae spp.)
[0134]
寄主植物：香蕉
[0135]
(2)试验方法
[0136]
试验小区面积为50平方米，四次重复。于香蕉叶斑病发病初期开始施药，兑水喷雾，连喷2次，间隔5
‑
7天，喷施药液量为90l/亩。
[0137]
(3)调查方法
[0138]
根据香蕉叶片为害症状程度分级，以株为单位，每小区随机调查2株
‑
3株，每株香蕉从顶叶往下调查5片
‑
13片叶(未打开心叶不计)，具体视生育期而定，营养生长期至抽蓄期可调查8片
‑
13片叶，挂果期可调查5片
‑
10片叶，记录调查的总叶数、各级病叶数。
[0139]
调查发病分级标准参照防治芒果炭疽病行业标准，分为6个级别：
[0140]
0级：全株无病；
[0141]
1级：病斑面积占整个叶片面积的5％以下；
[0142]
3级：病斑面积占整个叶片面积的6％
‑
15％；
[0143]
5级：病斑面积占整个叶片面积的16％
‑
25％；
[0144]
7级：病斑面积占整个叶片面积的26％
‑
50％；
[0145]
9级：病斑面积占整个叶片面积的51％以上。
[0146]
(4)药效计算方法
[0147][0148][0149]
(5)试验结果
[0150]
各处理变化病情指数和防效如下
[0151][0152][0153]
结合以上应用实施例1至3的试验结果，本发明的生防菌制剂，在应用时，稀释500
至900倍均能达到较好的防治效果。
[0154]
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。