一种钩吻生物碱化合物及制备和应用及产品

本发明涉及中药新药发现，更具体而言，涉及一种具有阿片受体和毒蕈碱受体双靶点活性的钩吻生物碱二氢钩吻素子(dihydrokoumine，dk)的制备方法和用于治疗疼痛等神经系统疾病药物中的用途。

背景技术：

1、疼痛是许多疾病的症状，是机体受到不良刺激或损害的一种反应，可使机体免受损害。但剧烈的疼痛如严重外伤或癌症晚期疼痛等，不仅给人造成巨大痛苦，还会导致严重的生理功能紊乱，甚至休克和死亡。因此，为了提高患者生活质量，合理应用镇痛药物必不可少。阿片受体激动剂是强效镇痛药物研究的主流方向，但此类化合物具有成瘾性、耐药性、呼吸抑制、恶心、便秘等一系列不良反应。因此，发展副作用小的镇痛药物具有重要的研究意义。

2、多靶点协同是发展副作用小的镇痛药物的重要方法，如mu/nop的协同(b.spagnolo et al.,activities of mixed nop and mu-opioid receptor ligands,br.j.pharmacol.,153,2008,609-619)。目前研究表明m3毒蕈碱型乙酰胆碱受体可促进吗啡介导的mu阿片受体的内吞作用，m3受体拮抗剂可缓解阿片药物戒断症状，可抑制阿片成瘾(j.f.lopez-gimenez et al.,m3 muscarinic acetylcholine receptor facilitatesthe endocytosis of mu opioid receptor mediated by morphine independently ofthe formation of heteromeric complexes,cell.signal.,35,2017,208-222)。上市药物曲马多兼具mu激动和m拮抗性质(k.minami et al.,what is the main mechanism oftramadol？naunyn schmiedebergs.arch.of pharmacol,388,2015,999-1007)，其与典型的阿片药物相比无抑制呼吸作用、依赖性小，且镇痛作用显著。因此发现mu激动和m拮抗双靶点活性分子有望产生高效低副作用的镇痛分子。

3、天然产物是多靶点药物的重要来源，钩吻在传统药用治疗中作为重要的镇痛药物得到广泛使用。钩吻主要包含的化合物类型为吲哚类的生物碱(g.l.jin et al.,medicinal plants of the genus gelsemium(gelsemiaceae,gentianales)--a reviewof their phytochemistry,pharmacology,toxicology and traditional use,jethnopharmacol.,152,2014,33-52)，与目前发现的mu受体的激动剂在结构上有很大的差异，是一类非常好的天然骨架分子。文献报道钩吻生物碱钩吻碱甲的镇痛通路为中枢神经系统甘氨酸受体-四氢孕酮镇痛通路(j.y.zhang et al.,gelsemium analgesia and thespinal glycine receptor/allopregnanolone pathway,fitoterapia,100,2015,35-43)，目前没有阿片受体活性相关的研究；动物实验表明钩吻生物碱无吗啡类镇痛药物的耐受性等副作用(j.y.zhang et al.,gelsemium analgesia and the spinal glycinereceptor/allopregnanolone pathway,fitoterapia,100,2015,35-43)。我们前期的研究中发现钩吻总生物碱具有mu受体激动活性，因此钩吻生物碱分子在镇痛活性方面非常具有研究潜力。在此前工作中，从钩吻植物中分离纯化得到dk的制备方法已申请发明专利(专利号：202011404652.3)。尚未有报道涉及该化合物的化学合成方法，且未发现dk的阿片受体和毒蕈碱受体相关活性及镇痛应用的报道。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种具有阿片受体mu亚型激动活性和毒蕈碱受体m3亚型拮抗活性的化合物及其制备方法与应用。具体地，本发明的目的之一是提供具有mu激动和m3拮抗双靶点活性的化合物为二氢钩吻素子(dihydrokoumine，dk)，其结构式如式ⅰ所示；本发明的目的之二是提供通过钩吻素子半合成得到化合物dk的方法；本发明的目的之三是提供化合物dk的应用，即通过体外细胞实验得到其对mu受体和m受体的作用活性，以及结合动物实验得到化合物dk的镇痛应用，为后续的药物开发提供基础。

2、

3、化合物名称为二氢钩吻素子(dihydrokoumine)，白色粉末，分子式c20h24n2o，分子量308.43。

4、本发明制备化合物dk的方法包括以下两步：

5、1)0.1-10g钩吻素子中加入5-200ml thf搅拌溶解，冰水浴冷却，分批加入0.1-5glialh4，升至室温搅拌0.5-5h；

6、2)步骤1)中的反应溶液加0.5-50ml水淬灭，继续加0.5-50ml 5-30％氢氧化钠和0.5-50ml水，过滤除去固体物质，滤液采用乙酸乙酯萃取2-5次，合并有机相并采用饱和氯化钠洗涤，无水硫酸钠干燥浓缩制沙柱层析纯化，使用二氯甲烷上样、二氯甲烷/甲醇进行洗脱(体积比为20/1-5/1)，产物干燥后即得固体产物。

7、本发明化合物dk的应用具体体现在具有mu受体激动和m3受体拮抗的双靶点活性，且具有受体选择性。进一步的应用体现在，该化合物在小鼠热板实验和福尔马林测痛实验中均体现了较好的镇痛效果，且无明显耐药性以及镇静催眠等副作用、并且急性毒性实验表明其安全性良好，口服利用度和血脑屏障透过性均较为理想。此分子的发现为mu激动和m3拮抗双靶点镇痛药物分子的研发提供了候选分子。

8、本发明的有益效果

9、本发明公开了一种钩吻生物碱化合物二氢钩吻素子，具有mu受体激动和m受体拮抗的双靶点活性、并且具有受体选择性；此外，该化合物具有较高且长效的镇痛作用，副作用少且毒性低，具有较好的口服生物利用度和较高的血脑屏障透过率。本发明化合物在炎症性疼痛、急性疼痛、慢性疼痛、癌性疼痛和神经性疼痛等各种疼痛相关疾病的治疗中具有较好的开发前景。

10、说明附图

11、图1显示dk的高分辨质谱图、核磁共振氢谱图和核磁共振碳谱图

12、图2显示dk对mu受体和m3受体的作用。(a)在mu阿片受体上的激动作用；(b)在m3受体上的拮抗作用。

13、图3显示dk的受体选择性。分别为dk在阿片受体delta、kappa和nop三个亚型上的活性测定及在d1、d2、5-ht2a、α2a、β2、cb1、gpr35和h1等gpcr受体上的活性测定。

14、图4显示dk在小鼠热板实验中镇痛作用效果和持续时间。

15、图5显示dk在小鼠福尔马林测痛实验中的镇痛效果。(a)福尔马林实验中，不同浓度dk给药下小鼠舔足时间随时间的变化；(b)福尔马林实验中，不同浓度dk条件给药下第i相(0-10min)和第ii相(10-40min)内的累计舔足时间。

16、图6显示dk的副作用评价。(a)dk在热板实验中的耐药性；(b)dk在转棒实验中对自主运动的影响。

17、图7显示dk的小鼠急毒毒性测试结果。分别为腹腔注射dk后小鼠体重的变化情况、进食量的变化情况，以及处死后小鼠心肝脾肺肾的质量系数情况。

18、图8显示dk的药代动力学参数评价。分别为口服灌胃dk后，大鼠血液中dk的药时曲线；静脉注射dk后，大鼠血液中dk的药时曲线；腹腔注射给药后，小鼠血液中和脑组织中dk的药时曲线。