一种与湖羊毛乳头细胞增殖相关的mirna标志物及其检测引物和应用
技术领域：
：1.本发明涉及一种与湖羊毛乳头细胞增殖相关的mirna标志物及其检测引物和应用，具体涉及mirna-143在湖羊花纹形成过程中的应用，属于畜牧兽医
技术领域：
：。
背景技术：
：：2.羊羔皮是绵羊羊羔出生35～40天左右宰杀取皮而得，底绒少，绒根清晰，不黏连，具有波浪形花弯。湖羊是我国特有的羔皮用绵羊品种，以生产呈水波状花纹的羔皮著称。湖羊所产的羔皮毛色洁白有弹性和光泽，皮板轻柔，波浪花纹扑而不散，深受大众喜爱。近年来，随着人们对湖羊肉用性能和繁殖性能的重视，以及大批量产区外来血统的引入，湖羊羔皮的波浪状花纹特性逐渐消失，羔皮的品质也逐渐变差。因此，科学地开展湖羊羔皮性状调控机制的研究具有重大意义。3.据了解，羊毛的弯曲度是决定湖羊羔皮品质的关键因素。毛乳头细胞是存在于毛囊基底部被毛母质细胞所包绕的特殊间质细胞，是毛囊生长发育的调控中心，毛乳头细胞增殖对毛囊生长和羊毛弯曲度具有重要作用。因此，研究湖羊毛乳头细胞增殖的调控机制有利于揭示毛囊发育与卷曲花纹羔皮形成的机制。4.mirnas是一类长度约为20-25bp非编码小分子rna，可通过与靶基因的3’utr区结合，引起mrna降解或转录抑制，进而影响基因表达。mirnas存在许多动物体内，是生长发育和疾病过程中的有效调控者，可以参与动物皮毛生长发育、毛囊周期、皮肤角质形成和细胞分化的过程，一般是通过与mrna的互补区结合，引起mrna降解或转录抑制，从而影响基因表达，进而影响动物的生长发育。5.经检索发现，高雯在《mir-148a和mir-10a的靶基因验证及在湖羊毛乳头细胞中的功能初步研究》中提出mir-148a和mir-10a对湖羊毛乳头细胞增殖以及与毛囊相关信号通路(tgf-β/smads通路)中部分基因(smad1,smad2,smad3,smad4,smad5,smad6,tgf-β1)具有影响。文章中仅是通过cck8实验验证了mir-148a/10a对毛乳头细胞的增殖，利用双荧光素酶实验验证mir-148a/10a与bmp7靶向关系，并没验证bmp7对毛乳头细胞增殖的功能。技术实现要素：6.为了克服现有技术的不足，本发明的目的包括但不限于提供一种与湖羊毛囊生长发育与毛发弯曲相关的mirna，该mirna作为检测真皮乳头细胞增殖相关的标志物。7.本发明另一个目的包括但不限于提供一种与湖羊毛乳头细胞增殖相关的mirna标志物及其检测引物和应用。该mirna标志物为mirna-143，用来检测湖羊真皮乳头细胞增殖情况。8.本发明另一个目的包括但不限于提供一种重组表达载体。9.为了实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：本发明提供一种与湖羊毛乳头细胞增殖相关的mirna标志物，所述mirna标志物为mirna-143，其核苷酸序列如seqidno.1所示。10.本发明通过对湖羊小花和直毛两种不同花纹羔皮毛囊进行高通量全转录组测序，筛选出与毛囊生长发育与毛发弯曲相关的mirna，再经过生物信息学差异表达分析初步选定在小花和直毛花纹羔皮差异表达方面差异倍数较大的mirna-143，其能通过靶向cux1基因调控湖羊毛乳头细胞增殖，抑制细胞增殖标记基因cdk2、pcna、cyclind1的mrna和蛋白表达，从而调控湖羊毛乳头细胞增殖，即湖羊花纹羔皮毛囊发育。该mirna在羔皮中呈现高表达，对研究湖羊羔皮性状的遗传本质及保护和利用湖羊羔皮种质资源具有重要的意义，也为未来优质羔皮羊的选育提供了研究方向，其具有重要的实际应用价值。11.本发明提供一种与湖羊毛乳头细胞增殖相关的mirna标志物在检测湖羊毛乳头细胞增殖中的应用。12.本发明还提供一种与湖羊毛乳头细胞增殖相关的mirna标志物的引物。所述引物包括seqidno.4所示的上、下游引物和seqidno.5所示的茎环引物。13.本发明进一步提供了mirna标志物在制备检测湖羊毛囊生长发育与毛发弯曲发育情况试剂盒中的应用。所述试剂盒用来检测mirna-143的表达水平，包含mirna标志物的检测引物，所述检测引物包括seqidno.4所示的上、下游引物和seqidno.5所示的茎环引物（即为茎环法的mirna反转录引物）。14.采用上述引物组，可通过茎环法检测出上述的与湖羊毛囊生长发育与毛发弯曲发育相关的mirna。进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述试剂材料还包括mirna提取试剂盒、mirna1ststrandcdnasynthesiskit(bystem-loop)反转录试剂盒、mirna的荧光定量试剂盒、mirnauniversalsybr®ꢀqpcrmastermix、tbgreenpremixextaqii、总rna提取试剂盒、一步法除基因组cdna反转录试剂盒。15.本发明再进一步提供了mirna-143的模拟物和抑制物，所述mirna-143的模拟物序列如seqidno.1所示（即ugagaugaagcacuguagcuc），所述mirna-143的抑制物序列如seqidno.13所示（即gagcuacagugcuucaucuca）。使用mir-143模拟物可相当于对mir-143进行过表达；mirna-143抑制物主要与mir-143发生结合从而抑制mir-143发挥作用。16.本发明更进一步提供了mirna-143的模拟物和抑制物在检测湖羊毛乳头细胞增殖中的应用。17.本发明通过rt-qpcr、westernblot以及cck8技术检测mirna-143模拟物与抑制物在检测湖羊毛乳头细胞增殖中的应用，在本发明的一些实施方案中，还包括蛋白裂解液、bca蛋白浓度测定试剂盒、cck8细胞增殖检测试剂盒。18.本发明还提供一种能与上述的湖羊毛囊生长发育与毛发弯曲相关的mirna结合靶基因的重组表达载体，所述靶基因为cux1基因，cux1基因核苷酸序列如seqidno.2所示，氨基酸序列如seqidno.3所示。所述重组表达载体与所述mirna的结合位点为tctca，所述重组表达载体包含选自cux1基因的3'utr中长约300bp区段，其核苷酸序列如seqidno.14所示。具体地，重组表达载体包含选自cux1基因的3'utr中长约300bp区段序列为：ccatctccctttaaagagggtctcagcctcgtcaggctccctaagtccagaaagctcctgaggccaaaccaaaccacctcaggctgctgacccagcctgggtcccgcccagcagcctgacctctagccttggggacagagacctctcagctgtgacactgagttcccactgattctggctgtggttaatccagttggggtcccccgggccatcccaggatccccttgggctcccctcagatccatcaccatccccccaaggcatggaagctcttcctggcaggacagcgagctctaagtc其中，斜体碱基部分是与mir-143种子区结合的序列。19.进一步的，所述重组表达载体中的标记基因为双荧素酶报告基因。20.本发明提供了上述mir-143的模拟物与抑制物在调控湖羊毛乳头细胞增殖机制中应用。本发明通过生物信息学预测靶向mirna靶基因cux1，再利用双荧光素酶报告系统、rt-qpcr、以及westernblot技术进一步验证了mirna-143在湖羊毛乳头细胞增殖过程中表达起显著下调作用。因此，本发明提出的mirna-143可作为生物标志物应用于鉴定湖羊毛乳头细胞的增殖。21.本发明中，mir-143和cux1在前期高通量测序结果中显示：在湖羊小花和直毛中差异表达且两者的表达水平正好相反；通过edu、cck8、细胞周期等验证了mir-143、cux1对毛乳头细胞增殖的功能，并通过双荧光素酶实验验证两者靶向关系，确定了mir-143能够靶向cux1调控毛乳头细胞增殖，同时，在过表达mir-143后还发现毛囊生长发育经典通路wnt通路关键基因的变化，结果更加准确。本发明对mir-143在毛乳头细胞增殖作用中的功能验证更加详细、准确。附图说明22.图1为本发明中mir-143在湖羊小花和直毛花纹皮肤中的表达量示意图。23.图2为本发明中利用rt-qpcr、wb和cck8实验检测在mirna-143过表达与抑制条件下，湖羊毛乳头细胞增殖情况图。图2中a表示利用rt-qpcr检测mirna-143模拟物与抑制物的转染效果图，b表示利用rt-qpcr检测mirna-143过表达与抑制条件下，细胞增殖基因（cdk2、pcna、cyclind1）的表达情况图，c表示利用wb检测细胞增殖基因（cdk2、pcna）蛋白表达情况图，d表示利用cck8检测在mirna-143过表达与抑制条件下，湖羊毛乳头细胞增殖活性图。24.图3为本发明中利用双荧光素酶报告系统、rt-qpcr和wb实验检测mir-143与cux1的靶向关系图。图3中a表示利用双荧光素酶报告系统检测mirna-143过表达条件下的荧光活性图，b表示利用rt-qpcr检测在mirna-143过表达条件下cux1基因mrna的表达水平，c表示利用wb检测在mirna-143过表达条件下cux1基因蛋白的表达水平。具体实施方式25.下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步的详细说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护权限不限于下述的实施。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照本领域常规方法和条件，或商品说明书选择。下列实施例所涉及的试剂及材料均为市购，此处不一一列举。26.实施例1湖羊mirna-143pcr及荧光定量检测试剂盒与应用1.rna样品的制备（利用mirnakit进行操作）试验用湖羊购自江苏省徐州苏羊羊业有限公司，选取体重相近健康无病的小花花纹和直毛花纹各3只的3日龄羔羊，分别采取肩胛部皮肤组织样品（1cm2）并迅速置于液氮速冻后，在-80℃下保存待用。试验细胞来自江苏省徐州苏羊羊业有限公司出生3日龄湖羊的肩胛部皮肤，前期已完成湖羊毛乳头细胞的分离及鉴定。rna提取步骤具体如下：采用mircutemirna提取分离试剂盒提取组织样和细胞中的mirna，具体步骤如下：（1）取-80℃保存的适量湖羊小花、直毛花纹羔羊皮肤组织样品迅速置于冰上，剪取适量的组织样迅速加入1ml裂解液mz后进行匀浆数分钟。细胞：弃去培养基，pbs清洗2次，每孔加入1ml裂解液trnzol，以便于充分吹打细胞；（2）15~30℃条件下放置5min；（3）加入200μl氯仿，剧烈震荡15s，冰上放置10min；（4）12000rpm，4℃，15min高速离心，吸取上清无色水相转入新的1.5ml无酶管；（5）按溶液体积加入0.43倍无水乙醇混匀，并转入mirspin吸附柱，12000rpm离心30s；（6）在滤液中加入0.75倍无水乙醇混匀，转入mirelute吸附柱中，12000rpm离心30s，弃滤液；（7）向吸附柱mirelute中加入500μl去蛋白液mrd，室温静置2min，12000rpm，离心30s，弃滤液；（8）向吸附柱mirelute中加500μl漂洗液rw，室温静置2min，12000rpm，离心30s，弃滤液；（9）重复上一步骤；（10）将吸附柱放回收集管，12000rpm，2min，去除残余漂洗液；（11）将吸附柱放于新的1.5ml无酶离心管中，室温通风晾干，向吸附柱的中心滴加20μl无酶水，室温静置2min，12000rpm，2min；（12）重复上步操作一次；（13）将rna置于-80℃保存待用。27.2.mirna反转录与实时定量pcrmirna-143的核苷酸序列如seqidno.1所示，即：5’ꢀ‑ugagaugaagcacuguagcuc‑ꢀ3’。mir-143的上游引物和茎环引物在诺唯赞生物科技有限公司官网设计（见表1），由擎科生物技术（北京）有限公司合成，下游通用引物由mirnauniversalsybr®ꢀqpcrmastermix试剂盒自带。采用u6基因作为内参检测mirna表达量，其引物的核苷酸序列如seqidno.6所示。引物序列如下：表1引物信息table2-1mirnaprimersinformation（1）mirna反转录采用mirna1ststrandcdnasynthesiskit(bystem-loop)（诺唯赞）试剂盒说明书配制反应体系如下：表2基因组dna去除体系混合液（冰上操作）试剂组分体积（μl）5×gdnawiper2totalrna500ngrnase-freeddh2o补足到10基因组dna去除体系混合液配制完成后轻轻震混，42℃，孵育2min。28.表3反转录反应体系（冰上操作）试剂组分体积（μl）上一步的混合液10stem-loopprimer(2µm)110×rtmix2hiscriptⅱenzymemix1rnase-freeddh2o补足20pcr反应条件：25℃5min，50℃15min，85℃5min；pcr产物于-20℃保存，用于后续q-pcr检测。29.（2）mirna实时荧光定量pcr参照mirnauniversalsybr®qpcrmastermix试剂盒说明书配制如下表所示反应体系（冰上配制）。30.表4反应体系试剂组分体积（μl）2×mirnauniversalsybrqpcrmastermix10specificprimer0.4mqprimerr0.4templatecdna1ꢀddh2o8.2设置反应程序：95℃5min，95℃10s，60℃15s，40个循环；meltcurve。31.采用上述荧光定量pcr法检测mirna-143在湖羊消化和直毛羔羊皮肤中的表达情况，利用excel统计荧光定量pcr的数据，使用spss17.0对该数据进行分析，用graphpadprism8绘制图形，数据以平均数±标准差表示，使用单因素方差分析检验差异显著性，p＜0.05表示差异显著，在图表中用一个星号（*）表示；p＜0.01表示差异极显著，在图表中用两个星号（**）表示。结果显示，直毛湖羊皮肤中mir-143的表达量极显著高于小花花纹湖羊（p《0.01）（见图1），由此可以看出mir-143与湖羊羔皮毛囊生长发育与羊毛弯曲相关。32.实施例2mir-143作为分子标记物检测湖羊毛乳头细胞增殖中的应用1.样品制备试验细胞来自江苏省徐州苏羊羊业有限公司出生3日龄湖羊的肩胛部皮肤，前期已完成湖羊毛乳头细胞的分离及鉴定。33.2.细胞培养与转染将生长状态良好的毛乳头细胞均匀接种于6或96孔细胞板内，待细胞生长融合度至30%-50%时，根据mirna使用说明，将mir-143minic、mir-143minicnc、mir-143inhibitor、mir-143inhibitornc配制成20um的储存液，再根据jetprime转染试剂说明书将实验组分为mir-143minic/mir-143minicnc、mir-143inhibitor/mir-143inhibitornc进行转染，转染浓度分别为50nm，200nm。具体操作如下：（1）弃细胞板中原有培养基，用pbs清洗2遍，每遍30s左右，每孔加入1ml培养基；（2）将mirna(最终浓度：50nm或200nm)稀释到200μljetprime®buffer缓冲液中涡旋5s；（3）向步骤（2）的溶液中加入4μljetprime®转染试剂，涡旋1秒钟，短暂离心；室温下孵育15分钟得到转染混合液；（4）将转染混合液滴加到仍在含培养基中的细胞中；（5）轻轻地前后和左右摇晃盘子，在37℃下孵育。34.3.荧光定量分析（1）细胞中mirna提取采用实施例1中mirna提取方法提取mirna。35.（2）mirna反转录与实时定量pcr采用实施例1中mirna反转录与实时定量pcr方法对上述提取的mirna进行反转录与实时定量pcr分析。36.（3）细胞中总rna提取细胞中总rna提取采用trizoluniversal(天根)法，基本操作如下：①弃去培养基，pbs清洗2次，每孔加入1ml裂解液trnzol，充分吹打细胞；②每孔加入1ml裂解液trnzoluniversal，充分吹打细胞；4℃中静置10min，转移到1.5ml无酶离心管中；③加入200μl氯仿，剧烈震荡15s，冰上放置10min；④12000rpm，4℃，15min高速离心，吸取上清无色水相转入新的1.5ml无酶离心管中；⑤按溶液体积加入等体积异丙醇，上下颠倒混匀，室温静置5min；⑥12000rpm，4℃，高速离心10min，出现白色沉淀，轻轻吸去上清；⑦加入75%乙醇1ml，上下颠倒20s；12000rpm，4℃，高速离心5min，轻轻吸去上清；⑧瞬时离心30s，吸干液体；室温晾干8min，白色沉淀呈透明状，加入30μl无酶水；60℃，溶解7min；⑨测定浓度后将rna置于-80℃保存待用。37.（4）反转录成cdna采用fastkinggdnadispellingrtsupermix试剂盒(天根)对上述提取的mirna进行反转录，具体操作如下：表5反转录反应混合液（在冰上操作）组成成分使用量5×fastking-rtsupermix4μltotalrna1ugddh2o补足至20μl混合液轻轻震混，42℃15min，95℃3min。38.（6）荧光定量pcr①引物设计根据genebank公布的绵羊基因序列，以gapdh为内参，利用在线软件ncbi（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）设计pcna、cdk2、cyclind1、gapdh的引物（见表6），然后由擎科生物技术（北京）有限公司合成，cdk2、pcna、cyclind1、gapdh的引物，其核苷酸序列如seqidno.7-10。39.表6引物信息table2-2primersinformation②ꢀrt-qpcr参照tbgreentmpremixextaqtm（takara）试剂盒说明书进行rt‑ꢀqpcr，具体操作步骤如下：表7pcr反应液配制（在冰上操作）试剂使用量（μl）2×tbgreenpremixextaqii12.5上游引物(f)1下游引物(r)1cdna2rnase-freeddh2o8.5pcr反应条件：95℃30s；95℃5s，60℃30s，40个循环。40.4.westernblot（1）细胞蛋白提取参照ripa裂解液（强）试剂（碧云天）说明书提取湖羊毛乳头细胞的蛋白（冰上操作），具体操作如下：弃去旧培养液，用pbs清洗2次；加入配制好的ripa裂解液250μl（按1mlripa裂解液加10μlpmsf（100mm）），充分吹打，经常来回摇动为使细胞充分裂解；将含有裂解液的细胞转入1.5ml离心管内；14000g，4℃，5min，转移上清至新的离心管；保存于-80℃，用于后续wb实验。41.（2）蛋白含量的测定根据bca蛋白浓度测定试剂盒（碧云天），对提取的毛乳头细胞蛋白进行浓度测定，具体操作如下：1)蛋白标准品的配制先将蛋白标准品用蛋白标准品配制液稀释成25ug/μl的蛋白标准品溶液，再用pbs将蛋白标准品溶液稀释成0.5ug/μl，用于蛋白标准曲线绘制。42.2)bca工作液配制根据样品数量，按bca试剂a与bca试剂b的比50：1配制bca工作液配制。43.3)蛋白浓度检测①取酶标板，按下表加入试剂；表8孔号01234567蛋白标准品(μl)01248121620pbs(μl)2019181612840对应蛋白含量（ug/μl）00.0250.050.10.20.30.40.5②将蛋白样品用pbs稀释5倍至20μl；③每孔加入200μl配制好的bca工作液，充分混匀，37℃静置30min；④用酶标仪测定562nm处的吸光度；⑤以蛋白含量为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，计算蛋白样品浓度。44.（3）wb1)sds-pag参照page凝胶快速制备试剂盒（雅酶）制备10%的凝胶，具体操作如下：表9下层胶配方试剂使用量下层胶溶液（2×）2.7ml下层胶缓冲液（2×）2.7ml改良型促凝剂60μl表10上层胶配方试剂使用量上层胶溶液（2×）750μl上层胶缓冲液（2×）750μl改良型促凝剂15μl2)样品制备与电泳将蛋白样本用pbs稀释成相同浓度，按上样缓冲液与蛋白样品1：4的比加入1.5ml离心管，煮沸8min变性，冰上冷却后上样。45.电泳：80v20min，120v60min。46.3)转膜先取出凝胶，按蛋白大小，剪取适合大小，置于超纯水中。按胶的大小剪取与胶大小相同的pvdf膜，将膜放入甲醇中浸泡30s，再浸泡到超纯水中5min，然后将膜与两张超厚滤纸置于转膜液10min。在trans-blotturbotm的转印槽分别放置滤纸、pvdf膜、胶、滤纸，盖上转印槽盖子开始转膜。转膜条件：25v，30min。47.4)封闭将pvdf膜放入5%脱脂奶粉配制的封闭液中，脱色摇床摇室温1h。48.5)一抗孵育将封闭后的pvdf膜直接放进稀释好的一抗见（表2-3）中，脱色摇床摇1h，并4℃，过夜。49.6)二抗孵育用tbst洗涤3次，每次5min，然后加入与一抗同属的稀释好的二抗（表11）中，室温摇晃1h。50.7)显影与图像分析参照ecl化学发光底物（biosharp）试剂盒说明进行显影，具体操作如下：配制1：1（增强型发光a液：稳定剂b液）发光工作液滴加在膜上进行显影曝光。51.表11实验所用一抗和二抗table2-3theprimaryantibodyandsecondaryantibod（5）cck8实验转染24h后，弃去旧培养基，用pbs清洗2遍，然后于每孔中加入10μlcck-8溶液（避免产生气泡），继续在37℃培养箱中孵育2h用酶标仪在450nm处测定od值，此时测定值设为0h，然后依次测定24h、48h、72h的od值。最后，以od值代表湖羊毛乳头细胞的相对增殖水平，绘制细胞增殖曲线。52.利用excel统计数据，使用spss17.0对数据进行分析，用graphpadprism8绘制图形，数据以平均数±标准差表示，使用单因素方差分析检验差异显著性，p＜0.05表示差异显著，在图表中用一个星号（*）表示；p＜0.01表示差异极显著，在图表中用两个星号（**）表示。上述实验结果如下：首先，将mir-143的模拟物/对照，mir-143的抑制物/对照转染至生长阶段的湖羊毛乳头细胞中。rt-qpcr结果显示，在湖羊毛乳头细胞中过表达mir-143极显著提高了mir-143的表达量（p《0.01），抑制mir-143表达后极显著降低了mir-143的表达量（p《0.01）（图2中a）；同时，利用rt-qpcr检测了相关增殖基因的mrna表达水平，结果表明过表达mir-143后极显著地抑制这3个增殖基因pcna、cdk2、cyclind1的表达（p《0.01）,抑制mir-143表达后，显著的提高cdk2的表达量(0.01《p《0.05)，而pcna和cyclind1d的表达量极显著上调（p《0.01）(图2中b)；蛋白免疫印迹结果表明，过表达mir-143后pcna和cdk2的蛋白表达水平明显下降，抑制mir-143后pcna和cdk2的蛋白表达量与对照组相比明显升高（图2中c）；cck-8结果显示，在湖羊毛乳头细胞中过表达mir-143后，在48、72h的od值极显著低于对照组（p＜0.01），抑制mir-143表达后，在24和72h的od值显著显高于对照组（0.01《p＜0.05），而在48h时达到极显著水平（p《0.01）(图2中d)，综上结果表明mir-143能够抑制湖羊真皮乳头细胞的增殖。53.实施例3湖羊mirna-143调控湖羊毛乳头细胞增殖机制1.靶基因预测利用在线rnahybrid(https://bibiserv.cebitec.uni-bielefeld.de/rnahybrid/)、mirbase(http://www.mirbase.org/)targetscan(http://www.targetscan.org/mamm_31/)等多个预测软件对mir-143的靶基因进行预测，最终选定cux1作为候选靶基因，利用在线网站ncbi(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)获得绵羊cux1基因（geneid:101120041）的3’utr区序列。54.2.双荧光素酶报告基因检测（1）基因组dna提取参照血液/细胞/组织基因组dna提取试剂盒（天根）提取湖羊皮肤组织dna，具体操作如下：取适量储存于-80℃的湖羊皮肤组织样品于置于冰上，剪取适量组织样于研钵中磨成粉末状；将粉末状组织转入含有200μl缓冲液ga的1.5ml离心管中，震荡悬浮；加入20μl蛋白酶k试剂混匀，放入56℃恒温水浴锅中消化溶解2小时，每小时上下颠倒2次；加入200μl缓冲液gb，震荡混匀，70℃放置水浴锅中消化至溶液变的清亮；加入200μl无水乙醇，震荡混匀；将所得液体和沉淀全部转入cp3吸附柱中，12000rpm，离心30s，弃废液；加入500μl缓冲液gd和600μl漂洗液pw洗涤，12000rpm，离心30s，弃废液；12000rpm，空转2min，弃废液，吸附柱室温晾干5min；将吸附柱放入新的1.5ml离心管，加入50μl洗脱液te，室温2min，12000rpm，离心2min，收集dna；用分光光度计检测dna浓度与质量，储存于-20℃。55.（2）双荧光素酶载体构建根据ncbi在线网站上下载的cux1基因3’utr序列，利用oligo6软件设计扩增引物(见表13)，以湖羊全基因组dna为模板扩增包含cux13’utr上mir-143结合位点序列片段，将其片段克隆到psi-check2双荧光素酶报告载体上，具体实验流程如下：1）pcr扩增dna片段：表12pcr反应体系（冰上操作）试剂组分体积（μl）primestarmaxpremix（2x）25上游引物2下游引物2dna模板＜400ngddh2o补足到50pcr反应条件如下：98℃，变性10s，58℃，退火5s，72℃，延伸5s，34个循环，4℃保存。56.cux1目的片段双荧光素酶载体构建引物如seqidno.11（野生型）和seqidno.12（突变型）所示。57.表13载体构建引物table3-1theprimerforconstructionofvector.注：野生型载体引物，小写的核苷酸表示限制性酶切位点；在突变型载体引物中，下划线的核苷酸表示cux1与mir-143的结合位点，加粗的核苷酸表示突变位点。58.2）参照dna纯化回收试剂盒（takara）说明回收测序后的dna目的片段。59.3）用quickcut™xhoⅰ和quickcut™notⅰ对上述回收的dna片段和psi-check2载体进行双酶切；表14双酶切反应体系冰上操作）试剂组分体积（μl）quickcutgreenbuffer5quickcut™xhoⅰ1quickcut™notⅰ1回收dna片段/载体＜500ngddh2o补足到50pcr反应条件如下：37℃，30min，85℃，30s。60.4）参照dna纯化回收试剂盒（takara）说明回收双酶切后的目的片段和载体。61.5）参照solutionⅰ的使用说明将载体与目的片段进行连接。连接体系为载体1μl(约20ng)，目的片段4μl(约80ng)，solutionⅰ连接液5μl，16℃过夜连接。62.6）重组质粒转化：将10μl连接产物加到dh5α感受态细胞中，轻轻混匀冰浴30min；42℃热激50s，立即置于冰上5min；加入500μlsoc培养基，180rpm，37℃震荡1h；取200μl菌液均匀涂布于含氨苄抗性的lb固体培养基上，10min后倒置培养基，于37℃过夜培养16h后挑取阳性克隆验证。63.7）重组质粒提取：按照无内毒素小提中量（天根）试剂盒说明书进行提取质粒。64.8）重组质粒鉴定：将提取的质粒和扩增片段的引物送擎科生物技术（北京）有限公司鉴定，同时进行双酶切鉴定。65.（3）靶基因cux13’utr上mir-143结合位点突变参照快速定点突变试剂盒(天根)设计盒说明书设计突变引物（表3-1），以野生型载体（cux1-wt）为模板，进行结合位点突变，具体操作步骤如下：1）pcr反应表15pcr反应体系（冰上操作）试剂组分体积（μl）野生型载体100ng上游突变引物（f）2下游突变引物（r）25×fastalterationbuffer10fastalterationdnapolymerase1.5ddh2o补足到50pcr反应条件如下：95℃预变性2min，94℃变性20s，55℃退火10s，68℃延伸2.5min，68℃补充延伸5min，18个循环。66.2）模板消化表16酶切体系（冰上操作）试剂组分体积（μl）pcr产物50dpnⅰrestrionenzyme1轻轻震混，37℃，孵育1h。67.3)突变型重组质粒转化：将5μl消化产物加到fdm感受态细胞中，轻轻混匀冰浴30min；42℃热激60s，立即置于冰上3min；加入300μlsoc培养基，150rpm，37℃震荡1h；将350μl菌液均匀涂布于含氨苄抗性的lb固体培养基上，25min后倒置培养基，于37℃过夜培养16h后挑取阳性克隆验证。68.（4）细胞培养与转染复苏293t细胞接并种于细胞培养中，37℃细胞培养箱培养，当细胞生长融合至90%后，用0.25%胰酶消化，1000rpm离心5min，按每孔2×105接种于24孔板，于37℃细胞培养箱继续培养。待细胞生长融合度达60%-80%时，进行细胞转染。根据jetprime转染试剂和mirna说明，按一下实验组进行转染：第一组：mir-143minic+cux1-wt、mir-143minicnc+cux1-wt第二组：mir-143minic+cux1-mut、mir-143minicnc+cux1-mut5.双荧光素酶报告基因检测细胞转染48h后，按照dual-luciferase(promega)双荧光素酶试剂盒说明书检测荧光强度，具体操作如下：弃去旧培养基，pbs清洗2次，每孔加1×plb裂解液100μl，在脱色摇床上裂解10min；12000rpm，4℃，离心5min，吸取上清转移至新的1.5ml离心管中；在96孔酶标板中加入20μl裂解液，继续加入100μl/孔luciferasereagent混匀，上机检测；取出酶标板，加入100μl/孔stop＆gloreagent混匀，检测海肾荧光素酶活性，计算海肾和萤火虫荧光值的比值，进行差异性分析。69.3.荧光定量检测mirna-143对cux1表达量的影响采用实施例2中实时荧光定量pcr反应条件和方法，其中cux1引物为：上游引物：gcacgacattgagacggag；下游引物：agctatggtctcagcctggt扩增条件为：95℃30s；95℃5s，60℃30s，40个循环。70.4.westenblot检测mirna-143对cux1表达量的影响采用实施例2中westernblo实验，其中cux1抗体，gapdh为内参。71.根据生物信息学软件预测的cux1与mir-143种子序列存在结合区域，成功构建了包含cux13’utr区的psi-check2野生型载体cux1-wt。同期，成功构建了包含将mir-143靶位点突变2个碱基序列的cux13’utr区psi-check2突变型载体cux1-mut1。分别将cux1的野生型和突变型报告载体与mir-143的模拟物共转染进293t细胞，在转染48h后进行荧光素酶活性检测分析。相对荧光素酶活性显示，mut组(mir-143+cux13'utr突变型)与对照组无显著差异(p》0.05)，而wt组(mir-143+cux13'utr野生型)显著低于对照组(0.01《p《0.05)(见图3中a)。结果表明，mir-143能够与cux1的3’utr结合并抑制荧光素酶活性。然后，为了进一步明确mir-143与cux1之间的关系，我们在毛乳头细胞中过表达并抑制mir-143。通过qrt-pcr和wb检测cux1的mrna和蛋白表达，定量结果显示mir-143过表达后导致cux1的表达量极显著下降（p《0.01），而抑制mir-143表达后真皮乳头细胞中cux1的表达量极显著增加（p《0.01）（见图3中b）。wb结果同样显示了mir-143可以降低cux1蛋白的表达水平（见图3中c），这与双荧光素酶测定结果有一致。说明cux1是mir-143的靶基因，mir-143调控靶基因cux1抑制湖羊毛乳头细胞增殖。72.以上所述，仅为本发明中的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉该技术的人在本发明所揭露的技术范围内，可理解想到的变换或替换，都应涵盖在本发明的包含范围之内，因此，本发明的保护范围应该以权利要求书的保护范围为准。当前第1页12当前第1页12