聚合物促进蛋白质类药物结晶的方法及应用

1.本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及大分子蛋白质类药物结晶的方法及应用。


背景技术：

2.蛋白质类药物结晶在蛋白质药物生产、纯化等领域具有广阔的应用前景，但是由于蛋白质分子量较大，很多蛋白质的结晶时间长、效率低，这限制了其在实际生产中的应用。
3.在研究蛋白质结晶的生物技术领域，cn107814831采用悬滴法，用去氧核糖核酸促进蛋白质的结晶，可提高悬滴中蛋白质结晶的成功率；cn105566443用交联蛋白质晶体的方法来促进蛋白质结晶，提高蛋白质结晶条件筛选的成功率；在cn106188220中，利用环糊精及其衍生物作为籽晶提高了蛋白质结晶成功率。但由于所用添加剂类别和结晶方式的原因，以上方法都存在着对结晶温度限制严格、结晶时间较长等方面的不足，比如cn107814831为保证dna的活性，实验需在4℃的恒温箱中进行结晶；cn105566443的结晶时间为3～7天。


技术实现要素：

4.本发明针对当前技术的不足，提供了一种聚合物促进蛋白质类药物结晶的方法。该方法通过在蛋白质溶液中加入高分子聚合物作为添加剂，利用蛋白质与聚合物之间的相互作用，加速蛋白质的成核和结晶。本发明工艺流程简单，操作时间短，可提高蛋白质类药物的结晶效率，克服了传统技术下蛋白质结晶时间长、效率低的不足，还可以缩短蛋白质分离纯化的过程，具有良好的应用前景。
5.为了实现上述目的，本发明采用下述技术方案：
6.一种聚合物促进蛋白质类药物结晶的方法，包括如下步骤：
7.将聚合物加入到蛋白质溶液中，然后调节蛋白质溶液的过饱和度为10～15，得到过饱和溶液，搅拌0.5～6小时；得到蛋白质晶体；
8.其中，蛋白质与聚合物的质量比m
蛋白质
/m
聚合物
＝5～15；过饱和溶液中蛋白质的浓度为1～20mg/ml；
9.所述调节蛋白质溶液的过饱和度的方法，为加沉淀剂、冷却、冷冻干燥或减压蒸发；
10.所述调节蛋白质溶液过饱和度的加沉淀剂的方法优选为加入盐析沉淀剂；
11.所述沉淀剂为nacl溶液、znso4溶液、zncl2溶液、znac溶液、znbr2溶液、丙酮、苯酚、间甲苯酚、邻甲苯酚和对甲苯酚中的一种或多种；
12.所述聚合物为具有羧基、氨基或羟基的聚合物；
13.所述聚合物为醇、酚、胺、或有机酸。
14.所述聚合物优选为聚天冬氨酸、聚乙烯亚胺、聚乳酸或聚乙二醇。
15.所述蛋白质为寡肽、多肽、酶、激素、核酸或单克隆抗体。
16.所述的蛋白质溶液的溶剂为缓冲溶液，优选为乙酸钠缓冲溶液、柠檬酸钠缓冲溶液或盐酸。
17.所述方法制备的蛋白质类药物的应用，用于蛋白质结构分析或生物制药中作为靶向药物制剂的组成。
18.本发明的有益效果：
19.本发明通过将聚合物与含有蛋白质的溶液混合，进而促进蛋白质结晶，有效缩短了蛋白质的结晶时间，提高了蛋白质的结晶效率。通过本发明，蛋白质结晶诱导速率的提高最小可达现有技术中未添加聚合物的对照组的2倍以上。本发明在蛋白质类药物的生产、纯化、结晶等领域具有广阔的应用前景。
附图说明
20.图1为实施例1中得到的聚天冬氨酸促进溶菌酶结晶的晶体图。
具体实施方式
21.下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
22.本发明提供的一种聚合物促进蛋白质类药物结晶的方法，包括如下步骤：
23.将聚合物与蛋白质溶液混合，调节蛋白质溶液的过饱和度，得到蛋白质晶体。
24.在本发明中，蛋白质溶液指的是含有蛋白质的溶液体系，所述溶液体系中溶质包括但不限于蛋白质。
25.本发明通过向蛋白质溶液中引入聚合物促进蛋白质的结晶，有效缩短了蛋白质的结晶时间，提高了蛋白质的结晶效率，本技术在蛋白质药物的生产领域具有广阔的应用前景。
26.[沉淀剂溶液的配制]
[0027]
在本发明的一种优选方式中，沉淀剂溶液的配制方法包括如下步骤：
[0028]
将沉淀剂及任选的助剂与缓冲溶液混合，配制成沉淀剂溶液。
[0029]
在本发明的一种方案中，沉淀剂为包括但不限于nacl，或znso4，或zncl2，或znac，或znbr2等。
[0030]
在本发明的一种方案中，助剂为包括但不限于丙酮，或苯酚，或间甲苯酚，或邻甲苯酚，或对甲苯酚等。
[0031]
[聚合物促进蛋白质的结晶]
[0032]
在本发明的一种方案中，将聚合物与蛋白质溶液混合，调节蛋白质溶液的过饱和度，得到蛋白质晶体。将晶体过滤，洗涤，干燥，得到蛋白质晶体。
[0033]
在本发明的一种方案中，聚合物为包括但不限于醇类，或酚类，或胺类，或有机酸类等。
[0034]
在本发明的一种方案中，蛋白质为包括但不限于多肽，或酶，或激素，或核酸，或单克隆抗体等。
[0035]
在本发明的一种方案中，蛋白质溶液的终浓度包括但不限于1mg/ml，或5mg/ml，或10mg/ml，或15mg/ml，或20mg/ml等。
[0036]
本发明提供的聚合物促进蛋白质结晶的方法操作简单，缩短了蛋白质的结晶时间，提高了蛋白质的结晶效率，本技术在蛋白质药物的生产领域具有广阔的应用前景。为了便于本领域技术人员理解，下面结合实施例对本发明提供的技术方案做进一步地描述。
[0037]
实施例1
[0038]
本实施例提供了一种聚天冬氨酸促进溶菌酶结晶的方法，其按照如下步骤制备得到：
[0039]
(1)将nacl和溶菌酶(300mg)分别溶解在浓度为0.1mol/l，ph＝4.6的乙酸钠缓冲液中(8ml、用乙酸调节ph值)，通过孔径为0.2微米的过滤器将溶解后的溶菌酶溶液过滤到结晶器中，然后将30mg聚天冬氨酸过滤入结晶器，使其与溶菌酶充分混合(即蛋白质与聚合物的质量比m
蛋白质
/m
聚合物
＝10)，最后将溶解后的nacl溶液过滤到结晶器中(即体积比为1:1，此时的过饱和度值是13.02)，得到含溶菌酶终浓度为18.75mg/ml的蛋白质溶液。将含有溶菌酶的溶液在20℃的温度下以搅拌桨外缘线速度为0.52m/s搅拌，2小时左右溶液开始浑浊，析出小晶体，6小时得到大量结晶。
[0040]
(2)将步骤(1)制备得到的溶菌酶晶体过滤，并用蒸馏水洗涤4次以除去附着在溶菌酶晶体上的杂质，得到溶菌酶晶体。
[0041]
通过图1可以看出，本发明得到的溶菌酶晶体形态一致，粒度均匀(粒径为10～20μm)，说明加入聚合物能够有效促进蛋白质的结晶，提高蛋白质的结晶效率。该品质的蛋白质结晶，完全符合晶体性质稳定、粒度均一、易于储存的要求，可以应用于蛋白质结构分析或生物制药中作为靶向药物制剂。
[0042]
实施例2
[0043]
本实施例提供了一种聚乙二醇促进溶菌酶结晶的方法，其按照如下步骤制备得到：
[0044]
(1)将nacl和溶菌酶(300mg)分别溶解在浓度为0.1mol/l，ph＝4.6的乙酸钠缓冲液中(8ml、用乙酸调节ph值)，通过孔径为0.2微米的过滤器将溶解后的溶菌酶溶液过滤到结晶器中，然后将30mg聚乙二醇过滤入结晶器，使其与溶菌酶充分混合(即蛋白质与聚合物的质量比m
蛋白质
/m
聚合物
＝10)，最后将溶解后的nacl溶液过滤到结晶器中(即体积比为1:1，此时的过饱和度值是13.02)，得到含溶菌酶终浓度为18.75mg/ml的蛋白质溶液。将含有溶菌酶的溶液在20℃的温度下以搅拌桨外缘线速度为0.52m/s，2小时左右溶液开始浑浊，析出小晶体，6小时得到大量结晶。
[0045]
(2)将步骤(1)制备得到的溶菌酶晶体过滤，并用蒸馏水洗涤4次以除去附着在溶菌酶晶体上的杂质，得到溶菌酶晶体。
[0046]
实施例3
[0047]
本实施例提供了一种聚天冬氨酸促进胰岛素结晶的方法，其按照如下步骤制备得到：
[0048]
(1)将牛胰岛素(40mg)溶解于ph＝2的hcl溶液中(8ml)，得到浓度为5.00mg/ml的牛胰岛素溶液。然后将丙酮和硫酸锌加入到浓度为0.48mol/l、ph＝6.58的柠檬酸钠缓冲溶液中(8ml、用naoh调节ph)，得到丙酮浓度为10.0％(v/v)、硫酸锌浓度为0.1％(w/w)的沉淀
剂溶液，将牛胰岛素溶液和沉淀剂溶液混合(即体积比为1:1)，然后将4mg聚天冬氨酸加入混合溶液(即蛋白质与聚合物的质量比m
蛋白质
/m
聚合物
＝10)，将体系置于室温结晶3.5小时，得到大量晶体。
[0049]
(2)将步骤(1)制备得到的胰岛素晶体过滤，并用柠檬酸钠缓冲溶液洗涤4次以除去附着在胰岛素晶体上的杂质，得到胰岛素晶体。
[0050]
对比例1
[0051]
将nacl和溶菌酶(300mg)分别溶解在浓度为0.1mol/l，ph＝4.6的乙酸钠缓冲液中(8ml、用乙酸调节ph值)，通过孔径为0.2微米的过滤器将溶解后的溶菌酶溶液和nacl溶液过滤到结晶器中，得到含溶菌酶终浓度为18.75mg/ml的蛋白质溶液。将含有溶菌酶的溶液在20℃的温度下以搅拌桨外缘线速度为0.52m/s搅拌15小时，得到溶菌酶晶体。
[0052]
对比例2
[0053]
先将牛胰岛素(40mg)溶解于ph＝2的hcl溶液中(8ml)，得到浓度为5.00mg/ml的牛胰岛素溶液。然后将丙酮和硫酸锌加入到浓度为0.48mol/l、ph＝6.58的柠檬酸钠缓冲溶液中(8ml、用naoh调节ph值)，得到丙酮浓度为10.0％(v/v)、硫酸锌浓度为0.1％(w/w)的沉淀剂溶液，将牛胰岛素溶液和沉淀剂溶液混合，将体系置于室温结晶8小时，得到胰岛素晶体。
[0054]
通过以上实施例和对比例可以看出，将聚合物与含有蛋白质的溶液混合，可以促进蛋白质结晶，有效缩短了蛋白质的结晶时间，提高了蛋白质的结晶效率。蛋白质结晶诱导速率的为未添加聚合物的对照组的2倍以上。
[0055]
本发明未尽事宜为公知技术。