杂环化合物及其制备方法、药物组合物和应用与流程

1.本发明属于药物化学领域，具体涉及一类杂环化合物、该类化合物及其中间体的制备方法、包含该类化合物的药物组合物及其在医药领域中的应用。


背景技术：

2.酪氨酸磷酸酶shp2由两个n-末端src同源2结构域(n-sh2和c-sh2)和一个蛋白酪氨酸磷酸酶催化结构域(ptp)构成。在基础状态下，n-sh2能够与ptp结合形成一个环状结构，从而阻碍ptp与底物的结合，使得酶催化活性被抑制；当上游受体蛋白的酪氨酸被磷酸化后，n-sh2与之相结合，ptp催化域得到释放，从而发挥出磷酸酶活性。
3.在细胞水平上，shp2通过在诸多受体酪氨酸激酶的细胞质下游的功能作用，参与多个肿瘤细胞信号传导通路，如rtk/ras/mapk、jak/stat和pb3k/akt等。通过对这些激酶以及信号通路的调控作用，shp2与许多重要的细胞生命活动密切相关，如细胞增殖、迁移、分化、死亡、细胞因子的调控及肿瘤发生等等。
4.同时，shp2也参与程序性死亡受体1(pd1)介导的免疫系统抑制。t细胞的pd-1与pd-l1结合后，在细胞内能够招募大量的shp2。shp2能够将t细胞内抗原受体通路蛋白去磷酸化，从而抑制t细胞的激活。因此，抑制shp2的活性能够在肿瘤微环境中逆转免疫抑制。
5.作为一类重要的细胞信号因子，shp2突变与多种疾病密切相关。研究发现，在神经母细胞瘤、aml(4％)、乳腺癌、nsclc(10％)、肺腺癌(30％)、食道癌、头颈部肿瘤、黑色素瘤和胃癌中存在shp2突变。
6.目前已有多个shp2变构抑制剂进入临床研究阶段，如novartis公司开发的tno-155，revolution medicine公司开发的rmc-4630，以及北京加科思的jab-3068等化合物都已经进入临床研究阶段，但还没有一款开发上市的shp2抑制剂，用于制备治疗努南综合征、豹皮综合征、白血病、成神经细胞瘤、黑色素瘤、乳腺癌、食道癌、头颈部肿瘤、肺癌及结肠癌。因此，迫切需要开发一类成药性好的shp2抑制剂药物。


技术实现要素：

7.发明要解决的问题
8.本发明旨在提供一类全新的用作shp2抑制剂的杂环化合物，其表现出对肿瘤细胞很好的抑制活性，且成药性好，具有广阔的药物开发前景。而且，该类化合物的制备方法简单，有利于工业化生产。
9.用于解决问题的方案
10.第一方面，本发明提供了一种如式i所示的化合物或其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、立体异构体、互变异构体、代谢产物或前药，其中
[0011][0012]
x1、x2和x3各自独立地选自cr5和n，或不存在；
[0013]
当x1、x2和x3各自独立地选自cr5和n时，x5和x6各自独立地选自c和n，x7为cr5或n；
[0014]
当x1、x2和x3不存在时，x5、x6和x7各自独立地选自cr5和n；
[0015]
x4为c或n；
[0016]
x8为n或nr5；
[0017]
r1、r2、r3、r4、r6和r7各自独立地选自氢、卤素、羟基、氨基、氧代基、氰基、c
2-c8烯基、c
2-c8炔基、醛基、氨基甲酰基、c
1-c8烷基、c
1-c8杂烷基、c
3-c8环烷基、c
3-c8杂环烷基、c
1-c8烷氧基和c
1-c3卤代烷氧基，其中所述c
1-c8烷基、c
1-c8杂烷基、c
3-c8环烷基、c
3-c8杂环烷基、c
1-c8烷氧基和c
1-c3卤代烷氧基各自任选地被一个或多个r5取代；
[0018]
若存在，每一个r5各自独立地选自氢、卤素、羟基、氨基、氰基、氨基甲酰基、c
1-c3烷基、c
1-c3杂烷基、c
3-c8环烷基、c
3-c8杂环烷基、c
1-c3烷氧基和c
1-c3卤代烷氧基，其中所述c
1-c3烷基、c
1-c3杂烷基、c
3-c8环烷基、c
3-c8杂环烷基、c
1-c3烷氧基和c
1-c3卤代烷氧基各自任选地被一个或多个r8取代；
[0019]
若存在，每一个r8各自独立地选自氢、卤素、羟基、氨基和氰基；
[0020]
a和b各自独立地选自c
3-c8环烷基、c
3-c8杂环烷基、c
6-c
10
芳基和c
5-c
12
杂芳基；
[0021]
其中所述杂烷基、杂环烷基和杂芳基中的杂原子或杂原子团各自独立地选自-c(＝o)nh-、-nh-、-n＝、-o-、-s-、-c(＝o)o-、-c(＝o)-、-c(＝s)-、-s(＝o)-、-s(＝o)
2-和-nhc(＝o)nh-，所述杂烷基、杂环烷基和杂芳基中的杂原子或杂原子团的数目各自独立地选自1、2和3；
[0022]
n为1、2或3。
[0023]
具体地，如式i所示的化合物为如式i-1或式i-2所示的化合物，其中
[0024][0025]
x5、x6和x7各自独立地选自cr5和n；
[0026]
x8、r1、r2、r3、r4、r5、r6、b和n如式i所定义。
[0027]
优选地，在如式i-1或式i-2所示的化合物中，
[0028]
x5、x6和x7各自独立地选自cr5和n；
[0029]
x8为n或nr5；
[0030]
r1为氢、氨基、氧代基或c
1-c8烷基，其中所述c
1-c8烷基任选地被一个或多个r5取代；
[0031]
r2为氢；
[0032]
r3为氢或羟基；
[0033]
每一个r4各自独立地选自氢、卤素和c
1-c8烷基，其中所述c
1-c8烷基任选地被一个或多个r5取代；
[0034]
r6为氢；
[0035]
若存在，每一个r5各自独立地选自氢、氨基、氨基甲酰基、c
1-c3烷基和c
1-c3杂烷基，其中所述c
1-c3烷基、c
1-c3杂烷基、c
3-c8环烷基、c
3-c8杂环烷基、c
1-c3烷氧基和c
1-c3卤代烷氧基各自任选地被一个或多个r8取代；优选地，若存在，每一个r5各自独立地选自氢、氨基、氨基甲酰基和c
1-c3烷基，其中所述c
1-c3烷基任选地被一个或多个r8取代；
[0036]
若存在，每一个r8各自独立地选自氢和羟基；
[0037]
b为c
3-c8环烷基、c
3-c8杂环烷基、c
6-c
10
芳基和c
5-c
12
杂芳基；
[0038]
其中所述杂烷基、杂环烷基和杂芳基中的杂原子或杂原子团各自独立地选自-c(＝o)nh-、-nh-、-n＝、-o-、-s-、-c(＝o)o-、-c(＝o)-、-c(＝s)-、-s(＝o)-、-s(＝o)
2-和-nhc(＝o)nh-，所述杂烷基、杂环烷基和杂芳基中的杂原子或杂原子团的数目各自独立地选
自1、2和3；优选地，所述杂环烷基和杂芳基中的杂原子或杂原子团各自独立地选自-c(＝o)nh-、-nh-、-n＝、-o-、-s-、-c(＝o)o-、-c(＝o)-、-c(＝s)-、-s(＝o)-、-s(＝o)
2-和-nhc(＝o)nh-，所述杂环烷基和杂芳基中的杂原子或杂原子团的数目各自独立地选自1、2和3；
[0039]
n为1、2或3。
[0040]
更优选地，在如式i-1或式i-2所示的化合物中，
[0041]
结构中的片段选自下列片段中的任意一种：
[0042][0043]
甚至更优选地，结构中的片段选自下列片段中的任意一种：
[0044][0045]
或者甚至更优选地，结构中的片段选自下列片段中的任意一种：
[0046][0047]
具体地，如式i所示的化合物为如式i-3或式i-4所示的化合物，其中
[0048][0049]
x1、x2和x3各自独立地选自cr5或n，x5和x6各自独立地选自c和n，x7为cr5或n；
[0050]
x8、r1、r2、r3、r4、r5、r6、b和n如式i所定义。
[0051]
优选地，在如式i-3或式i-4所示的化合物中，
[0052]
x1、x2和x3各自独立地选自cr5或n，x5和x6各自独立地选自c和n，x7为cr5或n；
[0053]
x8为n或nr5；
[0054]
r1为氢或c
1-c8烷基，其中所述c
1-c8烷基任选地被一个或多个r5取代；
[0055]
r2为氢；
[0056]
r3氢或羟基；
[0057]
每一个r4各自独立地选自氢、卤素和c
1-c8烷基，其中所述c
1-c8烷基任选地被一个或多个r5取代；
[0058]
r6为氢；
[0059]
若存在，每一个r5各自独立地选自氢和c
1-c3烷基；
[0060]
b为c
3-c8环烷基、c
3-c8杂环烷基、c
6-c
10
芳基和c
5-c
12
杂芳基；
[0061]
其中所述杂环烷基和杂芳基中的杂原子或杂原子团各自独立地选自-c(＝o)
nh-、-nh-、-n＝、-o-、-s-、-c(＝o)o-、-c(＝o)-、-c(＝s)-、-s(＝o)-、-s(＝o)
2-和-nhc(＝o)nh-，所述杂环烷基和杂芳基中的杂原子或杂原子团的数目各自独立地选自1、2和3；
[0062]
n为1、2或3。
[0063]
更优选地，在如式i-3或式i-4所示的化合物中，
[0064]
结构中的片段选自下列片段中的任意一种：
[0065][0066]
甚至更优选地，结构中的片段选自下列片段中的任意一种：
[0067][0068]
进一步优选地，在如式i-1、式i-2、式i-3或式i-4所示的化合物中，
[0069]
结构中的片段选自下列片段中的任意一种：
[0070][0071]
甚至进一步优选地，结构中的片段选自下列片段中的任意一种：
[0072][0073]
第二方面，本发明提供了如式i、式i-1、式i-2、式i-3或式i-4所示的具体化合物，
其选自：
[0074]
(1)(s)-n-(3-(3-氨基-5-(5-氨基-5,7-二氢螺[环戊二烯并[b]吡啶-6,4'-哌啶]-1'-基)吡嗪-2-基硫基)-2-氯苯基)-2-羟基-4-氧代-6,7,8,9-四氢-4h-吡啶并[1,2-a]嘧啶-3-甲酰胺；
[0075]
(2)(s)-n-(3-(5-(5-氨基-5,7-二氢螺[环戊二烯并[b]吡啶-6,4'-哌啶]-1'-基)咪唑并[1,2-c]嘧啶-8-基硫基)-2-氯苯基)-2-羟基-4-氧代-6,7,8,9-四氢-4h-吡啶并[1,2-a]嘧啶-3-甲酰胺；
[0076]
(3)(s)-n-(3-(5-(5-氨基-5,7-二氢螺[环戊二烯并[b]吡啶-6,4'-哌啶]-1'-基)-7-甲基咪唑并[1,2-c]嘧啶-8-基硫基)-2-氯苯基)-2-羟基-4-氧代-6,7,8,9-四氢-4h-吡啶并[1,2-a]嘧啶-3-甲酰胺；
[0077]
(4)(s)-n-(3-(4-氨基-2-(5-氨基-5,7-二氢螺[环戊二烯并[b]吡啶-6,4'-哌啶]-1'-基)-1-甲基-6-氧代-1,6-二氢嘧啶-5-基硫基)-2-氯苯基)-2-羟基-4-氧代-6,7,8,9-四氢-4h-吡啶并[1,2-a]嘧啶-3-甲酰胺；
[0078]
(5)(s)-n-(3-(3-氨基-5-(5-氨基-5,7-二氢螺[环戊二烯并[b]吡啶-6,4'-哌啶]-1'-基)吡嗪-2-基硫基)-2-氯苯基)-4-氧代-6,7,8,9-四氢-4h-吡啶并[1,2-a]嘧啶-3-甲酰胺；
[0079]
(6)(s)-n-(3-(3-氨基-5-(5-氨基-5,7-二氢螺[环戊二烯并[b]吡啶-6,4'-哌啶]-1'-基)吡嗪-2-基硫基)-2-甲基苯基)-2-羟基-4-氧代-6,7,8,9-四氢-4h-吡啶并[1,2-a]嘧啶-3-甲酰胺；
[0080]
(7)(s)-n-(3-(3-氨基-5-(5-氨基-5,7-二氢螺[环戊二烯并[b]吡啶-6,4'-哌啶]-1'-基)吡嗪-2-基硫基)-5-氟-2-甲基苯基)-2-羟基-4-氧代-6,7,8,9-四氢-4h-吡啶并[1,2-a]嘧啶-3-甲酰胺；
[0081]
(8)(s)-3-(5-氨基-5,7-二氢螺[环戊二烯并[b]吡啶-6,4'-哌啶]-1'-基)-6-(2-氯-3-(2-羟基-4-氧代-6,7,8,9-四氢-4h-吡啶并[1,2-a]嘧啶-3-甲酰胺基)苯基硫基)吡嗪-2-甲酸乙酯；
[0082]
(9)(s)-3-(5-氨基-5,7-二氢螺[环戊二烯并[b]吡啶-6,4'-哌啶]-1'-基)-6-(2-氯-3-(2-羟基-4-氧代-6,7,8,9-四氢-4h-吡啶并[1,2-a]嘧啶-3-甲酰胺基)苯基硫基)吡嗪-2-甲酸；
[0083]
(10)(s)-n-(3-(5-(5-氨基-5,7-二氢螺[环戊二烯并[b]吡啶-6,4'-哌啶]-1'-基)-6-氨基甲酰基吡嗪-2-基硫基)-2-氯苯基)-2-羟基-4-氧代-6,7,8,9-四氢-4h-吡啶并[1,2-a]嘧啶-3-甲酰胺；
[0084]
(11)(s)-3-(5-氨基-5,7-二氢螺[环戊二烯并[b]吡啶-6,4'-哌啶]-1'-基)-6-(2-氯-3-(2-羟基-4-氧代-6,7,8,9-四氢-4h-吡啶并[1,2-a]嘧啶-3-甲酰胺基)苯基硫基)-5-甲基吡嗪-2-甲酸乙酯；和
[0085]
(12)(s)-n-(3-(5-(5-氨基-5,7-二氢螺[环戊二烯并[b]吡啶-6,4'-哌啶]-1'-基)-6-氨基甲酰基-3-甲基吡嗪-2-基硫基)-2-氯苯基)-2-羟基-4-氧代-6,7,8,9-四氢-4h-吡啶并[1,2-a]嘧啶-3-甲酰胺。
[0086]
第三方面，本发明提供了如式i所述的化合物的制备方法，其包括下列步骤：
[0087]
1)化合物a与化合物b反应，得到化合物c；
[0088][0089]
2)化合物c与化合物d反应，得到化合物e；和
[0090][0091]
3)化合物e与化合物f反应，得到目标产物；
[0092][0093]
其中
[0094]
lg1和lg2各自独立地选自氯和溴，lg3为氯、溴或羟基；
[0095]
x1、x2、x3、x4、x5、x6、x7、x8、r1、r2、r3、r4、r6、r7、a、b和n如式i所定义。
[0096]
在上述制备方法中，化合物a和化合物b可以在催化剂(例如钯催化剂，如pd2(dba)3)、配体(例如xantphos)和碱(例如有机碱，如diea；又如无机碱，如碳酸铯)存在的条件下反应，得到化合物c；化合物c和化合物d可以在碱和缩合剂(例如hatu、hbtu、edct/hobt等)存在的条件下反应(例如缩合反应)，得到化合物e；化合物e和化合物f在碱(例如有机碱，如diea；又如无机碱，如碳酸钾、碳酸铯、叔丁醇钠等)存在的条件下反应，得到式i化合物。
[0097]
本发明对于上述制备方法中各步骤所使用的反应溶剂没有特别限制，任何在一定程度上能够溶解起始原料并且不抑制反应的溶剂(例如dmf、dmso、nmp等)均包含在本发明的范围之中。另外，本领域的许多类似改动或等同替换或者相应的溶剂组合，均视为包含在本发明的范围之中。
[0098]
第四方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含如式i、式i-1、式i-2、式i-3或式i-4所示的化合物或其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、立体异构体、互变异构体、代谢产物或前药，和至少一种药学上可接受的辅料。
[0099]
第五方面，本发明提供了如式i、式i-1、式i-2、式i-3或式i-4所示的化合物或其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、立体异构体、互变异构体、代谢产物或前药或者包含其
的药物组合物，其用作shp2抑制剂或者用于预防和/或治疗与shp2活性异常相关的疾病或病症。
[0100]
第六方面，本发明提供了如式i、式i-1、式i-2、式i-3或式i-4所示的化合物或其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、立体异构体、互变异构体、代谢产物或前药或者包含其的药物组合物在制备用于预防和/或治疗与shp2活性异常相关的疾病或病症的药物中的应用。
[0101]
第七方面，本发明提供了一种用于预防和/或治疗与shp2活性异常相关的疾病或病症的方法，其包括将预防和/或治疗有效量的如式i、式i-1、式i-2、式i-3或式i-4所示的化合物或其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、立体异构体、互变异构体、代谢产物或前药或者包含其的药物组合物施用于对其有需要的个体。
[0102]
优选地，在上述医药用途中，所述与shp2活性异常相关的疾病或病症选自努南综合征、豹皮综合征、白血病、成神经细胞瘤、黑色素瘤、乳腺癌、食道癌、肺癌、结肠癌、头颈部肿瘤、胃癌、间变性大细胞淋巴瘤和成胶质细胞瘤，优选非小细胞肺癌、食管癌和头颈部肿瘤。
[0103]
发明的效果
[0104]
本发明中的杂环化合物是一类新颖的变构抑制剂，能够通过与shp2非催化区域的结合并“锁”住shp2活性很弱的基础状态，从而达到抑制其活性的目的。本发明中的杂环化合物克服了ptp催化区域抑制剂普遍存在的选择性和成药性差等缺点，表现出优良的生物活性及可成药性，极具药物开发前景。
[0105]
另外，在相同条件的shp2酶活性抑制实验、磷酸化蛋白激酶(p-erk)细胞实验、nci-h358细胞抗增殖实验、mv-4-11细胞抗增殖实验等评价体系中，与已知化合物rmc4550及tno155相比，本发明的化合物表现出更优越的药理活性及药代性质。
具体实施方式
[0106]
一般术语和定义
[0107]
除非有相反陈述，否则在本发明中所使用的术语具有下述含义。
[0108]“烷基”是指饱和的脂族烃基团，包括1至20个碳原子的直链和支链基团，例如可以是1至18个碳原子、1至12个碳原子、1至8个碳原子、1至6个碳原子或1至4个碳原子的直链和支链基团。在本发明中，“烷基”可以是一价的、二价的或三价基团。非限制性实例包括但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、仲丁基、正戊基、1,1-二甲基丙基、1,2-二甲基丙基、2,2-二甲基丙基、1-乙基丙基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、正己基、1-乙基-2-甲基丙基、1,1,2-三甲基丙基、1,1-二甲基丁基、1,2-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基、2-乙基丁基及其各种支链异构体等。非限制性实例还包括但不限于亚甲基、次甲基、亚乙基、次乙基、亚丙基、次丙基、亚丁基、次丁基及其各种支链异构体。另外，在本发明中，“烷基”可以是任选取代的或未取代的。
[0109]“杂烷基”是指饱和的脂族烃基团，包括1至20个碳原子的直链和支链基团，例如可以是1至18个碳原子、1至12个碳原子、1至8个碳原子、1至6个碳原子或1至4个碳原子的直链和支链基团，上述直链或支链碳链被一个或多个(例如，1个、2个、3个等)杂原子或杂原子团间隔，并通过杂原子或杂原子团连接，上述杂原子或杂原子团选自-c(＝o)nh-、-nh-、-n
＝、-o-、-s-、-c(＝o)o-、-c(＝o)-、-c(＝s)-、-s(＝o)-、-s(＝o)
2-和-nhc(＝o)nh-。在本发明中，“杂烷基”可以是一价的、二价的或三价基团。非限制性实例包括但不限于被-c(＝o)o-间隔的c
1-c3杂烷基，例如羧基(c1杂烷基)、甲氧羰基(c2杂烷基)、乙氧羰基(c3杂烷基)等，或者被-c(＝o)nh-间隔的c
1-c3杂烷基，例如氨基甲酰基(c1杂烷基)、甲氨基甲酰基(c2杂烷基)、乙氨基甲酰基(c3杂烷基)等。另外，在本发明中，“杂烷基”可以是任选取代的或未取代的。
[0110]“环烷基”是指饱和或部分不饱和的、单环或多环的脂族烃基团，包括3至12个环原子，例如可以是3至12个、3至10个或3至6个环原子(即3至6元环)。单环环烷基的非限制性实例包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基、环戊烯基、环己基、环己烯基、环己二烯基、环庚基、环庚三烯基、环辛基等。在本发明中，“环烷基”可以是任选取代的或未取代的。
[0111]“杂环烷基”是指饱和或部分不饱和的、单环或多环的脂族烃基团，包括3至20个环原子，例如可以是3至16个、3至12个、3至10个或3至6个环原子，其中一个或多个环原子为选自氮、氧或s(o)m(其中m为0、1或2)的杂原子，其余环原子为碳。优选杂环烷基包括3至12个环原子，其中1至4个环原子是杂原子，更优选包括3至10个环原子，最优选包括5或6个环原子，其中1至4个，优选1至3个，更优选1至2个是杂原子。单环杂环烷基的非限制性实例包括但不限于吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基、吗啉基、硫代吗啉基、高哌嗪基等。多环杂环烷基的非限制性实例包括但不限于螺环或桥环的杂环烷基。
[0112]“卤素”是指氟、氯、溴和碘，优选氟、氯和溴。
[0113]“任选”或“任选地”意味着随后所描述地事件或环境可以但不必发生，该说明包括该事件或环境发生或不发生的情形。例如，“任选被烷基取代的杂环基团”意味着烷基可以但并非必须存在，该说明包括杂环基团被烷基取代的情形和杂环基团不被烷基取代的情形。
[0114]“取代的”是指基团中的一个或多个氢原子，优选最多5个，更优选1至3个氢原子彼此独立地被相应数目的取代基取代。
[0115]“药学上可接受的盐”是指由本发明中的化合物与相对无毒的酸或碱制备得到的盐。
[0116]“药物组合物”是指可供药用的组合物，其包含一种或多种如式i所示的化合物或其药学上可接受的形式(例如盐、水合物、溶剂化物、立体异构体、互变异构体、代谢产物、前药等)，以及其他组分(例如药学上可接受的辅料)。
[0117]
在本发明中，“药学上可接受的辅料”是指在药物生产领域中广泛采用的辅助物料。使用辅料的主要目的在于提供一种使用安全、性质稳定和/或具有特定功能性的药物组合物，还在于提供一种方法，以便在为受试者施用药物之后，活性成分能够以所期望的速率溶出，或者促进活性成分在接受给药的受试者体内得到有效吸收。药学上可接受的辅料可以是具有惰性的填充剂，也可以是为药用组合物提供某种功能(例如稳定组合物的整体ph值或防止组合物中活性成分的降解)的功效成分。药学上可接受的辅料的非限制性实例包括但不限于粘合剂、助悬剂、乳化剂、稀释剂(或填充剂)、成粒剂、胶粘剂、崩解剂、润滑剂、抗粘着剂、助流剂、润湿剂、胶凝剂、吸收延迟剂、溶解抑制剂、增强剂、吸附剂、缓冲剂、螯合剂、防腐剂、着色剂、矫味剂、甜味剂等。
[0118]
本发明中的药物组合物可以使用本领域技术人员已知的任何方法来制备。例如，
常规混合、溶解、造粒、乳化、磨细、包封、包埋和/或冻干工艺。
[0119]
在本发明中，使用药物组合物的目的在于促进针对生物体的给药，有利于活性成分的吸收，进而发挥生物活性。本发明的药物组合物可以通过任何形式给药，包括注射(动脉内、静脉内、肌肉内、腹膜内、皮下)、粘膜、口服(口服固体制剂、口服液体制剂)、直肠、吸入、植入、局部(例如眼部)给药等。口服固体制剂的非限制性实例包括但不限于散剂、胶囊剂、锭剂、颗粒剂、片剂等。口服或粘膜给药的液体制剂的非限制性实例包括但不限于混悬剂、酊剂、酏剂、溶液剂等。局部给药制剂的非限制性实例包括但不限于乳剂、凝胶剂、软膏剂、乳膏剂、贴剂、糊剂、泡沫剂、洗剂、滴剂或血清制剂。胃肠外给药制剂的非限制性实例包括但不限于注射用溶液剂、注射用干粉剂、注射用悬浮液、注射用乳剂等。本发明的药物组合物还可以制成控制释放或延迟释放剂型(例如脂质体或微球)。
[0120]
优选地，本发明中的化合物或包含其的药物组合物以口服或静脉内给药的方式施用于对其有需要的个体。取决于给药对象的具体情况，也可以应用甚至优选其它施用途经。例如，对于健忘或对口服药物易发怒的患者，经皮施用将是非常重要的给药方式。在本发明中，施用途经能够以任何适用的方式进行变化或调整，以满足药物的性质、患者和医务人员的便利以及其它相关因素的需求。
[0121]
本发明的化合物或其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、立体异构体、互变异构体、代谢产物或前药或者包含其的药物组合物具有优良的shp2酶活性及细胞增殖抑制活性，能够作为shp2抑制剂，用于预防和/或治疗与shp2活性异常相关的(或者由shp2异常突变引起的)疾病或病症，具有良好的临床应用和医药用途。优选地，与shp2活性异常相关的(或者由shp2异常突变引起的)疾病或病症的非限制性实例包括但不限于努南综合征、豹皮综合征、白血病(例如青少年髓单核细胞白血病、急性髓性白血病)、成神经细胞瘤、黑色素瘤、乳腺癌、食道癌、肺癌、结肠癌、头颈部肿瘤、胃癌、间变性大细胞淋巴瘤、成胶质细胞瘤等，优选非小细胞肺癌、食管癌和头颈部肿瘤。
[0122]
以下将结合具体实施例来阐述本发明的技术方案，下列实施例的提供旨在进一步说明本发明，而非用于限制本发明的范围。对本领域技术人员而言，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，针对本发明的具体实施方式进行各种变化和改进将是显而易见的。
[0123]
本发明的化合物的制备可以通过本领域技术人员所熟知的合成方法来实现，包括但不限于下面列举的具体实施方式、其与其他化学合成方法相结合而形成的实施方式以及本领域技术人员所熟知的等同替换方式，优选的实施方式包括但不限于本发明的实施例。本发明中所使用的已知的起始原料可以提供本领域已知的方法来合成，或者通过常规的商业手段来购买(例如购自韶远化学科技、北京偶合科技等公司)。如无特殊说明，反应均在氩气氛或氮气氛下进行。氢化反应通常抽真空，充入氢气，反复操作3次。反应的温度为室温，温度范围是20℃-30℃。反应进程的监测可以通过本领域技术人员所熟知的合成方法来实现，包括但不限于薄层色谱法(tlc)。薄层层析硅胶板使用青岛海洋gf254硅胶板，展开剂体系包括但不限于a：二氯甲烷和甲醇体系；b：石油醚和乙酸乙酯体系，溶剂的体积比可以根据化合物的极性进行调节。
[0124]
本发明的化合物的分离纯化可以通过本领域技术人员所熟知的合成方法来实现，包括但不限于柱色谱法(cc)、高效液相色谱法(hplc)、超高效液相色谱法(uplc)等。柱色谱法一般使用青岛海洋200-300目硅胶作为载体，洗脱剂体系包括但不限于a：二氯甲烷和甲
醇体系；b：石油醚和乙酸乙酯体系，溶剂的体积比可以根据化合物的极性进行调节，也可以加入少量的酸性或碱性防拖尾试剂进行调节。hplc图谱采用agilent1200dad hplc色谱仪(色谱柱：sunfire c18,150
×
4.6mm,5μm)或waters 2695-2996hplc色谱仪(色谱柱：gimini c18,150
×
4.6mm,5μm)测定。
[0125]
本发明的化合物的结构鉴定可以通过本领域技术人员所熟知的方法来实现，包括但不限于核磁共振(nmr)、质谱(ms)等。nmr图谱采用bruker avance-400或varian oxford-300核磁仪测定，测定溶剂为氘代二甲基亚砜(dmso-d6)、氘代氯仿(cdc13)或氘代甲醇(cd3od)，内标为四甲基硅烷(tms)，化学位移以10-6
(ppm)计。ms图谱采用agilent sqd(esi)质谱仪(型号：6110)或shimadzu sqd(esi)质谱仪(型号：2020)测定。
[0126]
中间体的合成
[0127]
中间体q1的合成
[0128][0129]
第一步：合成q1-2
[0130]
将化合物q1-1(100g,495mmol)加入到dme(1000ml)中，降温到-10℃后，加入氯甲酸异丁酯(67.6g,495mmol)和4-甲基吗啉(50g,495mmol)，室温反应5h，tlc监测反应结束后，过滤，用dme(250ml)过滤洗涤固体，然后将滤液加入到2l三口瓶中，加入硼氢化钠(37.6g,990mmol)处理滤液，室温下搅拌30min，再缓慢滴加甲醇(250ml)，继续室温反应3h，tlc监测反应完成，将反应液旋干后，加入水(1500ml)，水相用dcm萃取(300ml
×
3)，合并有机相后，有机相依次用水和饱和氯化钠溶液洗涤，再将有机相干燥，旋干后得到化合物q1-2(86.5g,白色固体)，产率93％。粗品未经纯化，直接用于下一步反应。
[0131]
第二步：合成q1-3
[0132]
将化合物q1-2(25g,133mmol)加入到dcm(250ml)中，再加入tea(26.9g,266mmol)，冰浴下滴加mscl(18.3g,156mmol)，然后室温下反应1h。tlc显示反应结束后，将反应液用dcm稀释，依次用水和饱和氯化钠溶液洗涤，再将有机相干燥，浓缩旋干，残余物过硅胶层析柱(洗脱剂：v
石油醚
:v
乙酸乙酯
＝3:1～1:1)纯化，得到化合物q1-3(33.6g,无色透明液体)，产率95％。
[0133]
ms(esi):m/z 266[m+h]
+
。
[0134]
第三步：合成q1-4
[0135]
将n-叔丁氧羰基-4-氰基哌啶(28g,130mmol)加入到thf(300ml)中，冷却到-78℃
后，缓慢滴加2.0m的lda(75ml,150mmol)，滴加完成后，继续保持-78℃反应1.5h，然后滴加化合物q1-3(26.6,100mmol)的thf溶液(150ml)，滴加完成后，继续保持-78℃反应3h，tlc显示反应结束后，滴加饱和氯化铵溶液(50ml)淬灭反应，并加入饱和氯化钠溶液(500ml)，分出有机相，水相再用乙酸乙酯萃取(150ml
×
3)，合并有机相，再用无水硫酸钠干燥，过滤，旋干浓缩，残余物过硅胶层析柱(洗脱剂：v
石油醚
:v
乙酸乙酯
＝10:1～1:1)纯化，得到化合物q1-4(25.7g,白色固体)，产率67.6％。
[0136]
ms(esi):m/z 380[m+h]
+
。
[0137]
第四步：合成q1-5
[0138]
将化合物q1-4(25g,65.8mmol)加入到dma(200ml)和水(20ml)的混合溶剂中，再加入三乙胺(33.2g,329mmol)和催化剂pd(amphos)cl2(4.6g,6.6mmol,cas:887919-35-9)，氮气保护下于130℃反应4h。tlc显示反应结束后，将反应液冷却，并加入水稀释(800ml)，水相用乙酸乙酯萃取(200ml
×
3)，合并有机相，用饱和食盐水洗涤(200ml
×
2)，无水硫酸钠干燥，过滤，旋干浓缩，残余物过硅胶层析柱(洗脱剂：v
石油醚
:v
乙酸乙酯
＝3:1～1:1)纯化，得到化合物q1-5(14.6g,白色固体)，产率73％。
[0139]
ms(esi):m/z 303[m+h]
+
。
[0140]
第五步：合成q1-6
[0141]
将化合物q1-5(10g,33mol)加入到钛酸四乙酯(100ml)中，然后再加入(r)-(+)-叔丁基亚磺酰胺(4.8g,40ml)，升温到90℃反应3h，tlc显示反应完成后，冷却到室温，将反应液缓慢加入到冰水(500ml)中，水相用二氯甲烷萃取(150ml
×
3)，合并有机相，用饱和食盐水洗涤(100ml
×
2)，无水硫酸钠干燥，过滤，旋干浓缩，残余物过硅胶层析柱(洗脱剂：v
石油醚
:v
乙酸乙酯
＝3:1～1:1)纯化，得到化合物q1-6(12g,黄色固体)，产率89.6％。
[0142]
ms(esi):m/z 406[m+h]
+
。
[0143]
第六步：合成q1-7
[0144]
将化合物q1-6(10g,24.6mmol)加入到四氢呋喃(100ml)中，降温到-78℃后缓慢滴加dibal-h(30ml,30mmol,1m的甲苯溶液)，然后继续在-78℃反应0.5h，tlc显示反应完成后，在-50℃下加入饱和的罗谢尔盐溶液(300ml)淬灭反应，室温搅拌30min，水相用乙酸乙酯萃取(150ml
×
3)，合并有机相，用饱和食盐水洗涤(100ml
×
2)，无水硫酸钠干燥，过滤，旋干浓缩，残余物过硅胶层析柱(洗脱剂：v
石油醚
:v
乙酸乙酯
＝3:1～1:1)纯化，得到化合物q1-7(8.6g,白色固体)，产率85.3％。
[0145]
ms(esi):m/z 408[m+h]
+
。
[0146]
第七步：合成中间体q1
[0147]
将化合物q1-7(5g,12.2mmol)加入到乙酸乙酯(50ml)中，再加入4m的hcl/乙酸乙酯溶液(25ml)，室温反应1h，tlc显示反应完成后，过滤，固体用乙酸乙酯洗涤，烘干，得到中间体q1的盐酸盐(3.2g,白色固体)，产率94％。
[0148]
ms(esi):m/z 204[m+h]
+
。
[0149]
中间体q2的合成
[0150][0151]
第一步：合成q2-2
[0152]
将化合物q2-1(205mg,1mmol)溶于二氧六环(5ml)中，然后加入3-巯基丙酸甲酯(180mg,1.5mmol)、pd2(dba)3(22.73mg,0.025mmol,0.05当量)、xantphos(14.36mg,0.025mmol)和diea(387mg,3mmol)。氮气保护下升温到90℃并搅拌1小时后，将反应混合物旋干浓缩，残余物过硅胶层析柱(洗脱剂：v
石油醚
:v
乙酸乙酯
＝3:1～1:1)纯化，得到化合物q2-2(201mg,淡黄色液体)，83％产率。
[0153]
ms(esi):m/z 246[m+h]
+
。
[0154]
第二步：合成中间体q2
[0155]
将化合物q2-2(200mg,0.81mmol)溶于thf(2ml)中，然后冷却到0℃，再加入叔丁醇钠(96mg,1mmol)，在0℃下搅拌0.5h，tlc显示反应结束后，将反应混合物用pe稀释，析出大量固体，通过过滤收集沉淀的固体，并用乙酸乙酯洗涤，得到中间体q2(130mg,浅黄色固体)，产率88％。
[0156]
ms(esi):m/z 182[m+h]
+
。
[0157]
中间体q3的合成
[0158][0159]
第一步：合成q3-2
[0160]
将化合物q3-1(10g,106mmol)加入到二甲苯(100ml)中，然后加入甲烷三羧酸三乙酯(48g,222mmol,cas:6279-86-3)，加完后升温到140℃反应3h，tlc显示反应结束后，冷却到室温，有固体析出，过滤，滤饼用乙醚洗涤后，干燥，得到化合物q3-2(16.2g,淡黄色固体)，65％产率。粗品未经纯化，直接用于下一步反应。
[0161]
ms(esi):m/z 235[m+h]
+
。
[0162]
第二步：合成中间体q3-3
[0163]
将化合物q3-2(5g,21mmol)加入到甲醇(40ml)和水(10ml)的混合溶剂中，套上氢气球，置换掉空气后，通氢气后反应3h，tlc显示反应结束后，过滤，滤饼用甲醇(50ml)洗涤，滤液旋干，得到化合物q3-3(4.3g,淡黄色固体)，产率92％。粗品未经纯化，直接用于下一步反应。
[0164]
ms(esi):m/z 239[m+h]
+
。
[0165]
第三步：合成中间体q3
[0166]
将化合物q3-3(5g,21mmol)加入到甲醇(50ml)和水(10ml)的混合溶剂中，然后加入一水合氢氧化锂(1.7g,42mmol)，室温搅拌2h，tlc显示反应结束后，用1m盐酸调ph值到3-4，有大量固体析出，过滤，滤饼干燥，得到中间体q3(3.98g,白色固体)，产率90％。粗品未经纯化，直接用于下一步反应。
[0167]
ms(esi):m/z 211[m+h]
+
。
[0168]
中间体q4的合成
[0169][0170]
第一步：合成q4-1
[0171]
将化合物q2-2(1.5g，6.1mmol)和化合物q3-3(1.2克，5.0mmol)在dmf(15毫升)中的溶液在160℃加热2.5小时。冷却后，将反应混合物加入到75ml饱和氯化钠溶液中，然用etoac萃取(25ml
×
3)，合并有机相，用饱和氯化钠溶液洗涤(100ml)，无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩。用meoh研磨浓缩物，得到化合物q4-1(196g，黄色固体)，产率92％。
[0172]
ms(esi):m/z 438.2[m+h]
+
。
[0173]
第二步：合成q4
[0174]
将化合物q4-1(500mg,1.14mmol)溶于thf(2ml)中，然后冷却到0℃，再加入叔丁醇钠(131mg,1.37mmol)，在0℃下搅拌0.5h，tlc显示反应结束后，将反应混合物用pe稀释，析出大量固体，通过过滤收集沉淀的固体，并用乙酸乙酯洗涤，得到中间体q4(370mg,浅黄色固体)，产率87％。
[0175]
中间体q5的合成
[0176][0177]
第一步：合成q5-2
[0178]
将化合物2-氨基吡啶(4.35g，46.3mmol)和乙氧基亚甲基丙二酸二乙酯(10.00g，46.3mmol，cas:87-13-8)的混合物在120℃加热1小时。冷却到室温，再进一步冷却到5℃后，混合物用冰的乙醇进行打浆，过滤，固体用冰乙醇洗涤后干燥，得到化合物q5-2(9.90g，黄色固体)，产率81％。
[0179]
ms(esi):m/z 265.2[m+h]
+
。
[0180]
第二步：合成q5-3
[0181]
将化合物q5-2(13g，5.9mmol)加入到二苯醚(100ml)中，然后加热到280℃，回流2小时，tlc反应结束后，将反应混合物冷却至室温，并向其中加入正己烷(500ml)，以获得大量固体沉淀物。过滤沉淀的固体，用正己烷洗涤并干燥，得到化合物q5-3(10g，黄色固体)，产率93.1％。
[0182]
ms(esi):m/z 219.2[m+h]
+
。
[0183]
第三步：合成q5
[0184]
将化合物q5-3(5g,23mmol)加入到甲醇(40ml)和水(10ml)的混合溶剂中，套上氢气球，置换掉空气后，通氢气后反应3h，tlc显示反应结束后，过滤，滤饼用甲醇(50ml)洗涤，滤液旋干，得到化合物q5(4.6g,淡黄色固体)，产率92％。粗品无需纯化，直接用于下一步反应。
[0185]
中间体q6的合成
[0186][0187]
第一步：合成q6-2
[0188]
将化合物q2-1(205mg,1mmol)溶于二氧六环(5ml)中，然后加入3-巯基丙酸甲酯(180mg,1.5mmol)、pd2(dba)3(22.73mg,0.025mmol,0.05当量)、xantphos(14.36mg,0.025mmol)和diea(387mg,3mmol)。氮气保护下升温到90℃并搅拌1小时后，将反应混合物旋干浓缩，残余物过硅胶层析柱(洗脱剂：v
石油醚
:v
乙酸乙酯
＝3:1～1:1)纯化，得到化合物q2-2(201mg,淡黄色液体)，83％产率。
[0189]
ms(esi):m/z 246[m+h]
+
。
[0190]
第二步：合成中间体q6
[0191]
将化合物q2-2(200mg,0.81mmol)溶于thf(2ml)中，然后冷却到0℃，再加入叔丁醇钠(96mg,1mmol)，在0℃下搅拌0.5h，tlc显示反应结束后，将反应混合物用pe稀释，析出大量固体，通过过滤收集沉淀的固体，并用乙酸乙酯洗涤，得到中间体q2(130mg,浅黄色固体)，产率88％。
[0192]
ms(esi):m/z 182[m+h]
+
。
[0193]
中间体q7的合成
[0194][0195]
第一步：合成q7-2
[0196]
将化合物q2-1(205mg,1mmol)溶于二氧六环(5ml)中，然后加入3-巯基丙酸甲酯(180mg,1.5mmol)、pd2(dba)3(22.73mg,0.025mmol,0.05当量)、xantphos(14.36mg,0.025mmol)和diea(387mg,3mmol)。氮气保护下升温到90℃并搅拌1小时后，将反应混合物旋干浓缩，残余物过硅胶层析柱(洗脱剂：v
石油醚
:v
乙酸乙酯
＝3:1～1:1)纯化，得到化合物q2-2(201mg,淡黄色液体)，83％产率。
[0197]
ms(esi):m/z 246[m+h]
+
。
[0198]
第二步：合成中间体q7
[0199]
将化合物q7-2(200mg,0.81mmol)溶于thf(2ml)中，然后冷却到0℃，再加入叔丁醇钠(96mg,1mmol)，在0℃下搅拌0.5h，tlc显示反应结束后，将反应混合物用pe稀释，析出大量固体，通过过滤收集沉淀的固体，并用乙酸乙酯洗涤，得到中间体q2(130mg,浅黄色固体)，产率88％。
[0200]
ms(esi):m/z 182[m+h]
+
。
[0201]
实施例1：化合物1的制备
[0202][0203]
具体合成路线如下：
[0204][0205]
第一步：合成化合物1b
[0206]
将化合物1a(104mg,0.5mmol)溶于二氧六环(5ml)中，加入中间体q2(182mg,1mmol)、pd2(dba)3(22.73mg,0.025mmol)、xantphos(14.36mg,0.025mmol)和diea(190mg,1.5mmol)。在氮气保护下升温到90℃并搅拌1h后，将反应混合物旋干浓缩，残余物过硅胶层析柱(洗脱剂：v
二氯甲烷
:v
甲醇
＝50:1～10:1)纯化，得到化合物1b(107mg,淡黄色固体)，75％产率。
[0207]
ms(esi):m/z 287[m+h]
+
。
[0208]
第二步：合成化合物1c
[0209]
将化合物1b(100mg,0.35mmol)、diea(154mg,1.2mmol)、中间体q3(147mg,0.7mmol)和hatu(456mg,1.2mmol)加入到dmf中，室温下搅拌12h，tlc显示反应结束后，反应液用二氯甲烷(10ml)稀释，有机相用饱和氯化钠水溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，收集滤液，减压浓缩，残余物过硅胶层析柱(洗脱剂：v
二氯甲烷
:v
甲醇
＝50:1～10:1)纯化，得到化合物1b(137mg,淡黄色固体)，82％产率。
[0210]
ms(esi):m/z 479[m+h]
+
。
[0211]
第三步：合成化合物1
[0212]
将化合物1c(100mg,0.21mmol)、中间体q1(71mg,0.35mmol)和diea(82mg,0.63mmol)溶于二甲基亚砜(5ml)中，90℃下反应1.5h。反应结束后，加入乙酸乙酯(20ml)和水(40ml)，水相用乙酸乙酯萃取(20ml
×
3)，合并有机相，用饱和氧化钠溶液洗涤(100ml)，无水硫酸钠干燥，过滤，收集滤液，减压浓缩，残余物过硅胶层析柱(洗脱剂：v
二氯甲烷
:v
甲醇
＝50:1～10:1)纯化，得到化合物1(32mg,淡黄色固体)。
[0213]
ms(esi):m/z 646[m+h]
+
。
[0214]1h-nmr(400mhz,dmso-d6):δ12.26(brs,1h),8.54-8.53(m,1h),8.31(m,3h),8.15(m,1h),7.90-7.88(m,1h),7.70(s,1h),7.36-7.21(m,1h),6.47-6.45(m,1h),6.20-6.18(m,2h),4.48-4.67(m,1h),4.35-4.23(m,2h),3.87-3.67(m,2h),3.26-3.13(m,4h),2.90-2.87(m,2h),2.02-1.72(m,5h),1.55-1.45(m,3h)。
[0215]
实施例2：化合物2的制备
[0216][0217]
具体合成路线如下：
[0218][0219]
第一步：合成化合物2b
[0220]
将化合物2a(1.0g,3.6mmol)、化合物q1(808mg,4.0mmol)和diea(4.6g，36mmol)加入到mecn(2240ml)中，然后将得到的溶液在80℃下搅拌2小时。tlc显示反应完成。将混合物冷却至25℃，并将boc2o(1.6g，7.2mmol)加入溶液中。将反应在50℃下搅拌2小时。tlc显示反应完成。在减压下浓缩混合物。残余物过硅胶层析柱(洗脱剂:石油醚/乙酸乙酯＝1/2,v/v)纯化，得到化合物2b(953mg,淡黄色固体)，48.4％产率。
[0221]
ms(esi):m/z 547.1[m+h]
+
。
[0222]
第二步：合成化合物2c
[0223]
将化合物2c(900mg,1.6mmol)溶于nmp(10ml)中，加入中间体q4(895mg,2.4mmol)、pd2(dba)3(145mg,0.16mmol)、xantphos(92mg,0.16mmol)和diea(619mg,4.8mmol)。在氮气
保护下升温到120℃并搅拌1h后，tlc反应结束后，将反应混合物加入到75ml饱和氯化钠溶液中，然用etoac萃取(25ml
×
3)，合并有机相，用饱和氯化钠溶液洗涤(100ml)，无水硫酸钠干燥，旋干浓缩，残余物用制备高效液相色谱分离纯化(welch xtrimate c
18 150*30mm*5μm；条件：36-67％b(a:水(0.05％氨水)，b:乙腈)；流速：25ml/min)，得到化合物2c(553mg,淡黄色固体)，45％产率。
[0224]
ms(esi):m/z 770.2[m+h]
+
。
[0225]
第三步：合成化合物2
[0226]
将化合物2c(500mg,0.65mmol)加入到乙酸乙酯(5ml)中，再加入4m的hcl/乙酸乙酯溶液(10ml)，室温反应1h，tlc显示反应完成后，过滤，固体用乙酸乙酯洗涤，烘干，得到化合物2的盐酸盐(400mg,白色固体)，产率94％。
[0227]
ms(esi):m/z 670.2[m+h]
+
。
[0228]1h nmr(400mhz,dmso)δ12.28(s,1h),9.13-8.86(m,3h),8.67(d,j＝5.6hz,1h),8.43-8.27(m,2h),8.22-8.16(m,1h),8.07(d,j＝25.2hz,2h),7.66-7.57(m,1h),7.21(t,j＝8.0hz,1h),6.71(d,j＝8.0hz,1h),4.62-4.58(m,1h),4.16-4.13(m,1h),4.07-4.02(m,1h),3.88(t,j＝6.0hz,2h),3.55-3.48(m,3h),3.30-3.24(m,1h),2.90(t,j＝6.4hz,2h),2.18-2.09(m,1h),2.08-1.99(m,1h),1.95-1.88(m,2h),1.87-1.77(m,3h),1.70(d,j＝13.6hz,1h)。
[0229]
实施例3：化合物3的制备
[0230][0231]
具体合成路线如下：
[0232][0233]
第一步：合成化合物3b
[0234]
将化合物3a(6g,24.80mmol)溶于dmf(50ml)中，在0℃下滴加diea(8.66ml,49.61mmol)和氨基乙醛缩二甲醇(2.90g，27.28mmol)的dmf溶液，升至室温反应2h。tlc显示反应结束后，加入水中，并用乙酸乙酯萃取，盐水洗有机相，用无水硫酸钠干燥有机相，残余物用硅胶柱层析纯化(洗脱剂：pe:ea＝5:1(体积比))，得到化合物3b(7.4g，淡黄色固体)，产率91％。
[0235]
ms(esi):m/z310[m+h]
+
。
[0236]
第二步：合成化合物3c
[0237]
将化合物3b(5g,16.10mmol)在冰浴下分批缓慢加入浓硫酸(15ml)中，升温至75度反应2h。tlc显示反应结束，将反应液冷却至0℃，滴加5n氢氧化钠水溶液调ph为6，有黄色固体析出，过滤固体并烘干，得到化合物3c(2.77g，黄色固体)，产率71％。
[0238]
ms(esi):m/z 228[m+h]
+
。
[0239]
第三步：合成化合物3d
[0240]
将化合物3c(2.77g,12.15mmol)加入到pocl3(30ml)中，在0℃下滴加diea(4.24ml,24.29mmol)，升温至115度反应15min。tlc显示反应结束后，旋干反应液，加入乙酸乙酯并缓慢倒入水中，用饱和碳酸氢钠水溶液调ph为中性，萃取，盐水洗有机相，用无水硫酸钠干燥，残余物用硅胶柱层析纯化(洗脱剂，pe:ea＝3:1(体积比))，得到化合物3d(1.17g，淡黄色固体)，产率38％。
[0241]
ms(esi):m/z 246[m+h]
+
。
[0242]
第四步：合成化合物3e
[0243]
将化合物3d(886mg,3.6mmol)、化合物q1(808mg,4.0mmol)和diea(4.6g，36mmol)加入到mecn(40ml)中，然后将得到的溶液在80℃下搅拌2小时。tlc显示反应完成。将混合物
冷却至25℃，并将boc2o(1.6g，7.2mmol)加入溶液中。将反应在50℃下搅拌2小时。tlc显示反应完成。在减压下浓缩混合物。残余物过硅胶层析柱(洗脱剂:石油醚/乙酸乙酯＝1/2,v/v)纯化，得到化合物3e(786mg,淡黄色固体)，38.9％产率。
[0244]
ms(esi):m/z 561.1[m+h]
+
。
[0245]
第五步：合成化合物3f
[0246]
将化合物3e(700mg,1.24mmol)溶于nmp(10ml)中，加入中间体q4(895mg,2.4mmol)、pd2(dba)3(145mg,0.16mmol)、xantphos(92mg,0.16mmol)和diea(619mg,4.8mmol)。在氮气保护下升温到120℃并搅拌1h后，tlc反应结束后，将反应混合物加入到75ml饱和氯化钠溶液中，然用etoac萃取(25ml
×
3)，合并有机相，用饱和氯化钠溶液洗涤(100ml)，无水硫酸钠干燥，旋干浓缩，残余物用制备高效液相色谱分离纯化(welch xtrimate c
18 150*30mm*5μm；条件：36-67％b(a:水(0.05％氨水),b:乙腈)；流速：25ml/min)，得到化合物3f(340mg,淡黄色固体)，35％产率。
[0247]
ms(esi):m/z 784.2[m+h]
+
。
[0248]
第六步：合成化合物3
[0249]
将化合物3f(300mg,0.38mmol)加入到乙酸乙酯(5ml)中，再加入4m的hcl/乙酸乙酯溶液(10ml)，室温反应1h，tlc显示反应完成后，过滤，固体用乙酸乙酯洗涤，烘干，得到化合物3的盐酸盐(239mg,白色固体)，产率92％。
[0250]
ms(esi):m/z 684.2[m+h]
+
。
[0251]1h nmr(400mhz,dmso)δ12.28(s,1h),9.31(s,1h),8.55(d,j＝4.8hz,1h),8.49-8.33(m,2h),8.14(d,j＝8.4hz,1h),7.93(d,j＝7.2hz,1h),7.35(dd,j＝7.6,4.8hz,1h),7.28-6.96(m,3h),6.54(d,j＝8.4hz,1h),4.53(d,j＝4.8hz,1h),4.23(d,j＝13.6hz,1h),4.14(d,j＝14.4hz,1h),3.89(t,j＝5.6hz,2h),3.60-3.54(m,2h),3.28(d,j＝16.8hz,1h),3.14(d,j＝16.8hz,1h),2.89(t,j＝6.5hz,2h),2.52(s,3h),2.05-1.87(m,3h),1.86-1.69(m,3h),1.62(d,j＝12.8hz,1h),1.28-1.21(m,1h)。
[0252]
实施例4：化合物4的制备
[0253][0254]
具体合成路线如下：
[0255][0256]
第一步：合成化合物4b
[0257]
将化合物4a(10g,71mmol)溶于thf(100ml)中，室温下分批缓慢加入nis(17.6g，78mmol)，室温反应过夜。lcms检测反应完全，将反应液加入到500ml水中，析出大量固体，过滤得到的固体再用二氯甲烷洗涤，干燥得到化合物4b(16.5g,淡黄色固体)，87％收率。
[0258]
ms(esi):m/z 268.1[m+h]
+
。
[0259]
第二步：合成化合物4c
[0260]
将化合物q1(1.0g,4.9mmol)加入到dmf(10ml)中，然后加入化合物4b(2.62g,9.8mmol)和bop(4.3g,9.8mmol)，加完后室温下缓慢加入dbu(2.2g,14.7mmol)，然后室温反应过夜，反应结束后，将boc2o(1.6g，7.2mmol)加入溶液中。将反应在50℃下搅拌2小时。tlc显示反应完成。在减压下浓缩混合物。残余物过硅胶层析柱(洗脱剂:石油醚/乙酸乙酯＝1/2,v/v)纯化，得到化合物4c(1.1g,淡黄色固体)，42.3％产率。
[0261]
ms(esi):m/z 553.1[m+h]
+
。
[0262]
第三步：合成化合物4d
[0263]
将化合物4c(830mg,1.5mmol)溶于nmp(10ml)中，加入中间体q4(895mg,2.4mmol)、pd2(dba)3(145mg,0.16mmol)、xantphos(92mg,0.16mmol)和diea(619mg,4.8mmol)。在氮气保护下升温到120℃并搅拌1h后，tlc反应结束后，将反应混合物加入到75ml饱和氯化钠溶液中，然用etoac萃取(25ml
×
3)，合并有机相，用饱和氯化钠溶液洗涤(100ml)，无水硫酸钠干燥，旋干浓缩，残余物用制备高效液相色谱分离纯化(welch xtrimate c
18 150*30mm*5μm；条件：36-67％b(a:水(0.05％氨水),b:乙腈)；流速：25ml/min)，得到化合物4d(384mg,淡黄色固体)，33％产率。
[0264]
ms(esi):m/z 776.2[m+h]
+
。
[0265]
第四步：合成化合物4
[0266]
将化合物4d(350mg,0.45mmol)加入到乙酸乙酯(5ml)中，再加入4m的hcl/乙酸乙酯溶液(10ml)，室温反应1h，tlc显示反应完成后，过滤，固体用乙酸乙酯洗涤，烘干，得到化合物4的盐酸盐(276mg,白色固体)，产率91％。
[0267]
ms(esi):m/z 676.2[m+h]
+
。
[0268]
实施例5：化合物5的制备
[0269][0270]
具体合成路线如下：
[0271][0272]
第一步：合成化合物5a
[0273]
将化合物1b(500mg,1.75mmol)和化合物q5(388mg,1.75mmol)加入到nmp(10ml)中，然后在氮气保护下升温到120℃并搅拌1h后，tlc反应结束后，将反应混合物加入到75ml饱和氯化钠溶液中，然用etoac萃取(25ml
×
3)，合并有机相，用饱和氯化钠溶液洗涤(100ml)，无水硫酸钠干燥，旋干浓缩，残余物用硅胶柱层析纯化(洗脱剂，pe:ea＝3:1(体积比))，得到化合物5a(339mg，淡黄色固体)，产率42％。
[0274]
ms(esi):m/z 463.2[m+h]
+
。
[0275]
第三步：合成化合物5
[0276]
将化合物5a(300mg,0.64mmol)、化合物q1(156mg,0.77mmol)和diea(826mg，6.4mmol)加入到mecn(10ml)中，然后将得到的溶液在80℃下搅拌2小时。tlc显示反应完成。在减压下浓缩混合物。残余物用制备高效液相色谱分离纯化(welch xtrimate c
18
150*30mm*5μm；条件：36-67％b(a:水(0.05％氨水),b:乙腈)；流速：25ml/min)，得到化合物5(106mg,淡黄色固体)，26.2％产率。
[0277]
ms(esi):m/z 630.2[m+h]
+
。
[0278]1h nmr(400mhz,dmso)δ11.28(s,1h),8.53(d,j＝4.2hz,1h),8.43-8.30(m,2h),7.94-7.85(m,1h),7.72-7.63(m,1h),7.54-7.45(m,1h),7.37-7.29(m,1h),7.26-7.10(m,2h),6.55-6.43(m,1h),6.34-6.25(m,1h),6.13(s,1h),4.47(s,1h),4.28(dd,j＝34.4,12.4hz,2h),3.46(s,1h),3.27-3.15(m,3h),3.15-3.00(m,2h),2.93-2.77(m,2h),2.05-1.83(m,2h),1.83-1.64(m,3h),1.62-1.46(m,2h),1.42-1.32(m,1h)。
[0279]
实施例6：化合物6的制备
[0280][0281]
具体合成路线如下：
[0282][0283]
第一步：合成化合物6a
[0284]
将化合物1a(207mg,1.0mmol)溶于二氧六环(5ml)中，加入中间体q6(322mg,2mmol)、pd2(dba)3(45mg,0.05mmol)、xantphos(28mg,0.05mmol)和diea(380mg,3.0mmol)。在氮气保护下升温到90℃并搅拌1h后，将反应混合物旋干浓缩，残余物过硅胶层析柱(洗脱剂：v
二氯甲烷
:v
甲醇
＝50:1～10:1)纯化，得到化合物6a(173mg,淡黄色固体)，65％产率。
[0285]
ms(esi):m/z 267.2[m+h]
+
。
[0286]
第二步：合成化合物6b
[0287]
将化合物6a(100mg,0.37mmol)、diea(154mg,1.2mmol)、中间体q3(147mg,0.7mmol)和hatu(456mg,1.2mmol)加入到dmf中，室温下搅拌12h，tlc显示反应结束后，反应液用二氯甲烷(10ml)稀释，有机相用饱和氯化钠水溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，收集滤液，减压浓缩，残余物过硅胶层析柱(洗脱剂：v
二氯甲烷
:v
甲醇
＝50:1～10:1)纯化，得到化合物6b(138mg,淡黄色固体)，81.5％产率。
[0288]
ms(esi):m/z 459.2[m+h]
[0289]
第三步：合成化合物6
[0290]
将化合物6b(100mg,0.22mmol)、中间体q1(71mg,0.35mmol)和diea(82mg,0.63mmol)溶于二甲基亚砜(5ml)中，90℃下反应1.5h。反应结束后，加入乙酸乙酯(20ml)和水(40ml)，水相用乙酸乙酯萃取(20ml
×
3)，合并有机相，用饱和氧化钠溶液洗涤(100ml)，无水硫酸钠干燥，过滤，收集滤液，减压浓缩，残余物用制备高效液相色谱分离纯化(welch xtrimate c
18 150*30mm*5μm；条件：36-67％b(a:水(0.05％氨水),b:乙腈)；流速：25ml/
min)，得到化合物6(30.7mg,淡黄色固体)，22.3％产率。
[0291]
ms(esi):m/z 626.2[m+h]
+
。
[0292]
实施例7：化合物7的制备
[0293][0294]
具体合成路线如下：
[0295][0296]
第一步：合成化合物7a
[0297]
将化合物1a(207mg,1.0mmol)溶于二氧六环(5ml)中，加入中间体q7(358mg,2mmol)、pd2(dba)3(45mg,0.05mmol)、xantphos(28mg,0.05mmol)和diea(380mg,3.0mmol)。在氮气保护下升温到90℃并搅拌1h后，将反应混合物旋干浓缩，残余物过硅胶层析柱(洗脱剂,二氯甲烷:甲醇＝50:1～10:1，v：v)纯化，得到化合物7a(194mg,淡黄色固体)，63.5％产率。
[0298]
ms(esi):m/z 305.1[m+h]
+
。
[0299]
第二步：合成化合物7b
[0300]
将化合物7a(106mg,0.35mmol)、diea(154mg,1.2mmol)、中间体q3(147mg,0.7mmol)和hatu(456mg,1.2mmol)加入到dmf中，室温下搅拌12h，tlc显示反应结束后，反应液用二氯甲烷(10ml)稀释，有机相用饱和氯化钠水溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，收集滤液，减压浓缩，残余物过硅胶层析柱(洗脱剂,二氯甲烷:甲醇＝50:1～10:1，v：v)纯化，得到化合物7b(145mg,淡黄色固体)，83.6％产率。
[0301]
ms(esi):m/z 497.2[m+h]
[0302]
第三步：合成化合物7
[0303]
将化合物7b(110mg,0.22mmol)、中间体q1(71mg,0.35mmol)和diea(82mg,
0.63mmol)溶于二甲基亚砜(5ml)中，90℃下反应1.5h。反应结束后，加入乙酸乙酯(20ml)和水(40ml)，水相用乙酸乙酯萃取(20ml
×
3)，合并有机相，用饱和氧化钠溶液洗涤(100ml)，无水硫酸钠干燥，过滤，收集滤液，减压浓缩，残余物用制备高效液相色谱分离纯化(welch xtrimate c
18 150*30mm*5μm；条件：36-67％b(a:水(0.05％氨水),b:乙腈)；流速：25ml/min)，得到化合物7(37.2mg,淡黄色固体)，26.2％产率。
[0304]
ms(esi):m/z 644.2[m+h]
+
。
[0305]1h nmr(400mhz,dmso)δ12.87-12.69(m,1h),8.44(d,j＝4.4hz,1h),8.03-7.93(m,1h),7.89-7.76(m,2h),7.69-7.62(m,2h),7.26(dd,j＝7.6,5.2hz,1h),6.30-6.03(m,3h),4.24(t,j＝17.6hz,2h),4.12(s,2h),3.82-3.68(m,2h),2.96(d,j＝16.8hz,1h),2.72-2.62(m,2h),2.56-2.52(m,2h),2.36-2.22(m,3h),1.89-1.66(m,6h),1.54(t,j＝14.0hz,1h),1.41(d,j＝12.4hz,1h)。
[0306]
实施例8：化合物8的制备
[0307][0308]
具体合成路线如下：
[0309][0310]
第一步：合成化合物8b
[0311]
将化合物q1(1.0g,4.9mmol)加入到dmf(10ml)中，然后加入化合物8a(2.45g,9.8mmol)和bop(4.3g,9.8mmol)，加完后室温下缓慢加入dbu(2.2g,14.7mmol)，然后室温反应过夜，反应结束后，将boc2o(1.6g，7.2mmol)加入溶液中。将反应在50℃下搅拌2小时。tlc显示反应完成。在减压下浓缩混合物。残余物过硅胶层析柱(洗脱剂:石油醚/乙酸乙酯＝1/2,v/v)纯化，得到化合物8b(1.15g,淡黄色固体)，45.2％产率。
[0312]
ms(esi):m/z 518.1[m+h]
+
。
[0313]
第二步：合成化合物8c
[0314]
将化合物8b(829mg,1.6mmol)溶于nmp(10ml)中，加入中间体q4(895mg,2.4mmol)、pd2(dba)3(145mg,0.16mmol)、xantphos(92mg,0.16mmol)和diea(619mg,4.8mmol)。在氮气保护下升温到120℃并搅拌1h后，tlc反应结束后，将反应混合物加入到75ml饱和氯化钠溶液中，然用etoac萃取(25ml
×
3)，合并有机相，用饱和氯化钠溶液洗涤(100ml)，无水硫酸钠干燥，旋干浓缩，残余物用制备高效液相色谱分离纯化(welch xtrimate c
18 150*30mm*5μm；条件：36-67％b(a:水(0.05％氨水),b:乙腈)；流速：25ml/min)，得到化合物8c(412mg,淡黄色固体)，32.6％产率。
[0315]
ms(esi):m/z 789.2[m+h]
+
。
[0316]
第三步：合成化合物8
[0317]
将化合物8c(354mg,0.45mmol)加入到乙酸乙酯(5ml)中，再加入4m的hcl/乙酸乙酯溶液(10ml)，室温反应1h，tlc显示反应完成后，过滤，固体用乙酸乙酯洗涤，烘干，得到化合物8的盐酸盐(283mg,白色固体)，产率91.5％。
[0318]
ms(esi):m/z 689.2[m+h]
+
。
[0319]
实施例9：化合物9的制备
[0320][0321]
具体合成路线如下：
[0322][0323]
第一步：合成化合物9a
[0324]
将化合物8c(1g,1.3mmol)加入到甲醇(5.0ml)和水(10.0ml)的混合溶剂中，然后加入一水合氢氧化锂(170mg,4.2mmol)，室温搅拌2h，tlc显示反应结束后，用1m盐酸调ph值
到3-4，有大量固体析出，过滤，滤饼干燥，得到中间体9a(907mg,灰白色固体)，产率90％。粗品未经纯化，直接用于下一步反应。
[0325]
第二步：合成化合物9
[0326]
将化合物9a(900mg,1.16mmol)加入到乙酸乙酯(5ml)中，再加入4m的hcl/乙酸乙酯溶液(10ml)，室温反应1h，tlc显示反应完成后，将反应混合物加入到75ml饱和碳酸氢钠溶液中，然用二氯甲烷：甲醇(5：1，v：v)萃取(25ml
×
3)，合并有机相，用饱和氯化钠溶液洗涤(100ml)，无水硫酸钠干燥，旋干浓缩，残余物用制备高效液相色谱分离纯化(welch xtrimate c
18 150*30mm*5μm；条件：36-67％b(a:水(0.05％氨水),b:乙腈)；流速：25ml/min)，得到化合物9(123mg,白色固体)，15.7％产率。
[0327]
ms(esi):m/z 675.1[m+h]
+
。
[0328]1h nmr(400mhz,dmso)δ12.30(s,1h),8.39-8.32(m,2h),8.26-8.19(m,1h),7.56(d,j＝7.2hz,1h),7.39-7.28(m,2h),7.27-7.16(m,2h),6.86-6.73(m,2h),6.53(s,1h),4.86(d,j＝9.2hz,1h),3.95-3.73(m,5h),3.50(s,1h),3.12(d,j＝16.8hz,1h),2.92-2.84(m,2h),2.76-2.72(m,1h),2.04-1.85(m,3h),1.85-1.74(m,2h),1.74-1.57(m,3h)。
[0329]
实施例10：化合物10的制备
[0330][0331]
具体合成路线如下：
[0332][0333]
第一步：合成化合物10a
[0334]
将化合物9a(900mg,1.16mmol)加入到dmf(10ml)溶液中，然后加入hatu(661mg,1.74mmol)和diea(300mg,2.32mmol)，室温搅拌半小时后，再加入氯化铵(320mg,5.8mmol)，
然后室温反应过夜，tlc显示反应结束后，将反应液加入到75ml饱和碳酸氢钠溶液中，然用二氯甲烷：甲醇(5：1，v：v)萃取(25ml
×
3)，合并有机相，用饱和氯化钠溶液洗涤(100ml)，无水硫酸钠干燥，旋干浓缩，残余物用制备高效液相色谱分离纯化(welch xtrimate c
18 150*30mm*5μm；条件：36-67％b(a:水(0.05％氨水),b:乙腈)；流速：25ml/min)，得到化合物10a(303mg,白色固体)，33.8％产率。
[0335]
ms(esi):m/z 774.1[m+h]
+
。
[0336]
第二步：合成化合物10
[0337]
将化合物10a(300mg,0.38mmol)加入到乙酸乙酯(5ml)中，再加入4m的hcl/乙酸乙酯溶液(10ml)，室温反应1h，tlc显示反应完成后，过滤，固体用乙酸乙酯洗涤，烘干，得到化合物10的盐酸盐(232mg,白色固体)，产率90.5％。
[0338]
ms(esi):m/z 674.2[m+h]
+
。
[0339]1h nmr(400mhz,meod)δ8.74-8.62(m,1h),8.44-8.29(m,1h),8.23-8.13(m,1h),7.78(s,1h),7.71-7.57(m,1h),7.36-7.19(m,1h),7.14-7.03(m,1h),4.64(s,1h),4.15-3.95(m,3h),3.77-3.72(m,2h),3.66-3.59(m,3h),3.52-3.40(m,1h),3.12-3.012(m,1h),2.13-1.90(m,5h),1.81(d,j＝11.6hz,1h),1.69(d,j＝11.65hz,1h),1.64-1.54(m,1h)。
[0340]
实施例11：化合物11的制备
[0341][0342]
具体合成路线如下：
[0343][0344]
第一步：合成化合物11b
[0345]
将化合物q1(1.0g,4.9mmol)加入到dmf(10ml)中，然后加入化合物11a(2.74g,9.8mmol)和bop(4.3g,9.8mmol)，加完后室温下缓慢加入dbu(2.2g,14.7mmol)，然后室温反
应过夜，反应结束后，将boc2o(1.6g，7.2mmol)加入溶液中。将反应在50℃下搅拌2小时。tlc显示反应完成。在减压下浓缩混合物。残余物过硅胶层析柱(洗脱剂:石油醚/乙酸乙酯＝1/2,v/v)纯化，得到化合物11b(1.2g,淡黄色固体)，45.2％产率。
[0346]
ms(esi):m/z 546.2[m+h]
+
。
[0347]
第二步：合成化合物11c
[0348]
将化合物11b(872mg,1.6mmol)溶于nmp(10ml)中，加入中间体q4(895mg,2.4mmol)、pd2(dba)3(145mg,0.16mmol)、xantphos(92mg,0.16mmol)和diea(619mg,4.8mmol)。在氮气保护下升温到120℃并搅拌1h后，tlc反应结束后，将反应混合物加入到75ml饱和氯化钠溶液中，然用etoac萃取(25ml
×
3)，合并有机相，用饱和氯化钠溶液洗涤(100ml)，无水硫酸钠干燥，旋干浓缩，残余物用制备高效液相色谱分离纯化(welch xtrimate c
18 150*30mm*5μm；条件：36-67％b(a:水(0.05％氨水),b:乙腈)；流速：25ml/min)，得到化合物11c(398mg,淡黄色固体)，30.5％产率。
[0349]
ms(esi):m/z 817.2[m+h]
+
。
[0350]
第三步：合成化合物11
[0351]
将化合物11c(367mg,0.45mmol)加入到乙酸乙酯(5ml)中，再加入4m的hcl/乙酸乙酯溶液(10ml)，室温反应1h，tlc显示反应完成后，过滤，固体用乙酸乙酯洗涤，烘干，得到化合物11的盐酸盐(295mg,白色固体)，91.5％产率。
[0352]
ms(esi):m/z 717.2[m+h]
+
。
[0353]1h nmr(400mhz,dmso)δ12.26(s,1h),8.76(s,2h),8.60(d,j＝4.4hz,1h),8.21(dd,j＝24.4,7.6hz,2h),7.47(dd,j＝7.2,5.6hz,1h),7.43-7.34(m,1h),7.30(t,j＝8.0hz,1h),6.69(d,j＝8.0hz,1h),4.56-4.46(m,1h),4.30(q,j＝7.2hz,2h),3.97(d,j＝13.2hz,1h),3.89-3.84(m,2h),3.80(s,1h),3.36-3.23(m,3h),3.15(d,j＝17.2hz,1h),2.89(t,j＝6.4hz,2h),2.45(s,3h),1.96-1.87(m,2h),1.87-1.76(m,3h),1.75-1.64(m,2h),1.56(d,j＝13.2hz,1h),1.26(t,j＝7.2hz,3h)。
[0354]
实施例12：化合物12的制备
[0355][0356]
具体合成路线如下：
[0357][0358]
第一步：合成化合物12a
[0359]
将化合物8c(1g,1.3mmol)加入到甲醇(5.0ml)和水(10.0ml)的混合溶剂中，然后加入一水合氢氧化锂(170mg,4.2mmol)，室温搅拌2h，tlc显示反应结束后，用1m盐酸调ph值到3-4，有大量固体析出，过滤，滤饼干燥，得到中间体9a(907mg,灰白色固体)，产率90％。粗品未经纯化，直接用于下一步反应。
[0360]
第二步：合成化合物12b
[0361]
将化合物9a(900mg,1.16mmol)加入到dmf(10ml)溶液中，然后加入hatu(661mg,1.74mmol)和diea(300mg,2.32mmol)，室温搅拌半小时后，再加入氯化铵(320mg,5.8mmol)，然后室温反应过夜，tlc显示反应结束后，将反应液加入到75ml饱和碳酸氢钠溶液中，然用二氯甲烷：甲醇(5：1，v：v)萃取(25ml
×
3)，合并有机相，用饱和氯化钠溶液洗涤(100ml)，无水硫酸钠干燥，旋干浓缩，残余物用制备高效液相色谱分离纯化(welch xtrimate c
18 150*30mm*5μm；条件：36-67％b(a:水(0.05％氨水),b:乙腈)；流速：25ml/min)，得到化合物10a(303mg,白色固体)，33.8％产率。
[0362]
ms(esi):m/z 774.1[m+h]
+
。
[0363]
第三步：合成化合物12
[0364]
将化合物11c(367mg,0.45mmol)加入到乙酸乙酯(5ml)中，再加入4m的hcl/乙酸乙酯溶液(10ml)，室温反应1h，tlc显示反应完成后，过滤，固体用乙酸乙酯洗涤，烘干，得到化合物11的盐酸盐(295mg,白色固体)，产率91.5％。
[0365]
ms(esi):m/z 717.2[m+h]
+
。
[0366]1h nmr(400mhz,dmso)δ12.25(s,1h),8.63-8.50(m,3h),8.21(d,j＝8.4hz,1h),8.05(d,j＝7.6hz,1h),7.84(s,1h),7.56(s,1h),7.40(dd,j＝7.6,5.2hz,1h),7.29(t,j＝8.0hz,1h),6.66(d,j＝8.0hz,1h),4.52-4.48(m,1h),4.07(d,j＝13.2hz,1h),3.96(d,j＝13.2hz,1h),3.86(t,j＝6.0hz,2h),3.74-3.64(m,2h),3.28-3.25(m,1h),3.11(d,j＝17.2hz,1h),2.88(t,j＝6.4hz,2h),2.43(s,3h),2.02-1.96(m,1h),1.94-1.85(m,2h),1.85-1.75(m,3h),1.63(d,j＝11.6hz,1h),1.53(d,j＝13.2hz,1h).
[0367]
实验例1：本发明化合物针对nci-h358细胞的抗增殖活性测试
4-11细胞系购自中国科学院细胞库。envision多标记分析仪(perkinelmer)。
[0382]
实验方法：
[0383]
将mv-4-11细胞种于白色96孔板中，80μl细胞悬液每孔，其中包含6000个mv-4-11细胞。细胞板置于二氧化碳培养箱中过夜培养。
[0384]
将待测化合物用排枪进行3倍稀释至第9个浓度，即从2mm稀释至304nm，设置双复孔实验。向中间板中加入78μl培养基，再按照对应位置，转移2μl每孔的梯度稀释化合物至中间板，混匀后转移20μl每孔到细胞板中。转移到细胞板中的化合物浓度范围是10μm至1.52nm。细胞板置于二氧化碳培养箱中培养3天。
[0385]
向细胞板中加入每孔25ul的promega celltiter-glo试剂，室温孵育10分钟使发光信号稳定。采用perkinelmer envision多标记分析仪读数。
[0386]
数据分析：
[0387]
利用方程式(sample-min)/(max-min)*100％将原始数据换算成抑制率，ic
50
的值即可通过四参数进行曲线拟合得出(graphpad prism中"log(inhibitor)vs.response
‑‑
variable slope"模式得出)。表2提供了本发明的化合物对mv-4-11细胞增殖的抑制活性。
[0388]
表2.本发明中的化合物的抗细胞增殖活性数据(ic
50
)
[0389][0390]
从表2中的实验结果可以看出，本发明中的化合物在抑制mv-4-11细胞增殖方面具有良好的活性。化合物1的活性超过tno-155活性10倍。显示出极其重要的抗肿瘤潜力。
[0391]
实验例3：p-erk活性抑制实验
[0392]
1.实验材料
[0393]
h358细胞购自南京科佰生物科技；
[0394]
1640培养基购自biological industries；
[0395]
胎牛血清购自biosera；
[0396]
磷酸化perk(磷酸化位点202/204)检测试剂盒购自cisbio。
[0397]
2.实验方法
[0398]
将h358细胞种于透明96孔细胞培养板中，80μl细胞悬液/孔，每孔包含10000个h358细胞。将细胞板放入二氧化碳培养箱中，于37℃过夜孵育。弃掉细胞上清液，加入80μl/孔的饥饿培养基(1640+0.02％胎牛血清+1％双抗)，将细胞板放入二氧化碳培养箱中，细胞饥饿处理过夜。
[0399]
将待测化合物用100％dmso稀释到4mm，作为第一个浓度，然后再用排枪移液器进行5倍稀释至第8个浓度，即从4mm稀释至10.24μm。取1μl化合物加入79μl细胞饥饿培养基，混匀后转移20μl/孔的化合物溶液到对应细胞板孔中，细胞板放回二氧化碳培养箱继续孵育1h，此时化合物浓度为10μm至0.0256nm，dmso浓度为0.25％；
[0400]
结束孵育后，弃掉细胞上清液，加入50μl细胞裂解液/孔，室温摇晃孵育30min；使用检测缓冲液将铕穴状化合物标记的磷酸化细胞外调节蛋白激酶抗体和d2标记的磷酸化
细胞外调节蛋白激酶抗体稀释20倍；取16μl细胞裂解物上清液，加入到新的384白色微孔板中，再加入2μl铕穴状化合物标记的磷酸化细胞外调节蛋白激酶抗体稀释液和2μl d2标记的磷酸化细胞外调节蛋白激酶抗体稀释液，常温孵育4h；孵育结束后，使用多标记分析仪读取均相时间分辨荧光htrf(激发波长为320nm，发射波长为615nm和665nm)。
[0401]
3.数据分析
[0402]
利用方程式(样品-min)/(max-min)成100％，将原始数据换算成抑制率，ic
50
值即可通过四参数进行曲线拟合而得出(例如，通过graphpad prism中的“log(inhibitor)vs.response
‑‑
variable slope”模式得出)。其中，max孔：阳性对照孔读值为1x细胞裂解液；min孔：阴性对照孔读值为0.25％dmso细胞孔细胞裂解液。
[0403]
表3.本发明中的化合物的p-erk活性抑制数据(ic
50
)
[0404]
化合物编号p-erk抑制活性，ic
50
(单位：nm)tno-15585.76化合物19.53
[0405]
从表3中的实验结果可以看出，本发明中的化合物对nci-h358细胞中shp2下游erk磷酸化具有优异的抑制效果，进一步从机制上阐述了本发明中的化合物具备较好的抗肿瘤前景。
[0406]
实验例4：shp2酶学实验
[0407]
1.实验材料和仪器
[0408]
均相全长shp2酶学实验试剂盒购自bps bioscience；
[0409]
多标记分析仪购自perkin elmer。
[0410]
2.实验方法：
[0411]
将5x检测缓冲液用去离子水稀释成1x检测缓冲液，现配现用，配好后放置在冰上，备用。
[0412]
将待测化合物用100％dmso稀释到100μm，作为第一个浓度，然后再用排枪移液器进行4倍稀释至第8个浓度，即从100μm稀释至6.1nm。用1x缓冲液将待测化合物各梯度稀释成含10％dmso的工作液，5μl/孔加到对应孔中，设置双复孔实验。1000rpm离心1min。
[0413]
每孔加入18μl配制的反应混合液，其中含12.25μl去离子水；5μl 5x检测缓冲液；0.25μl蛋白酪氨酸磷酸酶激活多肽(100μm)；0.5μl dtt(250mm)。1000rpm离心1min。
[0414]
用1x检测缓冲液将shp2酶稀释到0.1ng/μl，取2μl/孔加入到对应孔中，阴性对照孔中加入2μl 1x检测缓冲液，shp2(0.2ng)，该步在冰上操作，反应体系置于25℃孵育60min，做化合物预孵育。
[0415]
化合物预孵育结束后，每孔加入25μl底物工作液，其中含19.45μl去离子水；5μl 5x检测缓冲液；0.5μl dtt(250mm)和0.05μl shp2底物(difmup)(10mm)，反应体系置于25℃反应30min。此时化合物终浓度梯度为1μm至0.061nm。反应结束后，采用多标记分析仪读取荧光值(激发波长为360nm，发射波长为460nm)。
[0416]
化合物本底读值的检测方法如下：取100％dmso稀释好的待测化合物各梯度5μl到新的化合物板中，加入45μl 1x检测缓冲液进行10倍稀释，配成10％dmso的工作液，再取该化合物工作液5μl/孔到检测板中，然后加入45μl 1x检测缓冲液进行10倍稀释，此时dmso终浓度为1％，1000rpm离心1分钟，采用多标记分析仪读取荧光值(激发波长为360nm，发射波
长为460nm)。
[0417]
3.数据分析
[0418]
以酶反应原始读值减去化合物本底读值后得到的数据作为抑制率计算的初始值，利用方程式(样品-min)/(max-min)
×
100％，将初始值换算成抑制率，ic
50
值即可通过四参数进行曲线拟合而得出(例如，通过graphpad prism中的“log(inhibitor)vs.response
‑‑
variable slope”模式得出)。其中，max孔：阳性对照孔初始值；min孔：阴性对照孔初始值。
[0419]
表4.本发明中的化合物的shp2酶活性抑制数据(ic
50
)
[0420]
化合物编号shp2酶抑制活性ic
50
(单位：nm)tno-1552.6化合物10.98
[0421]
从表4中的实验结果可以看出，本发明中的化合物在酶学层面上显示出非常优秀的shp2酶抑制活性，ic
50
达到1nm以下，极具开发及应用前景。
[0422]
实验例5：herg钾离子通道抑制剂活性测试
[0423]
1细胞准备
[0424]
cho-herg细胞培养于175cm2培养瓶中，待细胞密度生长到60-80％，移走培养液，用7ml pbs洗一遍，然后加入3ml detachin消化。
[0425]
待消化完全后加入7ml培养液中和，然后离心，吸走上清液，加再加入5ml培养液重悬，以确保细胞密度为2-5
×
106/ml。
[0426]
2溶液配制见表5：
[0427]
表5.细胞内液和外液的组成成分
[0428][0429]
3电生理记录过程
[0430]
单细胞高阴抗封接和全细胞模式形成过程全部由qpatch仪器自动完成，在获得全细胞记录模式后，细胞钳制备在-80毫伏，在给予一个5秒的+40毫伏去极化刺激前，先给予一个50毫秒的-50毫伏前置电压，然后复极化到-50毫伏维持5秒，再回到-80毫伏。每15秒施加此电压刺激，记录2分钟后给予细胞外液记录5分钟，然后开始给药过程，化合物浓度从最低测试浓度开始，每个测试浓度给予2.5分钟，连续给完所有浓度后，给予阳性对照化合物0.1μm cisapride。每个浓度至少测试3个细胞(n≥3)。
[0431]
4化合物准备
[0432]
将20mm的化合物母液用细胞外液进行稀释，取5μl 20mm的化合物母液加入2495μl细胞外液，500倍稀释至40μm，然后在含0.2％dmso的细胞外液中依次进行3倍连续稀释得到需要测试的最终浓度。
[0433]
最高测试浓度为40μm，依次分别为40，13.33，4.44，1.48，0.49，0.16μm共6个浓度。
[0434]
最终测试浓度中的dmso含量不超过0.2％，此浓度的dmso对herg钾通道没有影响。
[0435]
5数据分析
[0436]
实验数据由xlfit软件进行分析。
[0437]
6质量控制
[0438]
环境：湿度20～50％，温度22～25℃
[0439]
试剂：所用实验试剂购买于sigma公司，纯度》98％
[0440]
报告中的实验数据必须满足以下标准：
[0441]
全细胞封接阻抗》100mω
[0442]
尾电流幅度》300pa
[0443]
药理学参数：
[0444]
多浓度cisapride对herg通道的抑制效应设为阳性对照。
[0445]
7实验结果
[0446]
表6.本发明中的化合物在多浓度对herg电流的抑制结果
[0447]
化合物编号herg(μm)化合物1》40化合物2》40cisapride0.021
[0448]
8实验结论∶药物对于心脏herg钾离子通道的抑制是药物导致qt延长综合症的主要原因。从实验结果可以看出，本发明实施例化合物对于心脏herg钾离子通道没有明显抑制作用，心脏毒副作用风险低。
[0449]
实验例6：药物代谢动力学实验
[0450]
1.实验材料
[0451]
使用以上实施例中制备的化合物，口服药物配制成0.3mg/ml澄清溶液(2％dmso+30％peg300+2％tween80+66％h2o)，静脉药物配制成0.2mg/ml澄清溶液(2％dmso+30％peg300+2％tween80+66％h2o)。
[0452]
2.实验动物
[0453]
雄性cd-1小鼠或大鼠，每组各3只，体重27-28g，由上海斯莱克实验动物责任有限公司提供。受试小鼠实验前给予2-4天的环境适应期，给药前禁食8-12h，给药2h后给水，4h后给食。
[0454]
3.实验方法
[0455]
1)小鼠或大鼠禁食但可自由饮水12h后，采取0时刻空白血浆；
[0456]
2)取步骤1)中的小鼠，口服(po)给予待测化合物3mg/kg；静脉(iv)给予待测化合物1mg/kg；
[0457]
3)于口服后5min、15min、30min、1h、2h、4h、8h、10h和24h，从眼底静脉丛连续取血，置于分布有肝素的ep管中，8000rpm离心5min后，取上层血浆，-20℃冻存，待lc-ms/ms分析；
[0458]
4)根据步骤3)所得的血药浓度-时间数据，采用winnonlin软件求算药代动力学参数，具体数据见表7。
[0459]
表7.本发明中的化合物的药代动力学数据
[0460][0461]
如表7中所示，口服或静脉给予小鼠或大鼠本发明中的化合物后，在动物血浆中有较高的暴露量，清除率低，可以通过口服给药。
[0462]
实验例7：体内药效学实验一
[0463]
1.实验目的
[0464]
评价受试化合物在人非小细胞肺癌nci-h358皮下异体移植肿瘤模型上的体内药效。
[0465]
2.实验动物
[0466]
balb/裸小鼠，雌性，6-8周龄，体重18-20克，共需18只，由上海灵畅实验动物有限公司提供。
[0467]
3.实验方法
[0468]
将nci-h358肿瘤细胞重悬于pbs中，制备成密度为5
×
107个/ml的细胞悬液，皮下接种于每只小鼠的右后背(0.1ml，5
×
106/只)，等待肿瘤生长。在肿瘤平均体积达到约151mm3时，开始进行随机分组给药。给药后，每周两次用游标卡尺测量肿瘤直径，肿瘤体积的计算公式如下：
[0469]
v＝0.5a
×
b2，其中a和b分别表示肿瘤的长径和短径。
[0470]
化合物的抑瘤疗效用tgi(％)评价，tgi(％)反映了肿瘤生长抑制率，其计算如下：
[0471]
tgi(％)＝[(1-(某处理组给药结束时平均瘤体积-该处理组开始给药时平均瘤体积)/(溶剂对照组治疗结束时平均瘤体积-溶剂对照组开始治疗时平均瘤体积)]
×
100％。
[0472]
4.实验结果
[0473]
相关结果如表8所示。
[0474]
表8.体内药效实验结果
[0475]
组别肿瘤体积(mm3)(第35天)tgi(％)溶剂对照组784.14
±
40.83/tno-155(30mg/kg)355.37
±
68.1767.72化合物1(30mg/kg)185.34
±
20.8594.57
[0476]
5.实验结论
[0477]
开始给药35天后，在同等剂量(30mg/kg)下，本发明中的化合物与阳性对照物tno-155相比，具有更显著的肿瘤抑制效果，tgi(％)达到94.57％，明显优于阳性对照物tno155的67.72％，表明本发明中的化合物在人非小细胞肺癌nci-h358皮下异体移植肿瘤模型上展示出良好的体内药效。作为shp2抑制剂，在临床上有着非常好的抗肿瘤应用前景。
[0478]
实验例8：体内药效学实验二
[0479]
1.实验目的
[0480]
评价受试化合物在人胰腺癌mia-paca2细胞皮下异体移植肿瘤模型上的体内药效。
[0481]
2.实验动物
[0482]
balb/裸小鼠，雌性，6-8周龄，体重18-22克，共需24只，由由北京维通利华科技股份有限公司提供。
[0483]
3.实验方法
[0484]
将mia-paca2肿瘤细胞重悬于pbs中，制备成密度为1
×
107个/ml的细胞悬液，皮下接种0.2ml细胞悬液于每只小鼠的右后背(加入基质胶，体积比为1：1)，等待肿瘤生长。在肿瘤平均体积达到约142mm3时，开始进行随机分组给药。给药后，每周两次用游标卡尺测量肿瘤直径，肿瘤体积的计算公式如下：
[0485]
v＝0.5a
×
b2，其中a和b分别表示肿瘤的长径和短径。
[0486]
化合物的抑瘤疗效用tgi(％)评价，tgi(％)反映了肿瘤生长抑制率，其计算如下：
[0487]
tgi(％)＝[(1-(某处理组给药结束时平均瘤体积-该处理组开始给药时平均瘤体积)/(溶剂对照组治疗结束时平均瘤体积-溶剂对照组开始治疗时平均瘤体积)]
×
100％。
[0488]
4.实验结果
[0489]
相关结果如表9所示。
[0490]
表9.体内药效实验结果
[0491]
组别肿瘤体积(mm3)(第22天)tgi(％)溶剂对照组1560
±
137/tno-155(30mg/kg)868
±
7248.8化合物1(3.0mg/kg)696
±
11260.9化合物1(30mg/kg)560
±
9370.4
[0492]
5.实验结论
[0493]
开始给药22天后，在同等剂量(30mg/kg)下，本发明中的化合物与阳性对照物tno-155相比，具有更加显著的肿瘤抑制效果，并且有明显的量效关系，表明本发明中的化合物在人胰腺癌mia-paca2皮下异体移植肿瘤模型上展示出良好的体内药效。
[0494]
实验例9：体内药效学实验三
[0495]
1.实验目的
[0496]
评价受试化合物在鼠源结肠癌mc38皮下异种移植肿瘤模型上的体内药效。
[0497]
2.实验动物
[0498]
c57bl/6小鼠，雌性，6～8周龄，体重18～20克。共需32只，由上海灵畅实验动物有限公司提供。
[0499]
3.实验方法
[0500]
将mc38肿瘤细胞重悬于pbs中，制备成密度为0.3
×
106个/ml的细胞悬液，皮下接种0.1ml细胞悬液于每只小鼠的右后背(加入基质胶，体积比为1：1)，等待肿瘤生长。在肿瘤平均体积达到约65mm3时，开始进行随机分组给药。给药后，每周两次用游标卡尺测量肿瘤直径，肿瘤体积的计算公式如下：
[0501]
v＝0.5a
×
b2，其中a和b分别表示肿瘤的长径和短径。
[0502]
化合物的抑瘤疗效用tgi(％)评价，tgi(％)反映了肿瘤生长抑制率，其计算如下：
[0503]
tgi(％)＝[(1-(某处理组给药结束时平均瘤体积-该处理组开始给药时平均瘤体积)/(溶剂对照组治疗结束时平均瘤体积-溶剂对照组开始治疗时平均瘤体积)]
×
100％。
[0504]
4.实验结果
[0505]
相关结果如表10所示。
[0506]
表10.体内药效实验结果
[0507][0508]
5.实验结论
[0509]
开始给药18天后，本发明中的化合物与pd-1抗体联合用药，与单药相比，明显能增加肿瘤抑制效果，在鼠源结肠癌mc38皮下异种移植肿瘤模型上的展示出良好的体内药效。表明本发明中的化合物与pd1单抗联用显示协同增效抗肿瘤作用。
[0510]
实验例10：体内药效学实验四
[0511]
1.实验目的
[0512]
评价受试化合物在人食管癌kyse-520皮下异体移植肿瘤模型上的体内药效。
[0513]
2.实验动物
[0514]
balb/裸小鼠，雌性，6-8周龄，体重18-24克，共需40只，由北京维通利华科技股份有限公司提供。
[0515]
3.实验方法
[0516]
将kyse-520肿瘤细胞重悬于pbs中，制备成密度为10
×
106个/ml的细胞悬液，皮下接种0.2ml细胞悬液于每只小鼠的右后背(加基质胶，体积比1：1)，等待肿瘤生长。在肿瘤平均体积达到约141mm3时，开始进行随机分组给药。给药后，每周两次用游标卡尺测量肿瘤直径，肿瘤体积的计算公式如下：
[0517]
v＝0.5a
×
b2，其中a和b分别表示肿瘤的长径和短径。
[0518]
化合物的抑瘤疗效用tgi(％)评价，tgi(％)反映了肿瘤生长抑制率，其计算如下：
[0519]
tgi(％)＝[(1-(某处理组给药结束时平均瘤体积-该处理组开始给药时平均瘤体积)/(溶剂对照组治疗结束时平均瘤体积-溶剂对照组开始治疗时平均瘤体积)]
×
100％。
[0520]
4.实验结果
[0521]
相关结果如表11所示。
[0522]
表11.体内药效实验结果
[0523]
组别肿瘤体积(mm3)(第21天)tgi(％)溶剂对照组1,059
±
176/tno-155(30mg/kg)304
±
3682.3化合物1(0.3mg/kg)439
±
6967.5化合物1(1.0mg/kg)321
±
4580.4化合物1(3.0mg/kg)216
±
4291.9
[0524]
5.实验结论
[0525]
开始给药21天后，化合物1在阳性对照十分之一的剂量(3.0mg/kg)条件下，本发明中的化合物1与阳性对照物tno-155(30mg/kg)相比，具有显著的更好的肿瘤抑制效果，tgi(％)达到91.9％，明显优于阳性对照物tno155的82.3％。另外，本发明的化合物1在更低的剂量(0.3mg/kg)时，仍展示出显著的抗肿瘤药效，这表明本发明中的化合物在人食管癌kyse-520皮下异体移植模型中展示良好的体内药效，且抗肿瘤作用具有剂量依赖性的趋势。
[0526]
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制。在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型，这些变化、修改、替换和变型均涵盖在本发明的范围之中。