一种响应双链核酸的DNA分子电路及其使用方法

本发明涉及一种响应双链核酸的dna分子电路及其使用方法。

背景技术：

1、开发出快速运行、稳定性好的高性能dna分子电路对于生物计算与储存、基因编辑、智能分子诊断与治疗等领域至关重要。

2、目前，已经研究出多种基于粘性末端介导的链置换反应(tmsd)的dna分子电路或基于核酸酶驱动的dna分子电路。这些分子电路仅能响应单链核酸。然而，多数生物样本的基因组为完全互补的双链核酸序列，它们无法被上述的分子电路所响应，这大大缩小了dna分子电路的应用范围。

3、λ噬菌体核酸外切酶(λexo)最初是从感染了λ噬菌体的大肠杆菌细胞中纯化出来的。这种酶催化双链dna分子从5’-p末端进行逐步的水解释放出5’-单核苷酸。但不能降解5’-oh末端，是常用的核酸外切酶。

4、粘性末端介导的链置换反应(tmsd)基于线性dna结构构建，由线性dna的粘性末端(toehold)介导。能够响应单链核酸，并以单链核酸作为输出，是构建分子电路的基本反应。

5、杂交链式反应(hybridization chain reaction，hcr)是一种信号扩增技术,它利用分子识别和杂交反应依次打开多个发卡探针，得到累计信号，实现选择性检测靶分子的目的，其特点是整个反应过程无酶参与，避免了非特异性扩增对分析结果的影响，且反应条件温和易控制。基于这些特点，hcr受到了研究人员广泛的关注。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是如何在室温下构造响应双链核酸输入的多种dna分子电路。

2、为了解决以上技术问题，本发明首先提供一种信号识别传感元件，所述信号识别传感元件用于识别待测样本是否含有目标双链dna；所述信号识别传感元件包含名称为单链核酸输出的一条单链dna和名称为单链dna探针的一条单链dna，所述单链dna探针从5’至3’方向依次为目标结合域和单链核酸输出结合域，所述单链核酸输出结合域与所述单链核酸输出结合，所述目标结合域与所述目标双链dna的一条链反向互补；所述单链核酸输出的5’端进行硫代修饰，所述单链dna探针的5’端进行磷酸化修饰。

3、上述信号识别传感元件中，所述信号识别传感元件可选自如下①或②：

4、①一类λexo gate，由i型复合结构和ii型复合结构构成；

5、所述i型复合结构由a1-i和a2-i两条单链dna组成：

6、a1-i名为单链核酸输出i，所述a1-i是从5’至3’方向由a1-i toehold封锁域和a1-i置换域依次连接而成的单链dna，所述a1-i的5’端进行硫代修饰；所述a1-i toehold封锁域由名称为ta的核苷酸片段构成；所述a1-i置换域由名称为a的核苷酸片段构成；

7、a2-i为单链dna探针i，所述a2-i是从5’至3’方向由目标i结合域和a1-i结合域依次连接而成的单链dna；其中所述目标i结合域与目标双链dna-i中的其中一条链反向互补，所述a1-i结合域与所述a1-i反向互补；

8、所述ii型复合结构由a1-ii和a2-ii两条单链dna组成：

9、a1-ii名为单链核酸输出ii，所述a1-ii是从5’至3’方向由a1-ii 5’端封锁域、a1-ii置换域和a1-ii 3’端封锁域封锁域依次连接而成的单链dna，所述a1-ii的5’端进行硫代修饰；所述a1-ii 5’端封锁域由名称为tb的核苷酸片段构成；所述a1-ii置换域由名称为b的核苷酸片段构成，所述a1-ii 3’端封锁域封锁域由名称为tq的核苷酸片段构成；

10、a2-ii为单链dna探针ii，所述a2-ii是从5’至3’方向由目标ii结合域和a1-ii结合域依次连接而成的单链dna；其中所述目标ii结合域与目标双链dna-ii中的其中一条链反向互补，所述a1-ii结合域与所述a1-ii反向互补；

11、②二类λexo gate，由b1和b2两条单链dna组成：

12、b1名为单链核酸输出，所述b1是从5’至3’方向由名称为x的核苷酸片段和名称为y的核苷酸片段依次连接而成的单链dna；所述b1的5’端进行硫代修饰；

13、b2名为单链dna探针，所述b2是从5’至3’方向由目标结合域和单链核酸输出结合域的单链dna；其中所述目标结合域与目标双链dna中的其中一条链反向互补，所述单链核酸输出结合域与所述b1反向互补。

14、上述信号识别传感元件中，所述一类λexo gate中所述a1-i的核苷酸序列与序列表序列1的第26-50位反向互补，所述a1-i的自5’起的第1-5位核苷酸均进行硫代修饰；所述a2-i的序列如序列表中序列1所示，所述a2-i的自5’起第1位核苷酸修饰有磷酸基团；所述a1-ii的序列与序列表序列2的第46-69位反向互补，其第1-5位进行硫代修饰；所述a2-ii的序列如序列表序列2所示，其第1位修饰有磷酸基团。

15、上述信号识别传感元件中，所述一类λexo gate中所述a1-i和所述a2-i的摩尔比可为1:1，所述a1-ii:a2-ii的摩尔比可为1:1，所述i型复合结构和所述ii型复合结构的摩尔比可为1:1。

16、上述信号识别传感元件中，所述二类λexo gate中所述b1的序列与序列表序列2的第46-69位反向互补，其第1-5位硫代修饰；所述b2的序列如序列表序列2所示，其第1位修饰有磷酸基团。

17、上述信号识别传感元件中，所述二类λexo gate中所述b1和所述b2的摩尔比可为1:1。

18、上述信号识别传感元件中，所述进行硫代修饰为修饰3-5个核苷酸，具体可为修饰5个核苷酸。

19、本发明提供一种响应双链核酸的dna分子电路，由所述信号识别传感元件及其下游的生物传感器构成，所述生物传感器响应由所述信号识别传感元件在核酸外切酶催化下输出的游离状态的所述单链核酸输出。

20、上述响应双链核酸的dna分子电路中，所述生物传感器可选自如下1)或2)：

21、1)tmsd逻辑电路，所述tmsd逻辑电路响应所述的一类λexo gate输出的游离状态的所述单链核酸输出；所述tmsd逻辑电路由与门(and gate)、或门(or gate)和报告子(reporter)构成；

22、所述与门(and gate)由z1、z2和z3三条单链dna组成：

23、z1名为辅助探针，所述z1是从5’至3’方向由a1-i置换域和a1-i toehold封锁域依次连接而成的单链dna；所述a1-i置换域由名为a的核苷酸片段构成，所述a1-i toehold封锁域由名为tb的核苷酸片段构成；

24、z2名为信号探针，所述z2是从5’至3’方向由a1-ii置换域和reporter结合域依次连接而成的单链dna；所述a1-ii置换域由名为b的核苷酸片段构成；所述reporter结合域从5’至3’方向由名为tq的核苷酸片段和名为q的核苷酸片段依次连接而成；

25、z3名为基板探针，所述z3从5’至3’方向由toehold封锁域、a1-ii结合域和a1-i结合域依次连接而成的单链dna；所述toehold封锁域由名为tq*的核苷酸片段构成；所述a1-ii结合域从5’至3’方向由名为b*的核苷酸片段和名为tb*的核苷酸片段依次连接而成；所述a1-i结合域从5’至3’方向由名为a*的核苷酸片段和名为ta*的核苷酸片段依次连接而成；

26、所述或门(or gate)由复合结构i和复合结构ii构成；

27、所述复合结构i由序列o1、o2组成：

28、所述o1是从5’至3’方向由a1-i置换域和reporter结合域依次连接而成的单链dna；所述a1-i置换域由名为a的核苷酸片段构成，所述reporter结合域从5’至3’方向由名为tq的核苷酸片段和名为q的核苷酸片段依次连接而成；

29、所述o2是从5’至3’方向由toehold封锁域和a1-i结合域依次连接而成的单链dna；所述toehold封锁域由标为tq*的核苷酸片段构成；所述a1-i结合域从5’至3’方向由名为a*的核苷酸片段和名为ta*的核苷酸片段依次连接而成；

30、所述复合结构ii由序列z2、o3组成：

31、所述z2是从5’至3’方向由a1-ii置换域和reporter结合域依次连接而成的单链dna；所述a1-ii置换域由名为b的核苷酸片段构成；所述reporter结合域从5’至3’方向由名为tq的核苷酸片段和名为q的核苷酸片段依次连接而成；

32、所述o3是从5’至3’方向由toehold封锁域和a1-ii结合域依次连接而成的单链dna；所述toehold封锁域由名为tq*的核苷酸片段构成；所述a1-ii结合域从5’至3’方向由名为b*的核苷酸片段和名为tb*的核苷酸片段依次连接而成；

33、所述报告子(reporter)由q321、f-25-2和com51构成：

34、q321名为淬灭探针，所述q321为由名为q的核苷酸片段构成的单链dna，修饰有淬灭基团；

35、f-25-2名为荧光探针，所述f-25-2为由名为f的核苷酸片段构成的单链dna，修饰有荧光基团；

36、com51名为基板探针，所述com51是从5’至3’方向由f-25-2结合域、q321结合域和toehold封锁域的依次连接而成的单链dna；5’端进行硫代修饰；所述f-25-2结合域由名为f*的核苷酸片段构成；所述q321结合域由名为q*的核苷酸片段构成；所述toehold封锁域由名为tq*的核苷酸片段构成；

37、所述ta与所述ta*的核苷酸序列反向互补，所述a与所述a*的核苷酸序列反向互补，所述tb与tb*的核苷酸序列反向互补，所述b与b*的核苷酸序列反向互补，所述tq与tq*的核苷酸序列反向互补，所述q与q*的核苷酸序列反向互补，所述f与f*的核苷酸序列反向互补；

38、2)hcr放大电路，所述hcr放大电路响应所述的二类λexo gate输出的游离状态的所述单链核酸输出；所述hcr放大电路由h1和h2两条单链dna组成：

39、h1名为发夹荧光探针，是包含沿5’-3’方向依次连接的b1结合域和h1茎环封锁域的单链dna，其修饰有荧光基团；所述b1结合域由名为x的核苷酸片段和名为y的核苷酸片段沿5’-3’方向依次连接而成，所述b1结合域与b1反向互补；所述h1茎环封锁域名为z1的核苷酸片段、名为z2的核苷酸片段和名为y*的核苷酸片段沿5’-3’方向依次连接而成；

40、h2名为发夹淬灭探针，是包含沿5’-3’方向依次连接的h1结合域和h2茎环封锁域的单链dna，其修饰有淬灭基团；所述h1结合域由名为z2的核苷酸片段和名为y*的核苷酸片段沿5’-3’方向依次连接而成；所述h2茎环封锁域由名为z1的核苷酸片段、名为z2的核苷酸片段和名为y*的核苷酸片段沿5’-3’方向依次连接而成；

41、所述x和所述x*的核苷酸序列反向互补，所述y和所述y*的核苷酸序列反向互补，所述z1和所述z1*的核苷酸序列反向互补，所述z2和所述z2*的核苷酸序列反向互补。

42、上述响应双链核酸的dna分子电路中，所述tmsd逻辑电路中所述z1与序列表中序列4第19-37位反向互补；所述z2的核苷酸序列如序列表序列3所示；所述z3的核苷酸序列如序列表序列4所示；所述o1的核苷酸序列如序列表序列5所示；所述o2的核苷酸序列如序列表序列6所示；所述o3的核苷酸序列如序列表序列4的第1-24位所示；所述q321的核苷酸序列如序列表序列5第20-39位所示，所述q321的自5’起的第20位修饰有淬灭基团；所述f-25-2与序列表序列7所示第1-25位反向互补，所述f-25-2的自5’起的第3位修饰有荧光基团；所述com51的核苷酸序列如序列表序列7所示，所述com51的自5’起的第1-5位进行硫代修饰。

43、上述响应双链核酸的dna分子电路中，所述tmsd逻辑电路中所述与门(and gate)中z1:z2:z3的摩尔比可为1:1:1；所述或门(or gate)的所述复合结构i中o1:o2的摩尔比可为1:1，所述复合结构ii中z2:o3的摩尔比可为1:1，所述复合结构i和所述复合结构ii的摩尔比可为1:1；所述报告子(reporter)中q321:f-25-2:com51的摩尔比可为1:1:1；所述与门(and gate)：或门(or gate)：报告子(reporter)的摩尔比可为1:1:1。

44、上述响应双链核酸的dna分子电路中，所述hcr放大电路中所述h1的核苷酸序列如序列表序列8所示，第36位核苷酸修饰有荧光基团；所述所述h2的核苷酸序列如序列表序列9所示，第42位核苷酸修饰有淬灭基团，第1-5位核苷酸进行硫代修饰。

45、上述响应双链核酸的dna分子电路中，所述hcr放大电路中所述h1和所述h2的摩尔比可为1:1。

46、上述响应双链核酸的dna分子电路中，所述进行硫代修饰为修饰3-5个核苷酸，具体可为修饰5个核苷酸；所述淬灭基团淬灭所述荧光基团；所述淬灭基团可选为bhq1；所述荧光基团可选为fam。

47、本发明还提供上述生物传感器，可选自现有技术已有的生物传感器，具体可为所述tmsd逻辑电路或所述hcr放大电路。

48、本发明还公开所述信号识别传感元件的使用方法，包括以所述的信号识别传感元件在核酸外切酶存在的条件下检测所述待测样本，

49、若输出有游离状态的所述单链核酸输出，所述待测样本中存在或疑似存在所述目标双链dna；

50、若未输出游离状态的所述单链核酸输出，所述待测样本中不存在或疑似不存在所述目标双链dna。

51、本发明还公开检测待测样本是否含有目标双链dna的方法，所述方法包括以所述的响应双链核酸的dna分子电路在核酸外切酶存在的条件下检测所述待测样本，

52、若所述的生物传感器响应，所述待测样本中存在或疑似存在所述目标双链dna；

53、若所述的生物传感器未响应，所述待测样本中不存在或疑似不存在所述目标双链dna。

54、所述检测待测样本是否含有目标双链dna的方法，具体步骤如下：

55、当待测样本含有目标双链dna时，所述信号识别传感元件在核酸外切酶催化输出游离状态的所述单链核酸输出，所述生物传感器响应游离状态的所述单链核酸输出，得出所述待测样本中存在或疑似存在所述目标双链dna的判定结果；

56、当待测样本不含目标双链dna时，所述信号识别传感元件不输出游离状态的所述单链核酸输出，所述生物传感器不响应，得出所述待测样本中不存在或疑似不存在所述目标双链dna。

57、上述的信号识别传感元件，或上述的响应双链核酸的dna分子电路，或上述的生物传感器，或上述的使用方法，或上述的方法的在制备核酸检测产品中的应用也属于本发明的范围。

58、发明人利用常温下λ噬菌体核酸外切酶(λexo)驱动双链核酸分子的特异性识别的性质，结合粘性末端介导的链置换反应(tmsd)、杂交链式反应(hcr)的特性，开发了一种常温下可识别双链核酸输入的dna分子电路，称为响应双链核酸的dna分子电路。响应双链核酸的dna分子电路的工作原理如下：利用λexo驱动双链核酸与设计的一种信号识别传感元件结合形成λexo的最适底物后消化单链dna探针，从而释放出游离的单链核酸输出，游离的单链核酸输出作为新的输入被后续的生物传感器tmsd逻辑电路或杂交链反应(hcr)信号放大电路响应，产生荧光信号，实现模块化对接。本发明响应双链核酸的dna分子电路可在37℃的环境下直接响应双链核酸，扩展了dna分子电路底物库，有效提高了dna分子电路的响应和处理信息功能。

59、本发明的响应双链核酸的dna分子电路可以快速准确地响应完全互补的双链核酸输入，在常温下短时间内实现了逻辑运算与信号放大，有效提高了dna分子电路的响应和处理信息功能。通过置换双链输入为单链输出，还可以对接到各式各样应用广泛的分子电路模块，进一步扩展了dna分子电路的应用范围。响应双链核酸的dna分子电路可以在37℃的环境下直接响应双链核酸输入，高度可信地区分输入与非输入，扩展了dna分子电路底物库，有效提高了dna分子电路的响应和处理信息功能，本发明中的方法将在核酸检测和其他类型的智能诊疗中广泛应用。