一种预测自然杀伤细胞纯度的方法和系统与流程

1.本发明属于生物医学领域，具体涉及一种预测自然杀伤细胞纯度的方法和系统。


背景技术：

2.自然杀伤细胞(natural killer cell，nk细胞)是先天免疫系统的淋巴细胞，细胞表面含有一系列抑制性受体(cd94/nkg2a)、激活受体(如nkg2d)和天然细胞毒性受体(如nkp46、nkp44和nkp30)，因此nk细胞无需提前致敏，通过表面受体即可识别并杀伤病变细胞。20年前，nk细胞介导的免疫疗法在晚期白血病患者身上获得了治疗性的突破后，以nk细胞为基础的癌症治疗领域迅速发展。
3.基于nk细胞的免疫疗法包括nk细胞过继免疫治疗，免疫检查点抑制剂的使用以及car修饰nk细胞的应用等。这些免疫疗法通过提高nk细胞在肿瘤微环境中的数量以及靶向杀伤肿瘤细胞的能力，为肿瘤治疗提供了更多的治疗策略。其中，nk细胞过继免疫治疗是通过将体外激活的nk细胞回输人体，利用nk细胞能够快速识别和杀伤肿瘤细胞的能力，从而达到消灭肿瘤的目的。
4.nk细胞的体外培养包括饲养层培养法和因子激活法。饲养层培养法最常采用异体来源的修饰表达膜结合il-15，il-21的k562白血病供体细胞系与nk细胞共培养，达到体外扩增nk细胞的目的。虽然其扩增nk细胞的作用十分显著，但是k562细胞作为异源性的细胞，输入人体后存在一定的安全隐患。体外因子刺激培养法是使用添加il2和il15等细胞因子的培养基激活扩增nk细胞，具有很高的安全性，但这种单次培养和回输是十分昂贵和耗时的。
5.为了保证nk细胞回输的安全性，目前最常用体外因子刺激法培养nk细胞。但由于个体差异的存在，体外培养得到的nk也存在较大的纯度差异，nk细胞纯度高时可达99％，低时不到1％。而大量的高纯度、高活性的nk细胞是其用于临床回输治疗肿瘤的关键因素。因此，开发一种方法，用于nk细胞体外培养纯度预测，具有十分重要的意义。


技术实现要素：

6.本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种预测自然杀伤细胞纯度的方法，能够通过简单的指标测定和预测模型得到体外培养自然杀伤细胞的纯度预测。
7.本发明还提出一种预测自然杀伤细胞纯度的系统。
8.根据本发明的一个方面，提出了一种预测自然杀伤细胞纯度的方法，所述自然杀伤细胞通过对目标对象外周血进行体外培养获得，所述方法包括以下步骤：
9.获取所述目标对象外周血的红细胞分布宽度标准差；
10.基于所述自然杀伤细胞纯度与所述红细胞分布宽度标准差之间的预测关系，确定所述自然杀伤细胞纯度。
11.根据本发明的一种优选的实施方式，至少具有以下有益效果：该方法通过获得简
单测定的指标，即红细胞分布宽度标准差，可以有效预测目标对象进行体外nk细胞培养后的nk细胞纯度，可以在培养前有效判断nk细胞培养的效果，判断对目标对象进行nk细胞培养的可行性，减少临床上的无效nk细胞培养造成的浪费和损失。
12.在本发明中，所述目标对象主要指人，特别是需要进行体外nk细胞培养的患者。
13.在本发明的一些实施方式中，所述自然杀伤细胞纯度与所述红细胞分布宽度标准差之间的预测关系，包括以下预测关系式：预测指数＝-85.279+3.033
×
红细胞分布宽度标准差。
14.在本发明的一些优选的实施方式中，所述确定所述自然杀伤细胞纯度，包括通过所述预测指数判断所述自然杀伤细胞纯度的高或低：若预测指数大于45，判断所述自然杀伤细胞纯度高；若预测指数小于或等于45，判断所述自然杀伤细胞纯度低；其中，所述自然杀伤细胞纯度高是指纯度大于45％；所述自然杀伤细胞纯度低是指纯度小于或等于45％。
15.在本发明的一些实施方式中，所述自然杀伤细胞通过对目标对象外周血进行体外培养获得，包括采用因子刺激法培养得到所述自然杀伤细胞。
16.在本发明的一些优选的实施方式中，所述方法具体包括以下步骤：
17.s1、从所述目标对象外周血中分离制备单个核细胞悬液；
18.s2、向所述单个核细胞悬液中至少加入细胞因子il-2共同诱导培养。
19.在本发明中，自体或异体nk细胞用于移植，可从不同来源获得细胞：外周血单个核细胞(pbmc)、脐带血(ucb)、骨髓(bm)、诱导多能干细胞(ipsc)和细胞系等。
20.根据本发明的再一个方面，提出了一种预测自然杀伤细胞纯度的系统，所述自然杀伤细胞通过对目标对象外周血进行体外培养获得，所述系统包括：
21.检测模块，用于检测所述目标对象外周血的红细胞分布宽度标准差；
22.预测模块，用于基于所述自然杀伤细胞纯度与所述红细胞分布宽度标准差之间的预测关系，预测所述自然杀伤细胞纯度。
23.在本发明的一些实施方式中，所述自然杀伤细胞纯度与所述红细胞分布宽度标准差之间的预测关系，包括以下预测关系式：预测指数＝-85.279+3.033
×
红细胞分布宽度标准差。
24.在本发明的一些优选的实施方式中，所述预测所述自然杀伤细胞纯度，包括通过所述预测指数判断所述自然杀伤细胞纯度的高或低：若预测指数大于45，判断所述自然杀伤细胞纯度高；若预测指数小于或等于45，判断所述自然杀伤细胞纯度低；其中，所述自然杀伤细胞纯度高是指纯度大于45％；所述自然杀伤细胞纯度低是指纯度小于或等于45％。
附图说明
25.下面结合附图和实施例对本发明做进一步的说明，其中：
26.图1为本发明实施例1中pearson相关性检验的指数筛选结果图；
27.图2为本发明实施例1中“年龄”指标与“nk回输纯度”的散点分析图；
28.图3为本发明实施例1中“红细胞体积分布宽度”指标与“nk回输纯度”的散点分析图；
29.图4为本发明实施例1中“红细胞分布宽度标准差”指标与“nk回输纯度”的散点分析图；
30.图5为本发明实施例1中"三碘甲状腺原氨酸"指标与“nk回输纯度”的散点分析图；
31.图6为本发明实施例1中单因素模型回归曲线图；
32.图7为本发明实施例1中模型验证的roc曲线图；
33.图8为本发明实施例3中10位患者预测实验的roc曲线图。
具体实施方式
34.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
35.需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
36.下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，但不作为本发明的限定。
37.以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到的试剂和材料。
38.实施例1
39.本实施例为预测自然杀伤细胞纯度的方法的建立过程，通过以下实验及分析验证，获得预测模型。
40.1.实验及数据收集
41.实验方法：具体选取了2020年1月至2021年6月，在根本生物公司参与nk细胞体外培养的51例患者进行实验。其中，男性17例，女性34例；年龄36～69岁，平均年龄53岁。在患者进行nk细胞体外培养前，我们对患者进行了血常规、尿常规、生化常规、凝血功能、淋巴细胞亚群、甲状腺功能、乙肝五项和肿瘤指标共138项指标的检测。按照gmp生产规范采用因子刺激法培养nk细胞，然后通过流式细胞术，对nk细胞进行cd3和cd56分子的检测，通过分析cd3-cd56+的细胞群占总细胞数的百分比，得到nk细胞纯度。其中筛出缺失值过多的三例患者，筛选去除含40％以上空值检查指标，最终得到48例患者和65个指标(含部分缺失值)。
42.上述nk细胞培养过程(按照gmp生产规范采用因子刺激法)，包括以下步骤：
43.1)采用灭菌的肝素钠管采集40-50ml的外周血。
44.2)在gmp车间，通过密度梯度离心法获取单个核细胞(pbmc)和自体血浆。
45.3)把自体血浆置于56℃水浴锅中，加热30分钟，然后置于4℃冰箱冷却20分钟，1200xg离心去掉下层沉淀，得到灭活的自体血浆。
46.4)将pbmc用生理盐水稀释后，400xg离心去上清，重复此操作2次，得到的pbmc细胞用含有10％自体血浆的激活培养基重悬，保证初始细胞密度为2x106/ml。激活培养基为添加nk cell induction reagent(catalog#t20202培养基)中alysnk-b reagent因子的alys505nk-ac(catalog#01600p02)。
47.5)培养0-7天，每隔两天，使用含有10％自体血浆的激活培养基半量补液。
48.6)培养8-14天，每隔两天，使用含有10％自体血浆的扩增培养基半量补液，扩增培养基为添加了il-2的alys505nk-ex(catalog#01400p10)。
49.7)培养第14天，流式检测nk细胞表面cd3和cd56分子的表达情况，通过计算cd3-cd56+的细胞占总细胞数的百分比，得到nk细胞的纯度。
50.2.指标相关性检测
51.2.1指标筛选
52.用pearson相关性检验，筛选与因变量“nk回输纯度”相关的自变量，筛选结果的部分数值如图1所示。
53.表1. 48名患者63项临床指标的单因素分析
54.[0055][0056]
选取pval《0.05的指标纳入后续模型构建，共选取4个指标，分别是“年龄”、“红细胞体积分布宽度”、“红细胞分布宽度标准差”和"三碘甲状腺原氨酸"。
[0057]
2.2指标相关性验证
[0058]
使用散点图分析“年龄”、“红细胞体积分布宽度”、“红细胞分布宽度标准差”和"三碘甲状腺原氨酸"四个指标与因变量“nk回输纯度”的关系，依次如图2至图5所示。图中“nk回输纯度”即表示nk细胞经体外培养后的纯度。
[0059]
3.构建模型并筛选变量
[0060]
3.1构建模型
[0061]
将影响nk细胞纯度的四个指标纳入多因素分析，建立多重线性模型formula＝nk细胞纯度～年龄+红细胞体积分布宽度+红细胞分布宽度标准差+三碘甲状腺原氨酸；使用r语言mass包stepaic函数进行逐步回归，筛选能够降低预测误差(即aic值最小)的模型，筛得模型所含变量为红细胞分布宽度标准差，并以此变量重新建立回归模型，最终建立模型nk index＝-85.279+3.033红细胞分布宽度标准差，pval《0.05。
[0062]
3.2建立回归线
[0063]
由于筛得变量为单因素，绘制因变量和自变量散点图，添加回归线，结果如图6所示。
[0064]
4.模型验证
[0065]
为检验模型对nk细胞纯度的预测价值，将因变量二值化，》45为nkpurity high，建立模型预测纯度对nk实际纯度高低的roc曲线，roc曲线如图7所示，求得auc值为0.69。说明模型对nk细胞纯度高低有预测作用。
[0066]
综上，在本实施例中，为了找到能够预测nk细胞纯度的相关指标，对48例患者进行分析，发现红细胞分布宽度标准差和nk细胞纯度之间的关系最紧密，最终建立了模型nk index＝-85.279+3.033
×
红细胞分布宽度标准差，并验证了此模型对nk细胞的纯度高低有预测作用。
[0067]
实施例2
[0068]
本实施例提供了一种预测自然杀伤细胞纯度的方法，具体过程为：
[0069]
1)通过对外周血检测获取所述目标对象外周血的红细胞分布宽度标准差；
[0070]
2)基于自然杀伤细胞纯度与红细胞分布宽度标准差之间的预测关系模型判断自然杀伤细胞纯度的高低，包括以下预测关系式：预测指数＝-85.279+3.033
×
红细胞分布宽度标准差；
[0071]
当预测指数大于45，判断所述自然杀伤细胞纯度高；
[0072]
当预测指数小于或等于45，判断所述自然杀伤细胞纯度低；
[0073]
其中，纯度高是指纯度大于45％；所述纯度低是指纯度小于或等于45％。
[0074]
实施例3
[0075]
本实施例提供了一种预测自然杀伤细胞纯度的系统，具体结构为：
[0076]
1)检测模块，用于检测所述目标对象外周血的红细胞分布宽度标准差；
[0077]
2)预测模块，用于基于所述自然杀伤细胞纯度与所述红细胞分布宽度标准差之间的预测关系，预测所述自然杀伤细胞纯度，包括以下预测模型：
[0078]
预测指数＝-85.279+3.033
×
红细胞分布宽度标准差；
[0079]
当预测指数大于45，判断所述自然杀伤细胞纯度高；
[0080]
当预测指数小于或等于45，判断所述自然杀伤细胞纯度低；
[0081]
其中，纯度高是指纯度大于45％；所述纯度低是指纯度小于或等于45％。
[0082]
将该系统应用于医院临床对患者的nk细胞培养纯度进行预测，实验共收集10位患者的信息，实验过程中患者的nk细胞培养过程和纯度检测过程等与本发明实施例1相同，建立模型预测纯度对nk实际纯度高低的roc曲线，roc曲线如图8所示，求得auc值为0.6。说明该预测方法及系统对nk细胞纯度高低有预测作用。
[0083]
综上所述，该预测方法和系统通过获得简单测定的指标，即红细胞分布宽度标准差，可以有效预测目标对象进行体外nk细胞培养后的nk细胞纯度，可以在培养前有效判断nk细胞培养的效果，判断对目标对象进行nk细胞培养的可行性，减少临床上的无效nk细胞培养造成的浪费和损失。
[0084]
上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。