一株副干酪乳杆菌及黄贮复合生物发酵剂和黄贮方法

1.本发明涉及一株微生物及饲料发酵剂和饲料发酵方法。


背景技术：

2.乳酸菌作为益生菌家族中的重要成员,在人类和动物的肠道健康中具有重要的作用。干酪乳杆菌(lactobacillus casei)是乳杆菌属的重要成员，它可以在肠道内大量存活，通过调节肠道菌群失衡改变肠道微生态环境，增强机体免疫力，发挥着重要的益生菌的作用。而副干酪乳杆菌(lactobacillus paracasei)是由collins等首次提出，是从干酪乳杆菌亚种中划分出来的新种。广泛存在于人体口腔及肠道，发酵乳制品和植物原料发酵物等诸多环境中，具有调节肠道和增强免疫力等益生功能，其代谢产生的细菌素具有优良的抑菌性能。因此，在食品、医疗保健等领域能够发挥重要作用。近年来，副干酪乳杆菌在其他领域的应用有所拓展，作为潜在的重要工业微生物，可以用来合成高值有机酸，如l
‑
乳酸和苯乳酸。


技术实现要素：

3.本发明通过自主分离筛选获得一株具有优良的低温生长能力和产酸能力的副干酪乳杆菌。
4.本发明副干酪乳杆菌(lactobacillus paracasei)l6041，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为cgmcc no.22530。
5.本发明黄贮复合生物发酵剂由纤维素复合酶和副干酪乳杆菌(lactobacillus paracasei)l6041组成。
6.本发明黄贮方法：向用于黄贮的干秸秆中添加上述黄贮复合生物发酵剂、葡萄糖和水，然后进行厌氧发酵；其中，葡萄糖的添加量为干秸秆重量的0.8％～1.2％，黄贮复合生物发酵剂的添加量为干秸秆重量的8％～12％。
7.本发明副干酪乳杆菌为项目组自主分离筛选获得，具有优良的低温生长能力和产酸能力，可以作为饲料添加剂应用到秸秆黄贮中，与纤维素酶进行复合有效降低秸秆中中性洗涤纤维与酸性洗涤纤维的能力，其降解能力优于单一使用纤维素酶的能力，并让发酵后的秸秆有效软化，并具有酸香，提高了粗饲料的品质，有利于动物的采食。
8.副干酪乳杆菌(lactobacillus paracasei)l6041为副干酪乳杆菌，属于乳杆菌属(lactobacillus)；保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为cgmcc no.22530，保藏日期为2021年5月14日。
附图说明
9.图1是副干酪乳杆菌l6041在不同温度下的生长曲线图；
10.图2是副干酪乳杆菌l6041的菌体形态照片；
11.图3是副干酪乳杆菌l6041的菌落照片。
具体实施方式
12.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
13.需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
14.具体实施方式一：本实施方式副干酪乳杆菌(lactobacillus paracasei)l6041，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为cgmcc no.22530。
15.本实施方式副干酪乳杆菌(lactobacillus paracasei)l6041分离自2020年黑龙江省哈尔滨市自然发酵的秸秆样品。
16.黑龙江省哈尔滨市自然厌氧堆积发酵的秸秆样品发酵45天后进行自然凉干后，称取5g加入到装满50mlmrs肉汤培养基中，重复3瓶。15℃静止富集培养，72小时，至混浊，测定各瓶的ph，从发酵液ph在3～3.5的发酵液中，再取0.5ml加入到装满50mlmrs肉汤培养基中,在15℃静止富集培养,至混浊，测定各瓶的ph。如此继代多次后，取生长速度最快的菌液发酵瓶采用平板稀释法进行平板培养，获取单菌落。单菌落再次进行低温液体纯培养，选取可以稳定传代的纯菌株进行温度试验。培养温度控制在10℃、20℃、30℃、40℃。
17.挑选出一株可在10℃、20℃、30℃、40℃生长，且生长状态良好的菌株，即副干酪乳杆菌(lactobacillus paracasei)l6041。
18.副干酪乳杆菌(lactobacillus paracasei)l6041生长适宜温度广泛，在10℃～36℃均可良好生长，最适生长温度15℃，生长速度快，具有较强的产酸能力，发酵产物ph达3.0～3.5。副干酪乳杆菌(lactobacillus paracasei)l6041为兼性厌氧、菌落为乳白色，表面光滑湿润、可分解碳酸钙产酸，菌体为不运动、无芽孢短杆菌，革兰氏染色阳性，过氧化氢酶阴性。副干酪乳杆菌(lactobacillus paracasei)l6041能发酵多种单糖和多糖，生化反应均呈阳性反应(菌株生化试验结果如表1所示)，石蕊牛奶反应也为阳性。
19.表1
20.名称七叶苷纤维二糖麦芽糖甘露醇水杨苷山梨醇蔗糖棉子糖葡萄糖乳糖颜色黑黄黄黄黄黄黄黄黄黄结果阳性阳性阳性阳性阳性阳性阳性阳性阳性阳性
21.经16s rdna序列ncbi物种相似度比对，本实施方式菌株与副干酪乳杆菌(lactobacillus paracasei)的相似性达到99.79％，并结合菌种生理生化试验与形态观察，确定菌株为副干酪乳杆菌，命名为副干酪乳杆菌(lactobacillus paracasei)l6041。
22.具体实施方式二：本实施方式测定副干酪乳杆菌(lactobacillus paracasei)l6041生长曲线。
23.副干酪乳杆菌l6041液体发酵培养基：由蛋白胨10克、牛肉膏10克、酵母浸膏5克、葡萄糖20克、磷酸氢二钾2克、醋酸钠5克、柠檬酸铵2克、硫酸镁0.2克、硫酸锰0.2克、吐温80 1毫升和水1000毫升制成，调节ph值6.2，121℃灭菌20分钟，备用。共制作4500ml，分装于
50ml的三角瓶中，每瓶装入培养基25ml，每个样品重复3瓶，共计180瓶，每瓶接种副干酪乳杆菌l6041种子液0.1ml，静止培养，以不接菌的液体培养基为空白对照，每隔4个小时测定样品od值，取3次重复的平均值。
24.采用分光光度计法，各样品稀释10倍后测定420nm波长的od值，生长曲线如表2所示：
25.表2
[0026][0027][0028]
从副干酪乳杆菌l6041在不同温度下的生长曲线看出，菌株副干酪乳杆菌l6041的生长范围宽，在15℃低温下可以良好生长，活菌计数达到了109cfu/ml的水平，虽然生长到稳定期的时间需要2天以上，但副干酪乳杆菌l6041在低温条件下的存活的时间也更长；在35℃温度下，菌株生长快速，不到24小时菌株就生长到稳定期，但随着时间的延长，菌体生长活性也下降较快；在25℃温度下，菌株在稳定期菌密度最大，可认为菌活数最高。
[0029]
具体实施方式三：本实施方式黄贮复合生物发酵剂由纤维素复合酶和副干酪乳杆菌(lactobacillus paracasei)l6041组成。
[0030]
纤维素复合酶中包括纤维素酶、半纤维素酶、糖化酶、酸性蛋白酶等。
[0031]
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式三的不同点在于：纤维素复合酶与副干酪乳杆菌(lactobacillus paracasei)l6041发酵液的质量比为1∶15～25。其它与具体实施方式三相同。
[0032]
副干酪乳杆菌(lactobacillus paracasei)l6041发酵液中副干酪乳杆菌(lactobacillus paracasei)l6041的浓度为108～109cfu/g。
[0033]
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式三的不同点在于：纤维素复合酶与
副干酪乳杆菌(lactobacillus paracasei)l6041发酵液的质量比为1∶20。其它与具体实施方式三相同。
[0034]
具体实施方式六：本实施方式黄贮方法：向用于黄贮的干秸秆中添加具体实施方式三至五之一的黄贮复合生物发酵剂、葡萄糖和水，然后进行厌氧发酵；
[0035]
其中，葡萄糖的添加量为干秸秆重量的0.8％～1.2％，黄贮复合生物发酵剂的添加量为干秸秆重量的8％～12％。
[0036]
纤维素复合酶、副干酪乳杆菌发酵液和葡萄糖加水混拌均匀后与黄贮的干秸秆搅拌均匀。
[0037]
具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式六的不同点在于：纤维素复合酶与副干酪乳杆菌(lactobacillus paracasei)l6041发酵液的质量比为1∶20；葡萄糖的添加量为干秸秆重量的1％；黄贮复合生物发酵剂的添加量为干秸秆重量的10.5％；副干酪乳杆菌(lactobacillus paracasei)l6041发酵液中副干酪乳杆菌(lactobacillus paracasei)l6041的浓度为108～109cfu/g。其它与具体实施方式六相同。
[0038]
具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式七的不同点在于：15℃
±
1℃条件下进行黄贮。其它与具体实施方式六或七相同。
[0039]
具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式七的不同点在于：25～28℃条件下进行黄贮。其它与具体实施方式六或七相同。
[0040]
实施例1
[0041]
用黄贮袋进行发酵，每袋加入处理的样品1公斤左右。共设定3个处理，每个处理共计15袋，25～28℃条件下进行黄贮，分别在第7天、第14天、第21天、第28天进行拆袋测定乳酸菌活数、中性与酸性洗涤纤维含量、水分和ph。
[0042]
每个处理方式如下：
[0043]
处理1：将干秸秆直接加入水；干秸秆∶水＝1∶2。
[0044]
处理2：按照干秸秆量的0.5％添加纤维素复合酶，再加入水混合均匀，干秸秆∶水＝1∶2。
[0045]
处理3：添加黄贮复合生物发酵剂、葡萄糖和水，然后进行厌氧发酵；其中，干秸秆∶水＝1∶2；葡萄糖的添加量为干秸秆重量的1％，黄贮复合生物发酵剂(由纤维素复合酶和副干酪乳杆菌l6041组成)的添加量为干秸秆重量的10.5％；纤维素复合酶与副干酪乳杆菌(lactobacillus paracasei)l6041发酵液的质量比为1∶20；副干酪乳杆菌(lactobacillus paracasei)l6041发酵液中副干酪乳杆菌(lactobacillus paracasei)l6041的浓度为108～109cfu/g；纤维素复合酶、副干酪乳杆菌发酵液和葡萄糖加水混拌均匀后与黄贮的干秸秆搅拌均匀。
[0046]
发酵天数与发酵指标变化情况如表3所示，发酵天数与中性洗涤纤维及酸性洗涤纤维素变化情况如表4所示。
[0047]
表3
[0048][0049][0050]
表4
[0051][0052]
实验结果：在1个月的时间内发现处理2的样品与处理3的样品中乳酸菌菌活数优
于处理1，尤其添加副干酪乳杆菌的样品，乳酸菌的菌活数明显增加，达到了每克样品中108的级别。随着时间的延长，处理3的ph下降明显，在14天的时候就降到了4以下，说明副干酪乳杆菌的添加促进了乳酸菌的发酵，代谢后产酸量增大。在30天的时间内中性与酸性洗涤纤维的含量较之处理1下降明显，处理3加入纤维素酶与副干酪乳杆菌后，中性与酸性洗涤纤维的含量下降明显，尤其酸性洗涤纤维的降幅更大，在第14天的时候就下降了超过5％，第28天时下降了10.3％；而中性洗涤纤维在第21天的时候下降也接近了5％，28天时下降超过了5％。说明纤维素酶与副干酪乳杆菌的加入有效的促进了秸秆纤维素的降解，缩短了秸秆软化的时间，缩短了秸秆的发酵时间。气味方面，在发酵到第7天的时候，处理3的样品就具有了明显的酸香略带果香的味道，而处理2组仅仅是略酸味，处理1组没有明显的气味变化。
[0053]
本发明技术方案对于秸秆的饲料化应用具有促进的作用，菌酶联合应用秸秆发酵具有良好的市场前景。