一种与苹果属植物三叶苷有无性状相关的分子标记及应用

1.本发明属于苹果属育种技术领域，具体涉及一种与苹果属植物三叶苷有无性状相关的分子标记及应用。


背景技术：

2.三叶苷属于类黄酮中的二氢查尔酮类化合物，由根皮素a环4'位葡萄糖基化生成。三叶苷则主要存在于壳斗科石柯属的多穗石柯(sun ys,li w,liu zb,preparative isolation,quantification and antioxidant activity of dihydrochalcones from sweet tea(lithocarpus polystachyus rehd.).journal of chromatography b,2015,1002,372-378)和蔷薇科苹果属部分原生种和观赏海棠中(gutierrez bl,zhong gy,brown sk,genetic diversity of dihydrochalcone content in malus germplasm.genetic resources and crop evolution,2018,65,1485-1502；wang y,yauk y-k,zhao q,hamiaux c,xiao z,gunaseelan k,zhang l,tomes s,l
ó
pez-girona e,cooney j,li h,chagn
éꢀ
d,ma f,li p,atkinson rg,biosynthesis of the dihydrochalcone sweetener trilobatin requires phloretin glycosyltransferase 2.plant physiology,2020,184,738
–
752)。由于亲本遗传背景的限制，目前已知的所有苹果栽培品种不同组织中均不含三叶苷。三叶苷是一种天然甜味剂，甜度是蔗糖的100-300倍。并且，三叶苷还具有抗氧化、降血糖等生物活性(dong hq,li m,zhu f,liu fl,huang jb,inhibitory potential of trilobatin from lithocarpus polystachyus rehd against alpha-glucosidase and alpha-amylase linked to type 2 diabetes.food chemistry,2012,130,261-266；xiao z,wang y,wang j,li p,ma f,structure-antioxidant capacity relationship of dihydrochalcone compounds in malus.food chemistry,2019,275,354-360)。选育三叶苷含量高果糖和蔗糖含量低的苹果新品种，既可以满足消费者对果实甜度的口感要求，又可以满足其对碳水化合物低摄入的健康需求。因此，三叶苷不仅在食品加工领域应用前景广泛，也是未来苹果功能性成分育种的目标化合物。然而，由于目前所有含有三叶苷的苹果属植物均为野生种或观赏海棠品种，如果利用传统的杂交育种选育含有三叶苷的苹果新品种或新种质，亲本及杂交后代筛选方式时间长，占地面积大，育种周期很长。
3.分子标记辅助选择育种(marker assisted selection,mas)是利用与目标基因紧密连锁的分子标记来鉴定不同个体的基因型，进而辅助选择育种，加快育种效率。kasp(kompetitive allele-specific pcr)，即竞争性等位基因特异性pcr，通过引物末端碱基的特异匹配来对snp分型以及检测插入缺失(indel),是一项经济而准确的基因分型方法。因此，该技术被广泛应用于作物遗传改良和品种选育中。如果利用ksap技术对三叶苷有无这一性状进行早期选择，对于苹果属植物三叶苷育种而言，可以大幅提高亲本和杂交后代的筛选效率，进而提高育种效率，意义重大。
4.有鉴于此，提出本发明。
id no:1为例，在序列的第587bp处存在一个g/t颠换类型snp；
23.优选的，上述当所述g/t颠换类型的snp发生g
→
t突变时,为苹果属植物具有三叶苷性状。
24.本发明还提供一种上述分子标记的应用，可以理解本发明的分子标记可应用于如下任一方面：
25.1)在检测、鉴定或预测苹果属植物是否具有三叶苷性状中的应用；
26.2)在苹果属三叶苷分子标记辅助育种中的应用。
27.本发明还提供一种检测上述分子标记的检测试剂的应用，可以理解本发明的分子标记可应用于如下任一方面：
28.1)在检测、鉴定或预测苹果属植物三叶苷性状中的应用；
29.2)在苹果属三叶苷分子标记辅助育种中的应用。
30.可以理解，但凡能够用于检测上述indel和/或snp标记的试剂都是范畴内，因此所述试剂种类可以包括但不限于pcr类试剂、基因芯片类试剂或测序类试剂等。
31.优选的，所述分子标记的正向引物位于苹果参考基因组hfth1.genome的7号染色体上33730856号碱基上游50bp，反向引物位于33730856号碱基下游50bp；所述引物对能够实现权利要求1所述的indel分子标记的扩增检测。
32.在一些具体的实施方式中，所述试剂是包含seq id no.2-4所示引物的试剂；优选的，所述kasp引物的两个正向引物核苷酸序列如seq id no.2-4所示，即primer_allelefam:5'-gttcatttmtttttttgwtttctgggtttc-3'(seq id no.2)，和primer_allelehex:5'-gttcatttmtttttttgwtttctgggtttt-3'(seq id no.3)；通用反向引物核苷酸序列如seq id no.4所示，即primer_common:5'-gtgaagattartgagtcaaaatagagtgta-3'。
33.本发明还提供一种检测苹果属植物三叶苷有无性状的indel分子标记的引物组,可以理解，只要能够扩增上述indel分子标记的引物组都是本发明的范畴，具体的是这样一类引物，所述分子标记的正向引物位于苹果参考基因组hfth1.genome的7号染色体上33730856号碱基上游，反向引物位于33730856号碱基下游。
34.优选的，所述分子标记的正向引物位于苹果参考基因组hfth1.genome的7号染色体上33730856号碱基上游50bp，反向引物位于33730856号碱基下游50bp；所述引物对能够实现权利要求1所述的indel分子标记的扩增检测。
35.在一些实施方式中，所述引物是kasp引物，所述引物组序列如seq id no.2-4所示。
36.在一些具体的实施方式中，所述kasp引物的两个正向引物核苷酸序列如seq id no.18-19所示，即primer_allelefam:5'-gttcatttmtttttttgwtttctgggtttc-3'(seq id no.2)，和primer_allelehex:5'-gttcatttmtttttttgwtttctgggtttt-3'(seq id no.3)；通用反向引物核苷酸序列如seq id no.4所示，即primer_common:5'-gtgaagattartgagtcaaaatagagtgta-3'。
37.本发明还提供一种苹果属植物三叶苷性状鉴定的基因芯片，所述基因芯片上固定有能够检测上述分子标记的探针，同样的只要能够检测上述indel分子标记的探针类型都是本发明的范畴。
38.本发明还提供一种苹果属植物三叶苷性状检测试剂盒，该试剂盒中包含上述引物
对、探针或基因芯片等。
39.本发明还提供一种检测上述分子标记的检测试剂，所述检测试剂不限于pcr类试剂、基因芯片类试剂或测序类试剂；但凡能够用于检测上述indel和/或snp标记的试剂都属于本发明的范畴。
40.本发明还提供一种预测苹果属植物三叶苷性状有无的方法，利用上述引物对、基因芯片或试剂盒对苹果属植物进行检测。
41.本发明还提供一种预测苹果属植物三叶苷性状有无的方法，以苹果属植物的基因组dna为模板，以上述引物组为扩增引物，进行pcr扩增，indel分型，确定每个待测样品检测出的相应6bp indel基因型，包括：含有6bp缺失的纯和基因型(deln)；无6bp缺失的纯和基因型(-/-)和6bp indel位点为杂合基因型(-/deln)；若检测样品6bp indel基因型为deln和-/deln，表明待测样品含有三叶苷，若检测样品基因型为-/-，表明待测样品不含有三叶苷。
42.本发明公开的苹果属植物三叶苷有无性状相关的pgt2顺式作用原件区域的标记，为苹果属三叶苷特异种质或品种选育过程中的分子标记辅助选择提供一个新的分子标记，选择携带这种pgt2顺式作用原件区域突变标记的苹果属植物作为亲本进行杂交育种，然后获得杂交后代，克隆获得杂交后代中的pgt2顺式作用原件区域，研究其多态性；研究pgt2顺式作用原件区域标记与苹果属植物三叶苷有无性状的关系，从中筛选出含pgt2顺式作用原件区域的标记，基于pgt2顺式作用原件区域的分子标记可以很好地解决苹果属植物三叶苷育种过程中的生产占地面积大、选育周期长等上述问题，大幅提高育种选择效率及准确性。
43.与现有技术相比，本发明至少具有如下优势：
44.1)本发明发现一种全新的苹果属三叶苷分子标记，可应用在苹果属三叶苷分子标记辅助育种中。
45.2)本发明提供的检测方法在苗期就可以判断苹果属植物三叶苷有无这一性状，大副节省育种时间和占地面积，适于产业推广。
附图说明
46.为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
47.图1、16个苹果属植物pgt2启动子序列比对结果。其中，第1-6条序列是含有三叶苷的(品)种的pgt2启动子序列，第9-17序列是不含有三叶苷的(品)种的pgt2启动子序列，第7-8条序列(malus
‘
winter red
’‑
1/-2)为在冬红海棠(含有三叶苷)中克隆得到的两种序列，从上到下三个方框圈出的序列分别为-1305bp,-348bp的两个snp位点和-1139bp的6bp indel的位置。
48.图2、基于16个苹果属植物pgt2启动子序列多态性开发kasp分型引物。图中为16个苹果属植物中6bp indel附近106bp的pgt2启动子序列比对结果。三个线条分别指示的为：通用引物的位置、用于扩增含有6bp缺失的特异性引物、用于扩增无6bp缺失的c[t/c]agaa序列的特异性引物。
[0049]
图3、45个苹果属植物pgt2启动子区域6bp indel的分型散点图。图中，
‘
deln’为含有6bp缺失的纯和基因型；
‘‑
/deln’为6bp indel位点为杂合基因型；
‘‑
/
‑’
为无6bp缺失的纯和基因型，用表示；冬红海棠-1/-2为分别含有6bp缺失和不含有6bp缺失的两个质粒dna，做为对照。
具体实施方式
[0050]
下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0051]
以下术语或定义仅仅是为了帮助理解本发明而提供。这些定义不应被理解为具有小于本领域技术人员所理解的范围。
[0052]
除非在下文中另有定义，本发明具体实施方式中所用的所有技术术语和科学术语的含义意图与本领域技术人员通常所理解的相同。虽然相信以下术语对于本领域技术人员很好理解，但仍然阐述以下定义以更好地解释本发明。
[0053]
如本发明中所使用，术语“包括”、“包含”、“具有”、“含有”或“涉及”为包含性的(inclusive)或开放式的，且不排除其它未列举的元素或方法步骤。术语“由
…
组成”被认为是术语“包含”的优选实施方案。如果在下文中某一组被定义为包含至少一定数目的实施方案，这也应被理解为揭示了一个优选地仅由这些实施方案组成的组。
[0054]
在提及单数形式名词时使用的不定冠词或定冠词例如“一个”或“一种”，“所述”，包括该名词的复数形式。
[0055]
本发明中的术语“大约”、“大体”表示本领域技术人员能够理解的仍可保证论及特征的技术效果的准确度区间。该术语通常表示偏离指示数值的
±
10％，优选
±
5％。
[0056]
此外，说明书和权利要求书中的术语第一、第二、第三、(a)、(b)、(c)以及诸如此类，是用于区分相似的元素，不是描述顺序或时间次序必须的。应理解，如此应用的术语在适当的环境下可互换，并且本发明描述的实施方案能以不同于本发明描述或举例说明的其它顺序实施。
[0057]
下面为具体的实施例。实施例以苹果属植物三叶苷有无性状相关的分子标记及其辅助育种技术的建立为例，对本发明的技术内容进行详细说明。
[0058]
实施例1苹果属植物pgt2基因启动子序列多态性分析
[0059]
具体步骤如下：
[0060]
1、基因组dna提取：
[0061]
选取7个含有三叶苷的苹果属植物(表1中用单下划线标记的样品)和9个不含有三叶苷的苹果属植物(表1中用双下划线标记的样品)的幼嫩叶片，利用植物基因组提取试剂盒(tiangen)提取基因组dna。
[0062]
2、pgt2启动子克隆：
[0063]
利用设计合成的正向引物pgt2 pro-1946bp-f：5'-tggagtgtcagagctacaacaactat-3'和反向引物pgt2 pro-1946bp-r：5'-agactaagtgcccaattagcggt-3'进行pgt2启动子的克隆，克隆长度为1946bp。
[0064]
pcr反应体系为20ul:
[0065][0066]
pcr扩增程序如下：
[0067][0068]
pcr扩增产物用1％琼脂糖凝胶进行电泳，用dna纯化试剂盒(tiangelmidi purification kit，天根生物)回收目的片段。将回收目的片段连接到pmd19-t载体上(pmd19-t vector cloning kit,takara),并转化到dh5α大肠杆菌感受态细胞中，在氨苄青霉素的平板上过夜培养并挑取单克隆，进行菌液pcr筛选鉴定。对筛选出来的阳性克隆进行测序，获得16个苹果属植物pgt2启动子的序列。
[0069]
将测序结果用dnaman软件进行序列比对(图1)，发现在含有三叶苷的7个品种的pgt2启动子中，在-1139bp均有6bp缺失，且在-348bp均为g，在-1305bp均为t。而在不含有三叶苷的9个品种的pgt2启动子中-1139bp均无6bp缺失，且此处的序列为c[t/c]agaa，在-348bp均为t，在-1305bp均为g。同时，在含有三叶苷的冬红海棠中同时克隆得到以上两种序列。说明含有三叶苷的性状与pgt2启动子中-1139bp处的6bp缺失，-348bp的g,-1305bp的t密切相关，而不含有三叶苷的性状与pgt2启动子中-1139bp处的c[t/c]agaa序列，-348bp的t和-1305bp的g密切相关。
[0070]
经分析，以寒富基因组hfth1.genome为参考，上述的一个6bp indel分子标记位于苹果参考基因组(hfth1.genome)第7号染色体的第33730856号碱基处(对应pgt2基因起始密码子atg上游第1139bp处)，两个snp分子标记分别位于苹果参考基因组(hfth1.genome)第7号染色体的第33730065号碱基处(对应pgt2基因起始密码子atg上游第348bp处)和33731022号碱基处(对应pgt2基因起始密码子atg上游第1305bp处)。
[0071]
以寒富参考基因组(hfth1.genome)中启动子克隆片段的参考序列seq id no:1为例，对应indel和snp如下单下划线处所示，起始密码子atg如下双划线所示。
[0072][0073][0074]
实施例2基于pgt2启动子序列多态性开发用于鉴定苹果属植物三叶苷有无的kasp分型引物
[0075]
基于pgt2启动子序列多态性，在6bp indel附近约100bp范围内，针对6bp indel位点的两种序列，分别设计两个上游pcr引物,一个用于特异性扩增无6bp缺失且带有fam荧光的引物primer_allelefam:5'-gttcatttmtttttttgwtttctgggtttc-3'(seq id no.2)，一个用于特异性扩增含有6bp缺失且带有hex荧光的引物primer_allelehex:5'-gttcatttmtttttttgwtttctgggtttt-3'(seq id no.3)和1个无荧光的通用下游引物primer_common:5'-gtgaagattartgagtcaaaatagagtgta-3'(seq id no.4)(图2)。
[0076]
实施例3利用基于pgt2启动子序列多态性开发的kasp分型引物进行苹果属植物有无三叶苷的性状筛查
[0077]
1、基因组dna提取
[0078]
对45个苹果属植物的幼嫩叶片进行基因组dna的提取，并进行dna质检。
[0079]
2、indel分型
[0080]
1)配置pcr扩增反应体系mix，用移液器将配置的反应体系从芯片入口注入到芯片里，并密封进出口；
[0081]
2)将芯片放入到离心机中4000rpm离心1min；
[0082]
3)放入芯片热封仪中进行热封1s；
[0083]
4)放入平板pcr仪上进行扩增反应，pcr扩增程序如下。
[0084]
pcr反应体系
[0085][0086][0087]
pcr扩增程序
[0088][0089]
3.数据采集
[0090]
pcr扩增程序运行结束后，将芯片放入luxscan-10k/d扫描仪，进行扫描，生成tif文件，通过软件转换成数据信号值，然后再通过分型软件snptyper进行分型。
[0091]
4.分型结果
[0092]
将扫描图片的原始数据导入snptyper软件中，可输出每个位点snp分型结果。通过使用该kasp分型引物，被检测的包括上述用来克隆pgt2启动子的16个品种在内的45个苹果属植物在6bpindel位点被分成三种基因型，分别为含有6bp缺失的纯和基因型(deln)，不含有6bp缺失的纯和基因型(-/-)和6bp indel位点为杂合基因型(-/deln)。其中，冬红海棠-1/-2为在冬红海棠中克隆得到的两种pgt2启动子，冬红海棠-1为不含有6bp缺失，在6bp indel位点为c[t/c]agaa序列的pgt2启动子序列，而冬红海棠-2为含有6bp缺失的pgt2启动
子序列。实验中，以冬红海棠-1/-2分别作为对照，发现冬红海棠-1为不含有6bp缺失的纯和基因型(-/-)，冬红海棠-2为含有6bp缺失的纯和基因型(deln)，冬红海棠dna检测结果为杂合基因型(-/deln)，这与克隆测序结果一致，说明该基因分型结果正确可靠。通过基因分型，18个含有三叶苷的样品中1-8为含有6bp缺失的纯和基因型(deln)，9-18在6bp indel位点为杂合基因型(-/deln)。19-45共27个不含有三叶苷的样品均为不含有6bp缺失的纯和基因型(-/-)。45个苹果属植物的名称、基因分型结果和有无三叶苷性状的具体信息如(表1)所示。其中，用于pgt2启动子序列克隆的16个品种的分型结果也与之前克隆测序结果一致。表明，pgt2启动子区域6bp indel位点多态性与三叶苷有无紧密连锁，可用于三叶苷形状的分析检测。
[0093]
表1.45个苹果属植物pgt2启动子区域6bp indel的基因分型结果与有无三叶苷的关系。表中，
‘
+’表示含有三叶苷，
‘‑’
表示不含有三叶苷。
‘
deln’表示含有6bp缺失的纯和基因型；
‘‑
/deln’表示6bp indel位点为杂合基因型；
‘‑
/
‑’
表示无6bp缺失的纯和基因型；冬红海棠-1/-2为分别含有6bp缺失和不含有6bp缺失，序列为ctagaa的两个质粒dna，做为对照。其中，序号用单下划线和双下划线标记的为前面用于pgt2启动子克隆的16个样品。
[0094]
[0095][0096]
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及
各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。