可提高菌株核苷产量的蛋白突变体及其应用的制作方法

本发明涉及生物工程领域，具体涉及可提高菌株核苷产量的蛋白突变体及其应用。

背景技术：

1、核苷是一类糖苷的总称。核苷是核酸和核苷酸的组成成分。核苷都是由d-核糖或d-2-脱氧核糖与嘧啶碱或嘌呤碱缩合而成。由d-核糖生成的核苷称核糖核苷，参与rna组成，由d-α-脱氧核糖生成的核苷称脱氧核糖核苷，参与dna组成。

2、腺苷即腺嘌呤核苷，化学名为6-氨基-9-β-d-呋喃核糖基-9-氢嘌呤，它是腺嘌呤核苷酸脱磷酸后的产物，属于重要的核苷酸衍生物。腺苷是一种遍布人体细胞的内源性核苷，可直接进入心肌经磷酸化生成腺苷酸，参与心肌能量代谢，同时还参与扩张冠脉血管，增加血流量，广泛应用于医药等行业。

3、鸟苷的化学名称为9-β-d-呋喃核糖鸟嘌呤，其可作为食品或医药原料的中间体，用于生产5’-鸟苷酸二钠、鸟嘌呤、利巴韦林、阿昔洛韦、泛昔洛韦等食品添加剂或医药原料。

4、肌苷的化学名称为9-β-d-核糖次黄嘌呤，系细胞代谢改善药，参与体内核酸代谢，在体内转变为肌苷酸及三磷酸腺苷，参与细胞的能量代谢和蛋白质合成，提高各种酶，特别是辅酶a与丙酮酸氧化酶的活性，从而使细胞在缺氧状态下继续进行代谢，活化肝脏功能，促进受损伤肝脏的恢复，可刺激体内产生抗体并促进肠道对铁的吸收。

5、基因工程菌以细菌作为宿主菌优势明显，如发酵周期短、原料要求简单、基因工程技术成熟等。目前，微生物发酵是生产核苷主要的方法，所用生产菌主要是芽孢杆菌类，包括解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌及短小芽孢杆菌等。芽孢杆菌类作为核苷的出发菌株，其优势是磷酸戊糖途径比较活跃，嘌呤核苷磷酸化酶活力低。在芽孢杆菌属中，包括枯草芽孢杆菌在内的许多菌株具有可靠的安全性。传统菌株选育发现，芽孢杆菌的突变株能够过量合成叶酸、腺苷、肌苷、鸟苷、核黄素等一系列嘌呤途径代谢中间产物或该途径的衍生代谢产物，成为选育高产核苷类代谢产物重要出发菌株。

技术实现思路

1、本发明意外发现，当腺嘌呤脱氨酶(yera；由yera基因编码)第209位甘氨酸突变为谷氨酸，第228位天冬氨酸突变为丙氨酸时，有利于提高核苷的产量。同样的，当天冬氨酸激酶3突变体(ak3；由yclm基因编码)第320位谷氨酸突变为赖氨酸，第342位脯氨酸突变为亮氨酸时，也有利于提高核苷的产量。而且，在一个蛋白同时发生两处突变，及两个蛋白同时发生上述四处突变时，可以逐渐地进一步地提升核苷产量。

2、基于上述发现，本发明提供了可提高菌株核苷产量的蛋白突变体及其应用。

3、具体而言，本发明首先提供了可提高菌株核苷产量的蛋白突变体，其包括：

4、1)腺嘌呤脱氨酶突变体，其在野生型腺嘌呤脱氨酶的基础上发生以下至少一个突变：a)第209位甘氨酸突变为谷氨酸；b)第228位天冬氨酸突变为丙氨酸；和/或，

5、2)天冬氨酸激酶3突变体，其在野生型天冬氨酸激酶3的基础上发生以下至少一个突变：a)第320位谷氨酸突变为赖氨酸；b)第342位脯氨酸突变为亮氨酸。

6、其中，yera编码推定的腺嘌呤脱氨酶，是核苷支路降解的关键基因，核苷合成途径需要腺嘌呤用于菌体生长代谢，所以该基因弱化或失活有利于嘌呤核苷合成。

7、之前有文献报道过可敲除其编码同功酶的基因adec用于核黄素生产，而敲除该基因可能会影响菌体生长，但没有通过点突变方式对该基因进行修饰。本发明则是通过腺嘌呤脱氨酶其第209位甘氨酸变为谷氨酸，和/或第228位天冬氨酸变为丙氨酸进行修饰。

8、yclm编码天冬氨酸激酶3，是天冬氨酸向天冬氨酰-4-磷酸合成途径的关键基因，发现点突变修饰该基因或许能够降低该酶的活性，减弱该支路合成。核苷合成需要2个l-天冬氨酸作为前体，间接增加前体供应，促进核苷合成。

9、优选地，所述野生型腺嘌呤脱氨酶源自枯草芽孢杆菌。

10、作为优选，所述腺嘌呤脱氨酶突变体的氨基酸序列如seq id no.2(含g209e突变)、seq id no.4(含d228a突变)或seq id no.9(含g209e突变和d228a突变)所示。

11、优选地，所述野生型天冬氨酸激酶3源自枯草芽孢杆菌。

12、作为优选，所述天冬氨酸激酶3突变体的氨基酸序列如seq id no.6(含e320k突变)、seq id no.8(含p342l突变)或seq id no.10(含e320k突变和p342l突变)所示。

13、所述的可提高菌株核苷产量的蛋白突变体可以包括上述任意的腺嘌呤脱氨酶突变体和天冬氨酸激酶3突变体的组合。比如，作为一种优选的实施方案，所述的可提高菌株核苷产量的蛋白突变体包括：1)氨基酸序列如seq id no.2或seq id no.9所示的腺嘌呤脱氨酶突变体；和，2)氨基酸序列如seq id no.8或seq id no.10所示的天冬氨酸激酶3突变体。

14、本领域技术人员应该理解，在上述蛋白突变体序列的n端或c端添加标签蛋白或将其与其他蛋白进行融合形成融合蛋白，在不改变上述突变蛋白本身的活性的情况下，上述添加标签的蛋白或融合蛋白也在本发明的保护范围内。

15、第二方面，本发明还提供编码所述的蛋白突变体的核酸。

16、根据上述提供的蛋白突变体，本领域技术人员能够获得其编码核酸的序列。基于密码子的简并性，编码上述氨基酸序列的核酸序列不止一种，所有能够编码上述蛋白突变体的核酸均在本发明的保护范围内。

17、优选地，编码野生型腺嘌呤脱氨酶的核酸源自枯草芽孢杆菌。

18、作为优选，编码所述腺嘌呤脱氨酶突变体的核苷酸序列如seq id no.1(含g209e突变)或seq id no.3(含d228a突变)所示。

19、优选地，编码野生型天冬氨酸激酶3的核酸源自枯草芽孢杆菌。

20、作为优选，编码所述天冬氨酸激酶3突变体的核苷酸序列如seq id no.5(含e320k突变)或seq id no.7(含p342l突变)所示。

21、进一步的，本发明还提供含有所述核酸的生物材料，所述生物材料为表达盒、载体或宿主细胞。

22、所述表达盒为在所述核酸的上游或下游连接用于驱动其转录、表达的元件得到的重组核酸分子。

23、所述载体可为表达载体或克隆载体，包括但不限于质粒载体、噬菌体载体、转座子等。

24、所述宿主细胞包括但不限于菌株细胞。

25、第三方面，本发明提供所述的蛋白突变体或所述的核酸或所述的生物材料在以下任一方面的应用：

26、(1)构建高产核苷或其衍生物的菌株；

27、(2)筛选高产核苷或其衍生物的菌株。

28、优选所述菌株选自枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、产氨棒杆菌中的一种。

29、优选所述核苷为腺苷、肌苷、鸟苷、黄苷中的一种或多种；其衍生物为肌苷酸、鸟苷酸、黄苷酸、次黄苷酸、腺嘌呤、鸟嘌呤、黄嘌呤、次黄嘌呤、核黄素中的一种或多种。

30、进一步的，本发明还提供一种菌株，其表达所述的蛋白突变体；和/或，其含有所述的核酸。

31、作为优选，所述菌株同时表达所述腺嘌呤脱氨酶突变体和天冬氨酸激酶3突变体；和/或，其同时含有编码所述腺嘌呤脱氨酶突变体和天冬氨酸激酶3突变体的核酸。

32、进一步优选地，所述菌株同时表达所述腺嘌呤脱氨酶突变体和天冬氨酸激酶3突变体，所述腺嘌呤脱氨酶突变体在野生型腺嘌呤脱氨酶的基础上至少发生了第209位甘氨酸突变为谷氨酸的突变，所述天冬氨酸激酶3突变体在野生型天冬氨酸激酶3的基础上至少发生第342位脯氨酸突变为亮氨酸的突变。

33、作为优选，所述菌株选自枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、产氨棒杆菌中的一种。

34、第四方面，本发明还提供所述的菌株在生产核苷或其衍生物中的应用。

35、具体的，本发明进一步提供一种生产核苷或其衍生物的方法，其包括：培养所述的菌株，以产生、积累和收集核苷或其衍生物。

36、基于上述技术方案，本发明的有益效果如下：

37、本发明通过点突变即可实现对菌株核苷产量的提升，其不仅有效积累了菌株所产生的核苷(尤其包括腺苷)，提高了核苷的产量，而且还不影响菌体生长，为核苷的工业化生产奠定了基础。