一种原位高效复合根瘤菌群

g，ph 7.0，蒸馏水定容到1000 ml。
10.本发明具有以下有益效果：1、本发明的复合根瘤菌群，增加大豆结瘤效率，提升大豆固氮效率，减少化肥农药施用，具有良好的生态效益，具备广阔的应用前景。
11.2、一般的，在减少尿素50%的条件下，作物仍可增产5-25%。若每亩减少尿素50%，折合底肥尿素可减少3-4公斤，则每亩地可节省投资费用5-8元，平均每亩约为6.5元；若每亩地增产5-25%，折合增加产量可为5.6-28公斤，平均每亩增产约为16.8公斤，则平均可增加收入为47.02元；使用大豆根瘤菌每亩的基本投入为5元，综上所述，使用大豆根瘤菌后当年平均每亩可增加收益约为48.52元。本发明施肥方法具有良好的生态、经济效益。
附图说明
12.图1为不同筛选方法复合菌群ph变化。
具体实施方式
13.为使本发明的技术方案便于理解，以下结合具体实施例对一种原位高效复合根瘤菌群作进一步的说明，并通过盆栽试验验证筛选得到的原位高效复合根瘤菌群与对比例之间在根瘤数、根瘤鲜重、根瘤干重以及固氮酶活等方面的对比来说明本发明原位高效复合根瘤菌群所具有的有益效果。
14.实施例1：原位高效复合根瘤菌群的筛选：（1）选取生长良好的新鲜大豆根瘤，不经过消毒，也不粉碎，直接放入 200 ml yma 液体培养基中，28
±
2℃ 培养 5 天；所述复合根瘤菌剂yma液体培养基可以从市场购买或按下述配方进行配置，配方为：甘露醇（mym biological technology company limited） 10 g，酵母粉 （oxoid ltd，lp0021） 3 g，mgso4（北京化工厂） 0. 2 g，nacl （鼎国生物技术发展中心） 0. 1 g，k2hpo4（西陇化工股份有限公司） 0. 25 g，kh2po
4 （西陇化工股份有限公司）0. 25 g，ph 6.8
±
0.2，蒸馏水定容到1000 ml；（2）吸取（1）中培养好的菌液 1ml 加入 200ml yma 液体培养基中继代培养，5 天一代，传代 50 天，直至 ph 稳定，获得稳定的原位高效复合根瘤菌群。
15.对筛选得到的原位高效复合根瘤菌群进行盆栽试验验证，基质采用蛭石与营养土的混合物，体积比1：1，每盆盆栽播种 4 粒大豆种子，将筛选获得的复合菌群，稀释 50 倍，浇灌 200 ml菌液，之后每 3 天浇水一次，每个处理 5 个重复，35 天后测定根瘤数量、根瘤鲜重、根瘤干重、固氮酶活。
16.对实施例1筛选得到的原位高效复合根瘤菌群中菌种进行人工筛选：1、将复合菌群在yma液体培养基上活化，28
±
2℃ 培养 3 天。
17.2、吸取1ml活化好的菌液于9ml灭菌水种，梯度稀释成10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7，10-8，10-9的菌液。
18.3、吸取10-4，10-5，10-6，10-7，10-8，10-9稀释度的菌液100 μl，分别在yma 平板上涂布均匀，28
±
2℃ 培养 3 天。
19.4、根据菌落形态、大小、颜色、透明度、边缘是否光滑和菌落是否湿润等特征，选取单独的菌落分别于yma平板上划线分离，28
±
2℃ 培养 3 天，反复纯化5次，确保得到单菌。
20.5、采用诺唯赞fastpure bacteria细菌基因组提取试剂盒提取菌株dna。
21.6、16s rdna pcr采用细菌通用引物27f 5
′‑
agagtttgatcctggctca
′
和1492r 5
′‑
ggttaccttgttacgactt-3
′
。反应体系与反应程序见表1和表2：表1 16s rdna pcr反应体系表2 16s rdna pcr反应程序7、扩增完成后取pcr产物5 μl与1 μl上样缓冲液混合，1%琼脂糖凝胶（含eb）电泳160 v，30 min。电泳后，用凝胶成像仪扫描照相，图像保存为tiff格式。剩余pcr产物置于-20℃下保存备用。
22.8、用于测序的pcr扩增产物送交至生工生物工程(上海)股份有限公司，完成序列的测定。
23.9、从genbank中获取参比菌株的16s rdna序列，进行blast比对（ncbi），挑选与目的菌株具有最近亲缘关系的菌种，菌株的 16s rdna 序列提交 genbank，并获得相应编号。
24.所述复合根瘤菌群主要包括苍白杆菌属(ochrobactrum)的ochrobactrum intermedium (ccug 24694) 黄杆菌；微杆菌属(microbacterium)的microbacterium thalassium (cip 105728) 地贫微杆菌；寡养单胞菌属 (stenotrophomonas)的stenotrophomonas maltophilia (atcc 13637) 嗜麦芽窄食单胞菌；微杆菌属(microbacterium)的microbacterium aerolatum (ccm 4955) 气溶胶微杆菌；金黄杆菌属(chryseobacterium)的chryseobacterium proteolyticum (ferm p-17664) 溶蛋白金黄杆菌。
25.对比例1：同实施例1相比，其区别在于，盆栽验证试验不添加任何菌剂，作为空白对照。
26.对比例2：同实施例1相比，其区别在于，盆栽验证试验单独添加一株高效根瘤菌5038 （cgmcc 16747），作为对照。
27.对比例3：同实施例1相比，其区别在于，选取生长良好的新鲜大豆根瘤，表面使用95%乙醇消毒30s，0.1%升汞浸泡5min，然后用灭菌的竹签戳破根瘤，放入 200ml yma 液体培养基中，28
±
2℃培养5天。
28.对比例4：同实施例1相比，其区别在于，选取生长良好的新鲜大豆根瘤，不经过表面消毒，用灭菌的竹签戳破根瘤，直接放入 200ml yma 液体培养基中，28
±
2℃培养5天。
29.记录55天筛选菌群的ph，结果如图1所示，统计测定每盆大豆的根瘤数、根瘤鲜干重以及固氮酶活，结果如表 3所示：表3 不同菌群接种大豆结瘤情况及固氮能力 对比实施例1、对比例3和对比例4三种不同筛选复合根瘤菌群方法获得的菌群，ph 在 40 天达到稳定并保持在 6.3-6.8 之间，但是群落结构却具有明显差异。实施例1筛选获得的菌群，接种大豆 35 天，结瘤数量最多，固氮能力最高，能够促进大豆结瘤固氮，具有很好的应用前景。
30.以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上和实质上的限制，凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用以上所揭示的技术内容，而作出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对以上实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。