SARS-CoV-2病毒样颗粒的制备方法及其应用

sars-cov-2病毒样颗粒的制备方法及其应用
技术领域
1.本发明涉及分子生物学技术领域，特别是涉及sars-cov-2病毒样颗粒的制备方法及其应用。


背景技术：

2.病毒样颗粒(vlp)是一种由病毒单一或多个结构蛋白自行装配而成的高度结构化的蛋白颗粒。vlp在宿主内无法实现复制繁殖，但是其包含部分或全部蛋白，仍然可以很好地引起宿主的强免疫响应。因此，vlp可以作为一种潜在的高效疫苗制剂。一般而言，所有的vlp均可形成独特的结构，其表面布满了重复的蛋白结构，其较强的免疫原性使其可作为疫苗。vlp在疫苗研究中倍受关注，目前上市或在研的vlp疫苗中，人用vlp疫苗主要有hbv疫苗、hpv疫苗以及hev疫苗，而兽用vlp疫苗为用于预防猪圆环病毒2型。在研的人用vlp疫苗还涉及了多种病毒，包括流感病毒、艾滋病病毒、埃博拉病毒等，在研兽用vlp疫苗则还有口蹄疫病毒、猪细小病毒疫苗、猪瘟病毒等。然而，目前大部分的vlp中只含有部分或者全部的结构蛋白，在对非结构蛋白、辅助蛋白等方面的研究受限，且作为疫苗引起的免疫反应有限。
3.新型冠状病毒(sars-cov-2)是一种单链rna病毒，具有较高的病毒变异能力，其变异毒株具有更高的病毒传染力，因此，疫苗的开发尤为重要。尽管基于多种技术的sars-cov-2疫苗已经进入临床阶段，基于sars-cov-2vlp疫苗研究较少。其中一个关键的原因是缺乏一个简单，高效的sars-cov-2vlp合成与制备平台。


技术实现要素：

4.鉴于目前存在的技术问题，本发明提供了一种sars-cov-2vlp从头人工合成及制备方法，包括将sars-cov-2基因组拆分为多个片段，合成这些片段并将其组装在载体上，转染包装细胞获得vlp。
5.本发明的第一方面提供一种用于制备sars-cov-2病毒样颗粒的组合物，包括下述(a)，还包括选自下述(b)和(c)中的任一种或任两种：
6.(a)包含struδs片段的第一质粒，所述δs片段包含编码sars-cov-2病毒的至少一种结构蛋白或其突变体和/或至少一种辅助蛋白或其突变体的核酸序列，且所述δs片段不包含编码sars-cov-2病毒的s蛋白或其突变体的核酸序列；
7.(b)包含s片段的第二质粒，所述s片段包含编码sars-cov-2病毒的s蛋白或其突变体的核酸序列；
8.(c)包含sars-cov-2病毒的包装信号片段的第三质粒，所述包装信号片段包含sars-cov-2病毒的包装信号序列。
9.在一些实施方案中，所述的s蛋白的突变体相对于sars-cov-2病毒的s蛋白的突变包括n331q、n501y、d614g和/或p681h。
10.在一些实施方案中，所述struδs片段包含下述任一种：
11.(1)编码sars-cov-2病毒的除s蛋白之外的全部结构蛋白和全部辅助蛋白的核酸序列；
12.(2)与(1)相比，所述结构蛋白和辅助蛋白中的至少一种相对于野生型sars-cov-2病毒具有突变；和
13.(3)与(1)相比，缺失所述结构蛋白和辅助蛋白中的任一种。
14.在一些实施方案中，所述包装信号序列是ncbi序列号nc_045512.2的第19900-20000位核苷酸或ncbi序列号nc_045512.2的第19773-20335位核苷酸。
15.在一些实施方案中，所述包装信号片段包含sars-cov-2病毒基因组的orf1ab。
16.本发明的另一方面提供了上述组合物的制备方法，包括分别通过下述方法制备第一质粒、第二质粒和/或第三质粒：
17.(1)将struδs片段、s片段和/或orf1ab包装信号片段分别拆分为在相邻片段之间具有同源序列的dna短片段；
18.(2)将由步骤(1)获得的dna短片段和线性化质粒载体转入酵母细胞中，进行同源重组，分别获得第一质粒、第二质粒和/或第三质粒。
19.本发明的另一方面提供了sars-cov-2病毒样颗粒的制备方法，包括：用上述任一种的组合物转染包装细胞，获得sars-cov-2病毒样颗粒。
20.在一些实施方案中，该制备方法，还包括分别通过下述方法制备第一质粒、第二质粒和/或第三质粒：
21.(1)将struδs片段、s片段和/或包装信号片段分别拆分为在相邻片段之间具有同源序列的dna短片段；
22.(2)将由步骤(1)获得的dna短片段和线性化质粒载体转入酵母细胞中，进行同源重组，分别获得第一质粒、第二质粒和/或第三质粒。
23.在一些实施方案中，所述制备方法，进一步包括将第一质粒、第二质粒和/或第三质粒分别在大肠杆菌中进行扩增，然后转染包装细胞。
24.本发明的另一方面提供由上述制备方法制备获得的sars-cov-2病毒样颗粒。
25.本发明的另一方面提供由上述组合物组合物或由上述制备方法制备获得的sars-cov-2病毒样颗粒在制备用于预防或治疗sars-cov-2病毒感染的疫苗中的用途。
26.本发明的另一方面提供由上述组合物组合物或由上述制备方法制备获得的sars-cov-2病毒样颗粒在体外用于sars-cov-2病毒感染细胞的研究中的用途。
27.所述sars-cov-2病毒感染细胞的研究可以是研究vlp与细胞的相互作用、研究病毒对细胞的侵染过程和/或研究病毒成分的作用等。
28.本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：
29.a、本发明利用哺乳细胞真核表达系统表达sars-cov-2的结构蛋白、非结构蛋白及辅助蛋白等以组装成vlp，可用于疫苗，该疫苗制备方法不涉及活病毒。相比于灭活病毒疫苗和减毒活疫苗，该方法安全性更好；相比于多肽或核酸疫苗，该方法免疫原性更好。
30.b、本发明采用病毒基因组拆分的方法，先合成小片段基因，再通过酵母同源重组系统进行基因组组装，该方法简便、快速且效率高。
31.c、本发明利用基因组拆分策略，vlp中含有结构蛋白与非结构蛋白等完整的病毒粒子形貌，免疫原性强，有望发展成为具有交叉保护效力的高效疫苗。
附图说明
32.通过以下详细的描述并结合附图将更充分地理解本发明，其中相似的元件以相似的方式编号，其中：
33.图1显示了sars-cov-2假病毒的生成。(a)全长sars-cov-2基因组和拆分部分的方案，包括sars-cov-2s、orf1ab和struδs基因组。(b)分离的sars-cov-2基因组在酵母中组装以构建质粒sars-cov-2s、orf1ab和struδs。(c)sars-cov-2假病毒是通过共转染质粒sars-cov-2s、orf1ab和struδs获得的。sars-cov-2假病毒感染293t/hace2细胞后不能产生子代病毒。
34.图2显示了sars-cov-2假病毒的构建和表征。(a)转染后24小时，共转染质粒sars-cov-2s、orf1ab-mcherry和struδs-egfp的293t细胞的共聚焦显微镜图像。(b)通过蛋白质印迹检测细胞裂解液(上)和sars-cov-2假病毒(下)中的sars-cov-2s和n蛋白。gapdh用作蛋白质印迹的上样对照。(c)tem检测到的sars-cov-2假病毒和vlps的形态和大小。比例尺：20nm。通过共转染质粒sars-cov-2s、orf1ab-mcherry和struδs-egfp获得的sars-cov-2假病毒用于293t/hace2细胞侵染的共聚焦显微镜图像(d)和实验方案(e)。
35.图3显示了包装信号(ps)的分析和验证。(a)使用biopython软件分析sars-cov-2、sars-cov和类蝙蝠sars-cov的orf1b区域的序列(nt 19500-20400)。这三种sars相关病毒中相同位置的二级结构由rnastructure web server使用默认参数预测，并由vienna rna web server进行分析。两个相同的rna茎环(sl1和sl2)用矩形框指示。(b)由质粒egfp-ps583转染的细胞裂解液中ps583基因的rt-pcr分析。红色箭头指示预期的扩增序列。nrt：未逆转录组。(c)通过蛋白质印迹检测细胞裂解液(左)和vlp(egfp-ps583)(右)中的egfp、sars-cov-2s和n蛋白。gapdh用作蛋白质印迹和rt-pcr的上样对照。用vlp(egfp-ps583)侵染293t/hace2细胞48小时后的共聚焦显微镜成像(d)和实验方案(e)。用vlp(egfp-ps583)侵染293t细胞和vlp(egfp)侵染293t/hace2细胞作为对照。。
36.图4显示了不同sars-cov-2蛋白的功能验证。(a)细胞质中dio标记的sars-cov-2vlp的统计分析，以测试sars-cov-2s突变对病毒侵染能力的影响。(b)vlp(egfp-ps583)、vlp(δn-egfp-ps583)或vlp(egfp)侵染293t/hace2细胞后的共聚焦显微镜成像图，观察侵染后48小时后细胞内的绿色荧光。(c)通过蛋白质印迹检测不同类型vlp中的s和n蛋白。通过tem观察vlp的形态和大小。比例尺：20nm。
37.图5显示了(a)双荧光标记vlp(qd-dio)的方案。(b)通过tem表征vlp(qd-dio)的形态和大小，白色箭头指示qd。比例尺：20nm。(c)vlp(qd-dio)中dio和qd信号的共定位。(d)vlp(qd-dio)进入293t/hace2细胞的动态过程。(e)293t/hace2细胞的微分干涉对比(dic)图像。黑线指示了病毒的轨迹。(f,g)分析(d)中显示的病毒粒子的平均速度(f)和msd图(g)。(h)vlp(qd-dio)的rna-qd和env-dio在293t/hace2细胞中实时解离的动态过程。(i-k)rna-qd和env-dio的轨迹(i)、平均速度(j)和msd图(k)。
38.图6显示了sars-cov-2s质粒的构建和表征。(a)细胞裂解液中sars-cov-2s蛋白编码基因的rt-pcr分析。红色箭头指示预期的扩增序列。nrt：未逆转录组。(b)通过蛋白质印迹检测细胞裂解液中sars-cov-2s蛋白，gapdh用作蛋白质印迹和rt-pcr的上样对照。
39.图7显示了sars-cov-2struδs-egfp质粒的构建和表征。(a)struδs-egfp构建的示意图。(b)细胞裂解液中sars-cov-2orf3a和n蛋白编码基因的rt-pcr分析，红色箭头指示
预期的扩增序列，gapdh用作上样对照，nrt：未逆转录组。(c)sars-cov-2struδs-egfp质粒转染293t细胞24小时后的荧光成像。(d)通过蛋白质印迹检测细胞裂解液(左)和vlp(右)的n蛋白，gapdh用作上样对照。(e)通过透射电子显微镜检测sars-cov-2vlp(struδs)的形态和大小。比例尺：20nm。
40.图8显示了sars-cov-2orf1ab-mcherry质粒的构建和表征。(a)orf1ab-mcherry构建的示意图。(b)细胞裂解物中sars-cov-2nsp1和nsp16编码基因的rt-pcr分析，红色箭头指示预期的扩增序列，gapdh用作上样对照，nrt：未逆转录组。(c)sars-cov-2orf1ab-mcherry质粒转染293t细胞24小时后的荧光成像。
41.图9显示了sars-cov-2vlp(struδs-s)的构建和表征。(a)sars-cov-2struδs-egfp和s质粒共转染293t细胞24小时后的荧光成像。(b)通过蛋白质印迹检测细胞裂解液(上)和vlp(struδs-s)(下)的n蛋白，gapdh用作上样对照。(c)通过透射电子显微镜检测sars-cov-2vlp(struδs-s)的形态和大小。比例尺：20nm。
42.图10显示了sars-cov-2vlp(struδs-orf1ab)的构建和表征。(a)sars-cov-2struδs-egfp和orf1ab-mcherry质粒共转染293t细胞24小时后的荧光成像。(b)通过蛋白质印迹检测细胞裂解液(上)和vlp(struδs-orf1ab)(下)的n蛋白，gapdh用作上样对照。(c)通过透射电子显微镜检测sars-cov-2vlp(struδs-orf1ab)的形态和大小。比例尺：20nm。
43.图11显示了假sars-cov-2病毒生物安全性的验证。(a)通过蛋白质印迹检测构建293t/hace2细胞上hace2受体的表达。(b)通过蛋白质印迹检测细胞裂解液(左)和上清(右)的s和n蛋白。(c)通过vlp或质粒sars-cov-2s，orf1ab-mcherry和struδs-egfp共转染后感染293t/hace2细胞48小时，gapdh用作上样对照。(c)感染野生型sars-cov-2病毒和sars-cov-2vlp后72小时后的293t/hace2细胞图像。
44.图12显示了基于比对共有序列的rna结构预测。多重比对locarna使用默认参数预测的蝙蝠sars样冠状病毒ps(mg772933.1:19773-20355)，sars ps(nc-004718.3:19712-20294)和sars-cov-2ps(nc-045512.2:19773-20355)的共有结构。
45.图13显示了包装信号的分析和验证。(a)通过rt-pcr检测细胞裂解液中ps101基因，红色箭头指示预期的扩增序列，gapdh用作上样对照，nrt：未逆转录组。(b)通过蛋白质印迹检测细胞裂解液(左)和vlp(右)的s，n蛋白和egfp，gapdh用作上样对照。(c)vlp(egfp-ps101)和vlp(egfp)感染293t/hace2细胞48小时后的荧光成像。
46.图14显示了sars-cov-2s(n331q)构建和表征。(a)sars-cov-2s(n331q)构建的示意图。(b)细胞裂解液中sars-cov-2s(n331q)编码基因的rt-pcr分析，红色箭头指示预期的扩增序列，nrt：没有逆转录。(c)通过蛋白质印迹检测细胞裂解液中sars-cov-2s(n331q)蛋白，gapdh用作蛋白质印迹和rt-pcr的上样对照。
47.图15显示了sars-cov-2s(n501y)构建和表征。(a)sars-cov-2s(n501y)构建的示意图。(b)细胞裂解物中sars-cov-2s(n501y)编码基因的rt-pcr分析，红色箭头表示预期的扩增子，nrt：未逆转录组。(c)通过蛋白质印迹检测细胞裂解液中sars-cov-2s(n501y)蛋白，gapdh用作蛋白质印迹和rt-pcr的上样对照。
48.图16显示了sars-cov-2s(d614g)构建和表征。(a)sars-cov-2s(d614g)构建的示意图。(b)细胞裂解液中sars-cov-2s(d614g)编码基因的rt-pcr分析，红色箭头指示预期的扩增序列，nrt：未逆转录组。(c)通过蛋白质印迹检测细胞裂解液中sars-cov-2s(d614g)蛋
白，gapdh用作蛋白质印迹和rt-pcr的上样对照。
49.图17显示了sars-cov-2s(p681h)构建和表征。(a)sars-cov-2s(p681h)构建的示意图。(b)细胞裂解液中sars-cov-2s(p681h)编码基因的rt-pcr分析，红色箭头指示预期的扩增序列，nrt：未逆转录组。(c)通过蛋白质印迹检测细胞裂解液中sars-cov-2s(p681h)蛋白，gapdh用作蛋白质印迹和rt-pcr的上样对照。
50.图18显示了具有s蛋白突变的sars-cov-2vlp的构建和表征。通过蛋白质印迹检测vlp(n331q)(a)，vlp(n501y)(b),vlp(d614g)(b)和vlp(p681h)(d)。通过透射电子显微镜检测sars-cov-2vlp的形态和大小。比例尺：20nm。
51.图19显示了sars-cov-2struδs-egfp/δn质粒的构建和表征。(a)sars-cov-2struδs-egfp/δn质粒构建示意图。(b)细胞裂解液中sars-cov-2orf3a和n蛋白编码基因的rt-pcr分析，红色箭头指示预期的扩增序列，nrt：未逆转录组。(c)通过蛋白质印迹检测细胞裂解液中sars-cov-2n蛋白，gapdh用作蛋白质印迹和rt-pcr的上样对照。
52.图20显示了sars-cov-2struδs-egfp/δe质粒的构建和表征。(a)sars-cov-2struδs-egfp/δe质粒构建示意图。(b)细胞裂解液中sars-cov-2orf3a，e和n蛋白编码基因的rt-pcr分析，红色箭头指示预期的扩增序列，nrt：未逆转录组。(c)通过蛋白质印迹检测细胞裂解液中sars-cov-2n蛋白，gapdh用作蛋白质印迹和rt-pcr的上样对照。
53.图21显示了e蛋白缺失的sars-cov-2vlp(vlp/δe)的构建和表征。(a)通过透射电子显微镜检测vlp/δe的形态和大小。比例尺：20nm。(b)vlp/δe感染293t/hace2细胞48小时后的共聚焦显微镜成像图。
54.图22显示了sars-cov-2struδs-egfp/δm质粒的构建和表征。(a)sars-cov-2struδs-egfp/δm质粒构建示意图。(b)细胞裂解液中sars-cov-2orf3a，m和n蛋白编码基因的rt-pcr分析，红色箭头指示预期的扩增序列，nrt：未逆转录组。(c)通过蛋白质印迹检测细胞裂解液中sars-cov-2n蛋白，gapdh用作蛋白质印迹和rt-pcr的上样对照。
55.图23显示了m蛋白缺失的sars-cov-2vlp(vlp/δe)的构建和表征。(a)通过透射电子显微镜检测vlp/δm的形态和大小。比例尺：20nm。(b)vlp/δm感染293t/hace2细胞48小时后的共聚焦显微镜成像图。
56.图24显示了sars-cov-2struδs-egfp/δorf10质粒的构建和表征。(a)sars-cov-2struδs-egfp/δorf10质粒构建示意图。(b)细胞裂解物中sars-cov-2orf3a，n和orf10蛋白编码基因的rt-pcr分析，红色箭头指示预期的扩增序列，nrt：未逆转录组。(c)通过蛋白质印迹检测细胞裂解液中sars-cov-2n蛋白，gapdh用作蛋白质印迹和rt-pcr的上样对照。
57.图25显示了蛋白缺失的sars-cov-2vlp的表征。(a)蛋白缺失sars-cov-2vlp的质粒构建示意图。(b)蛋白缺失sars-cov-2vlp的荧光共定位结果(dio与qds)。
具体实施方式
58.除非另外指出，本发明中所用的术语具有本领域通常所理解的含义，可以通过参考本领域技术人员已知的标准教科书，参考书、文献加以理解。本文所提供的定义和解释用于明确它们在本发明范围内的特定用途。本发明所引用的参考文献均通过引用将其全文并入本文。
59.不希望受到任何特定理论的束缚，本发明中对于相关理论或机理的解释仅仅是用
于帮助理解发明，不应视为对本发明所保护的方案的限制。
60.本发明中所使用的术语“包含”，或与其具有类似含义的其他术语形式“包括”、“含有”或“具有”等，应当理解为包括所列出的要素，但不排除其他要素的存在；这些术语也包括仅由所列出的要素组成的情况。术语“由
……
组成”是指仅由所列举的要素组成。术语“基本上由
……
组成”表示不排除对所涉及的方案没有显著影响的要素。
61.除非另外特别说明，本文中的“a”、“an”或“the”包括单数形式和复数形式。术语“至少一个”或“至少一种”或其它类似表述的含义等同于“一个或更多个”或“一种或更多种”的含义。
62.本文中所述的数值范围，例如温度范围，时间范围，组成或浓度范围，或其他数值范围等，包括该范围内的端值、所有中间范围、子范围(例如在某个中间值和某个端值之间的范围)以及所有单个数值，特别是以整数数值为端值的中间范围、子范围和单个的整数数值。并且，所述数值范围中所描述的任何中间范围、子范围以及所有单个数值可以从所述的数值范围中排除。
63.本文中所述的“约”、“大约”的意思为所述数值的
±
20％、
±
18％、
±
15％、
±
12％、
±
10％、
±
9％、
±
8％、
±
7％、
±
6％、
±
5％、
±
4％、
±
3％、
±
2％、
±
1％或
±
0.5％的范围，所述范围包扩所述范围的端点及所述范围内的任一数值。
64.本文中所述的术语“和/或”应当理解为由该术语连接的多个要素中的任何一个要素、任意两个要素、任意三个要素或任意的更多个要素组成的组合。
65.本发明中，术语“核酸序列”和“核苷酸序列”可以互换使用，是指由碱基、糖和磷酸骨架连接构成的序列。本发明的核酸序列可以是脱氧核糖核酸序列(dna)或核糖核酸序列(rna)，且可包括天然碱基或非天然碱基，其可以是单链或双链，可以是编码序列或非编码序列。
66.本发明中，当表达基因或基因所编码的蛋白时，“载体”可以是质粒，在一些情况下，术语“载体”和“质粒”可以互换使用。
67.本发明中，除非另有说明，核酸序列的描述通常是从5’端至3’端，氨基酸序列的描述通常是从n端至c端。
68.本发明的方法可以是在体外或体内进行。
69.反向遗传学是病毒拯救(rescuing)或vlp制备的主要手段之一，病毒基因组的获得是其中最为重要的一步。核酸酶连接是获取病毒基因组的主要方法，但是该方法反应过程复杂且效率较低，同时，病毒全长基因组在转化大肠时存在较大的毒性。酵母体内同源重组法是利用酵母细胞内高效的同源重组系统来实现多个相互存在同源系列dna片段的组装方法。本发明通过独特的基因组拆分设计，以及基因组的合成与酵母体内同源重组组装技术，将sars-cov-2的基因组拆分并组装成三个质粒，通过细胞转染，即可获得结构完整性高的sars-cov-2vlp，为进一步的疫苗开发提供了很好的工具平台。
70.具体而言，本发明提供了sars-cov-2的基因组的三个片段，每一个片段被组装到一个质粒中，共获得三个质粒，使用这三个质粒中的任一个、任两个或三个共转染包装细胞，可以获得sars-cov-2的vlp。
71.所述的sars-cov-2可以是野生型的sars-cov-2或者是其任何突变体。野生型sars-cov-2的基因组可由ncbi序列号nc_045512.2确定。
72.所述三个片段分别是包含sars-cov-2的s蛋白的编码序列的s片段、包含除s蛋白之外的所有结构蛋白和所有辅助蛋白的编码序列的struδs片段、以及包含包装信号序列的包装信号片段。
73.sars-cov-2的全部结构蛋白包括s蛋白(刺突糖蛋白)、e蛋白(小包膜蛋白)、m蛋白(膜糖蛋白)和n蛋白(核衣壳蛋白)。sars-cov-2的全部辅助蛋白包括orf3a、orf3b、orf6、orf7a、orf7b、orf8和orf10编码的蛋白。
74.所述s片段编码的s蛋白(刺突糖蛋白)可以是野生型s蛋白或其突变体。在一些实施方案中，s蛋白突变体相对于野生型s蛋白具有选自n331q、n501y、d614g及p681h的任一个或更多个的突变。野生型s蛋白序列可以是由ncbi序列号nc_045512.2的21563-25384位核苷酸编码的蛋白质序列，或者由ncbi序列号yp_009724390.1确定。在一些实施方案中，s片段中包含的编码s蛋白的序列是ncbi序列号nc_045512.2的第21563-25384位核苷酸。
75.所述struδs片段编码结构蛋白和辅助蛋白中的任一种或任几种，例如e蛋白(小包膜蛋白)、m蛋白(膜糖蛋白)、n蛋白(核衣壳蛋白)中的任一种、任两种或三种，和/或辅助蛋白中的任一种或任几种，这些蛋白独立地可以是野生型或其突变体。虽然最优选地，本发明的struδs片段编码除s蛋白之外的所有结构蛋白和辅助蛋白，但在本发明的一些实施例中，相比于该最优选的方案而言，所述struδs片段所编码的蛋白也可以进一步缺少一种或更多种结构蛋白，和/或缺少一种或更多种辅助蛋白，例如，所述struδs片段所编码的蛋白相比于该最优选的方案，可以不包含e蛋白(小包膜蛋白)、m蛋白(膜糖蛋白)、n蛋白(核衣壳蛋白)中的任一种、任两种或三种，和/或可以不包含辅助蛋白中的任一种或更多种。野生型的结构蛋白和/或辅助蛋白是指野生型sars-cov-2的结构蛋白和/或辅助蛋白。在一些实施方案中，struδs片段中包含的编码结构蛋白和辅助蛋白的核酸是ncbi序列号nc_045512.2的第25393-29674位核苷酸。
76.所述包装信号片段至少包含sars-cov-2的包装信号序列，还可以包含sars-cov-2的orf1ab序列中的其他序列。在一些实施方案中，所述包装信号序列为ncbi序列号nc_045512.2的第19900-20000位核苷酸或ncbi序列号nc_045512.2的第19773-20335位核苷酸。在一些实施方案中，所述包装信号片段可以包含orf1ab的全长或其片段，即sars-cov-2的orf1ab全长或其片段。orf1ab的全长或片段中所任一种或任几种orf可以是野生型或其突变体。在本发明的一些实施方案中，所述orf1ab的片段可以缺少orf1ab序列中的一种或更多种orf，但至少包含包装信号序列。野生型的orf1ab序列中的orf是指野生型sars-cov-2的orf1ab序列中的orf。在一些实施方案中，orf1ab是ncbi序列号nc_045512.2的第266-21555位核苷酸。
77.如本文所使用的，术语“野生型”可用于基因、蛋白质或病毒株，通常是指从天然存在的来源所分离的。野生型通常是在种群中最频繁观察到的基因、蛋白质或病毒株，因而指定为“野生型”。术语“突变体”是指当与野生型基因、蛋白质或病毒株相比，在基因的核酸序列、蛋白质的氨基酸序列或病毒株的基因组序列具有一个或更多个核苷酸或氨基酸的插入、取代或缺失。“突变体”通常仍具有野生型的基本功能特性，但其功能特性的相对水平与野生型相比可能发生改变，例如蛋白质或基因编码的蛋白质的活性有所提高或降低。应当理解，“突变体”也可能是天然存在的，例如病毒在会发生自然变异，导致产生天然存在的病毒突变体，“野生型”可以指同一基因、蛋白质或病毒株中最早出现的天然存在的那些。本发
明中，野生型sars-cov-2的基因组可由ncbi序列号nc_045512.2确定，野生型的各个结构蛋白、辅助蛋白、和/或orf1ab中的各个orf可以是由ncbi序列号nc_045512.2所示的基因组序列编码或确定的。sars-cov-2在自然界存在和传播过程中通过自然变异而产生病毒以及该病毒基因组中包含的基因及其编码的蛋白质，均可以被称为是“突变体”。本发明中的“突变体”也包括那些对天然存在的野生型sars-cov-2和自然变异的sars-cov-2进行人工改造而得到的病毒、其基因组、其任一种基因和其任一种蛋白质的突变体。
78.本发明中，s片段、struδs片段和orf1ab片段中的每一个被组装到一个质粒中，所述质粒用于表达这些片段中的基因或其编码的蛋白。在一些实施方案中，包含struδs片段的质粒被称为第一质粒，包含s片段的质粒被称为第二质粒，包含包装信号片段的质粒被称为第三质粒。对质粒的编号仅仅是为了进行区分，并非意味着这些质粒中隐含着特定的序列结构。
79.用于制备第一质粒、第二质粒和第三质粒的初始质粒载体可以是相同的或不同的，例如三者可以用相同的一种初始质粒载体，或者可以使用三种不同的初始质粒载体，或者可以是其中二者相同，但与另一者不同。用于制备第一质粒、第二质粒或第三质粒的初始质粒载体可以是本领域常见的任何适当的载体，例如本领域常见的可以在酵母和细菌之间穿梭，并可以转染包装细胞的任何适当的载体，包括但不限于peasy-t1、prs415、pjs356、pegfp-n1等。
80.第一质粒中包含的编码结构蛋白和/或辅助蛋白的序列、第二质粒中编码s蛋白的序列和/或第三质粒中的包装信号序列或orf1ab的全长或其片段可以与表达调节序列可操作地连接。所述表达调节序列是质粒中所含的片段的表达和/或翻译具有调控作用的序列，包括但不限于5’非翻译区(5’utr)、3’非翻译区(3’utr)、启动子、增强子、终止子、选择标记基因、转录后调节元件、内部核糖体进入位点(ires)、可切割序列和/或多腺苷酸化信号(polya)等。
81.可使用的启动子包括但不限于来自病毒或哺乳动物(包括人)等的启动子等。启动子可以是组成型的或诱导型的。病毒启动子的示例包括但不限于巨细胞病毒(cmv)立即早期启动子、rsv启动子、鸡β-肌动蛋白(cba)启动子、cmv早期增强子/鸡β-肌动蛋白(cag)启动子、猿猴病毒40(sv40)启动子等。哺乳动物启动子的示例包括但不限于人延伸因子1a(ef1a)启动子、人泛素c(ucb)启动子、小鼠磷酸甘油酸激酶(pgk)启动子、rna聚合酶iii型启动子(如u6和h1)等。组成型启动子的示例包括但不限于逆转录病毒劳氏肉瘤病毒(rsv)ltr启动子、巨细胞病毒(cmv)启动子、sv40启动子、二氢叶酸还原酶启动子、β-肌动蛋白启动子和磷酸甘油激酶(pgk)启动子和ef1a启动子。诱导型启动子的示例包括但不限于锌诱导的羊金属硫蛋白(mt)启动子、地塞米松(dex)诱导的小鼠乳腺肿瘤病毒(mmtv)启动子、t7聚合酶启动子系统等。
82.可使用的转录后调节元件例如可以是病毒转录后调节元件如土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件(wpre)、乙型肝炎病毒转录后调节元件(hbvpre)或rna转运元件(rte)等。
83.可使用的选择标记包括但不限于，例如药物抗性选择标记。这种选择标记基因可编码对于生长在选择培养基中的细胞的存活或生长必要的因子。未用包含选择基因的载体转化的宿主细胞将不会在培养基中存活。可以选择给予对抗生素或其他毒素的抗性、补充营养缺陷型的缺陷、或供给从培养基中扣留的关键营养元素的蛋白作为选择标记，抗生素
或其他毒素的示例包括但不限于氨苄青霉素、潮霉素、新霉素、甲氨喋呤、卡那霉素、庆大霉素、zeocin、或四环素。选择标记还可以是荧光蛋白，例如mcherry、gfp、bfp、egfp等。
84.可切割序列可以是任何在表达后能自切割或能通过其它方式被切割(例如被特定的酶切割)的序列。可切割序列可以是在表达后能够自切割的序列。这样的序列是本领域技术人员熟知的，例如具有自切割功能的核酶序列，如剪切型核酶序列。剪切型核酶可以催化自身rna在特定的位点自我剪切。剪切型核酶包括但不限于锤头核酶、发夹核酶、hdv核酶或rnasep。可切割序列还可以是能通过其它方式被切割，例如被特定的酶切割的序列。这样的序列是本领域技术人员熟知的，例如trna序列。trna序列能在trna 5’成熟酶(rzasep)作用下被切掉trna的5’端附加序列，或者可以在3’内切核酸酶rzase f的作用下被切掉trna 3’端的序列。因此，所述可切割序列可以是可被rzasep切割5’端附加序列的trna序列，或者可以是可被rzase f切割3’端序列的trna序列。任何在成熟时能够被切割的trna都可以用于本发明。
85.多腺苷酸化信号序列可以位于转录终止区，例如3’非翻译区中，其示例包括但不限于牛生长激素(bgh)poly(a)、sv40 polya、胸苷激酶(tk)poly(a)序列等。
[0086]5’
非翻译区(5’utr)、3’非翻译区(3’utr)可以使用任何适合的病毒5’utr和3’utr，例如sars-cov-2的5’utr和3’utr。
[0087]
在一些实施方案中，第一质粒中编码结构蛋白和/或辅助蛋白的核酸与5’端的启动子、5’utr，以及3’端的3’utr、polya和任选的可切割序列可操作地连接。在一些实施方案中，第二质粒中编码s蛋白的核酸与5’端的启动子和3’端的polya可操作地连接。在一些实施方案中，第三质粒中来自sars-cov-2的orf1ab的序列与5’端的启动子、5’utr，以及3’端的3’utr、polya和任选的可切割序列可操作地连接。
[0088]
在本发明中，struδs片段、s片段或orf1ab片段可以通过转化介导的重组(transformation-associated recombination,tar)克隆方法被组装到第一质粒、第二质粒或第三质粒中。tar克隆的是利用酵母体内重组系统对大片段的目的dna进行拼接合成，具体方法是：将具有同源末端的目的dna的多个片段和线性化的tar载体共同转染到酵母中，利用酵母细胞中高效的重组系统，使载体与目的dna片段的同源序列以及不同目的dna片段的同源序列间进行同源重组，即可产生带有目的dna的载体。本发明中可以以s片段、struδs片段或orf1ab片段为目的dna进行tar克隆。所述tar载体可以是质粒载体。具体而言，目的dna被拆分为多个dna片段，相邻dna片段之间具有同源序列(也可以叫同源臂、重叠序列或重叠片段)，位于目的dna两端的dna片段分别与线性化的载体两端具有同源序列，将这些dna片段和线性化的载体共同转入酵母中，使得它们在酵母体内发生同源重组，以组装成含有目的dna的载体。所述“相邻”是指两个dna片段在目的dna上的位置是相邻的。拆分的每个dna片段的长度通常为2-5kb，例如拆分的每个dna片段的长度范围的下限和上限可以可以分别是约2kb、约2.1kb、约2.2kb、约2.3kb、约2.4kb、约2.5kb、约2.6kb、约2.7kb、约2.8kb、约2.9kb、约3kb、约3.1kb、约3.2kb、约3.3kb、约3.4kb、约3.5kb、约3.6kb、约3.7kb、约3.8kb、约3.9kb、约4kb、约4.1kb、约4.2kb、约4.3kb、约4.4kb、约4.5kb，约4.6kb、约4.7kb、约4.8kb、约4.9kb、约5kb，优选为3-4kb，更优选为约3kb。同源序列的长度通常为50-300bp，优选为100-250bp，更优选为150-200bp。
[0089]
在一些实施方案中，struδs片段可以被拆分为3个dna片段。在一些实施方案中，s
片段可以被拆分为2个dna片段。在一些实施方案中，orf1ab片段可以被拆分为2个dna片段。
[0090]
拆分后的dna片段可以通过本领域已知的方法合成，如体外合成，所合成的dna片段可以是单链或双链片段。
[0091]
应当理解，本发明所述的struδs片段、s片段或orf1ab片段可以仅含有所要表达的sars-cov-2的基因，不含有其他序列(例如编码序列或表达调控序列)，也可以包含所要表达的sars-cov-2的基因和前述的一种、两种或更多种表达调控序列。表达调控序列可以通过任何方式被添加到载体中，例如，表达调控序列可以被包含在struδs片段、s片段和/或orf1ab片段中，与这些片段中所表达的sars-cov-2的基因一同被拆分为包含同源臂的多个dna片段，并通过酵母同源重组(tar)被组装到质粒中。前述的表达调控序列也可以被事先添加到质粒载体中，与struδs片段、s片段或orf1ab片段拆分的带有同源臂的dna片段在酵母中进行同源重组，此时struδs片段、s片段或orf1ab片段仅含有所要表达的sars-cov-2的基因，而不包含表达调控序列。在另一些实施方案中，一些调控序列被包含在struδs片段、s片段和/或orf1ab片段中，与这些片段中所表达的sars-cov-2的基因一同被拆分为包含同源臂的多个dna片段，并通过酵母同源重组(tar)被组装到质粒中，另一些表达调控序列则被事先添加到质粒载体中。
[0092]
dna片段和线性化的载体在酵母体内同源重组的方法是本领域技术人员熟知的，例如，一个具体的实例是：首先制备酵母感受态，从平板上挑取酵母菌株并接种到5ml酵母浸出粉胨葡萄糖培养基(ypd)，培养过夜；从扩摇的菌液中取出适量再次接种到5ml ypd，在30℃，200rpm条件下培养至od
600
＝0.4～0.6。清洗菌体，取待连接的dna片段150ng、线性化的载体100ng，混合均匀，并加入感受态酵母细胞；随后，从同源臂的两端约100bp设计引物扩增，挑取酵母单克隆过夜培养，按照pcr程序处理进行junction pcr；验证正确后，从平板上挑取菌体，接种于5ml液体sc-leu培养基，培养过夜，收集菌体；最后，重悬菌体并提取酵母总dna备用。
[0093]
在酵母中组装好的含有目的dna的载体，可以通过常规的质粒提取方法从酵母中提取出来，获得第一质粒、第二质粒或第三质粒，然后可选择地转入大肠杆菌扩增；或可以直接提取酵母总dna，用酵母总dna转化大肠杆菌并扩增，获得第一质粒、第二质粒或第三质粒。本领域熟知从酵母中获得并扩增重组质粒的方法，例如可以将酵母总dna转入大肠杆菌，挑选单克隆，验证正确后，大量扩增并提取质粒，保存质粒以备用。作为一个具体实例，首先挑取epi300单克隆并接种于5ml lb液体培养基，过夜培养，采用电转的方式转染酵母总dna，将转移菌液涂在抗性平板上挑取单克隆，按照pcr程序处理进行junction pcr；随后选择验证正确的菌提取质粒，并进行酶切验证，酶切验证正确后进行测序验证；验证正确后，大量扩增大肠杆菌，并提取质粒，保存质粒以备用。本发明中，使用选自第一质粒、第二质粒和第三质粒中的任意两种或三种转染包装细胞，使他们在包装细胞中表达并组装，即可获得sars-cov-2的病毒样颗粒。在一些实施方案中，可以用于转染包装细胞的质粒包括第一质粒和选自第二质粒和第三质粒中的任一种或两种。
[0094]
在进行转染之前，可以先对质粒的表达进行验证，例如可以将任一种质粒单独转染哺乳动物细胞(如293t细胞)，裂解细胞后提取胞内rna及蛋白并分别进行检测，例如可以通过rt-pcr和western blot进行检测，还可以通过选择性标记，例如荧光蛋白成像的方法实现对质粒表达的验证。
[0095]
本发明中，术语“病毒样颗粒(vlp)”、“假病毒”、“重组病毒”和“重组病毒颗粒(rvp)”可以互换使用，是指通过包含至少一种重组dna技术步骤的方法获得的病毒颗粒，其中病毒基因组中包含的至少一种组分通过基因工程方法进行表达和组装。本发明的“病毒样颗粒”可以不含病毒基因组，或者含有不编码病毒蛋白的基因，因此是非复制性和非感染性的，所述“重组病毒颗粒”在本发明中指使用第一质粒、第二质粒和第三质粒中的任意两种或三种转染包装细胞获得的病毒颗粒，所述病毒颗粒中可以包含或不包含核酸物质。当用于转染包装细胞的质粒中包括具有包装信号的质粒时，所获得的病毒颗粒中包含核酸物质，当用于转染包装细胞的质粒中不包括具有包装信号的质粒时，所获得的病毒颗粒中不包含核酸物质。例如，本发明中，rsar2-cov-2与sar2-cov-2vlp可以互换使用。
[0096]
本发明所述的“转染”是指使多核苷酸，如核酸分子、质粒等，从细胞外转移到细胞内，使得该多核苷酸在所述细胞内具有功能。转染方法是本领域技术人员熟知的，例如磷酸钙或脂质体介导的转染。如本领域技术人员所知，可使用的脂质体包括lipofectamine 8000等。在一些实施方案中，转染方法包括使293t长至密度约为80％，用质粒与lipofectamine 8000混合后转染293t细胞，培养基为添加了10％fbs的dmem；6h后，更换培养基为dmem，48h后收集上清溶液。
[0097]
用于生产重组病毒颗粒的包装细胞是本领域技术人员熟知的，例如，可使用的包装细胞包括，但不限于，哺乳动物(包括人)细胞、昆虫细胞、植物细胞、微生物或酵母，例如hek293系列的细胞(如hek293a、hek293t或hek293ft)、a549细胞或vero细胞等。
[0098]
用于生产重组病毒颗粒的培养基和培养方法是本领域技术人员已知的，可以采用商购的或定制的培养基，或者进一步添加补充本领域已知的一个或多个细胞培养组分，包括但不限于葡萄糖、维生素、氨基酸和或生长因子，以增加生产培养物中重组病毒颗粒的滴度。重组病毒载体生产培养物可以在适合于所使用的特定宿主细胞(即包装细胞)的条件下生长。在产生重组病毒载体之后，如果需要，可使用多种常规方法从细胞裂解物或病毒上清液中纯化病毒颗粒，包括超滤法，例如使用硝酸纤维素滤膜；吸附法，例如使用磷酸钙或离子交换熟知吸附病毒或杂质，随后用盐溶液洗脱；层析法，例如葡聚糖凝胶层析、离子交换层析、亲和层析等；离心法，例如差速离心、cscl或蔗糖密度梯度离心；沉淀法，例如聚乙二醇沉淀(如使用peg2000)，等电点沉淀或中性盐沉淀等。上述纯化方法也可以组合使用。在一些实施方案中，作为纯化方法的一个示例，配制浓度为10％(w/v)的peg20000溶液，以体积比1:1混合peg20000与培养的病毒上清溶液，4℃放置16h进行浓缩，离心收集沉淀物，然后用opti-mem重悬以备用，该方法可用于vlp的侵染等实验；作为纯化方法的另一个示例，将收集的病毒培养上清过20％(w/v)的蔗糖溶液，以30000rpm超速离心4h对vlp进行初步纯化，此vlp纯化方法可用于rna、蛋白及vlp形貌等的表征。
[0099]
本发明的重组病毒颗粒可以作为活性成分用在药物组合物或疫苗中，以治疗由sars-cov-2引起的疾病。术语“疫苗”指包含所述重组病毒颗粒的制剂。疫苗中所包含的重组病毒颗粒的剂量可由本领域技术人员例如根据疾病状况、受试者和治疗时间表进行调整。疫苗中通常包含治疗有效量的重组病毒颗粒。本发明所述的“治疗”是指预防或缓解(例如，降低、减轻或治愈)至少一种与疾病状态相关的症状。本发明所述的“治疗有效量”即足以预防或缓解(例如，降低、减轻或治愈)至少一种与疾病状态相关的症状的量。所述药物组合物或疫苗的剂量可方便地由本领域技术人员来确定，例如通过首先鉴定有效引发预防性
或治疗性免疫应答的剂量，例如通过测量病毒特异性免疫球蛋白的血清效价或通过测量血清样品或尿样或粘膜分泌物中抗体的抑制比。
[0100]
本发明的药物组合物或疫苗可以包含本发明的重组病毒颗粒和药学上可接受的载体或赋形剂。药学上可接受的载体包括但不限于盐水、缓冲盐水、右旋糖、水、甘油、无菌等张水性缓冲液及其组合。本发明的药物组合物或疫苗可以包含佐剂，佐剂对于本领域技术人员而言是公知的。示例性的佐剂包括完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂、氢氧化铝佐剂、bcg等。
[0101]
本发明的药物组合物或疫苗应当适合于施用给受试者，例如是是无菌的、非颗粒的和/或非致热原性的。所述药物组合物或疫苗可被配制为固体形式，如可用于配制注射液的冻干粉、液体溶液、悬液、乳液、片剂、丸剂、胶囊剂、持续释放配制物或散剂等。
[0102]
本发明的药物组合物或疫苗的施用方法包括但不限于肠胃外给药(例如皮内、肌肉内、静脉内和皮下)、硬膜外和粘膜(例如鼻内和经口或肺部途径或通过栓剂)。给药可为系统性的或局部的。
[0103]
本发明的重组病毒颗粒还可以用在sars-cov-2病毒感染细胞的体外研究中，例如可用于体外药物筛选，如在体外筛选能够抑制sars-cov-2病毒感染细胞的药物；开发抗体，例如可以该重组病毒颗粒作为免疫原制备抗体或检测抗体中和活性；还可用于开发病毒疫苗，例如可以针对新出现的病毒突变体，特别是新出现的具有突变s蛋白的病毒突变体，方便快捷地开发疫苗。
[0104]
在一些实施方案中，基因组的拆分、合成及组装原理如图1所示。首先，将基因组orf1ab拆分成6个大小为3-5kb的片段、s蛋白基因拆分成2个片段、其他结构蛋白或辅助蛋白基因拆分为3个片段；然后，体外合成每个片段并通过酵母同源重组技术组装成orf1ab、s及struδs三个片段；再将三个片段构建在相应载体上，转入大肠杆菌，获得质粒；最后将质粒转染哺乳动物细胞，获得vlp。各种vlp的表征如图3-4所示。
[0105]
在一些实施方案中，本发明提供了一种sars-cov-2vlp从头人工合成及制备方法，具体包括：
[0106]
第一步：sars-cov-2基因组拆分，合成及组装
[0107]
(1)将sars-cov-2基因组拆分成orf1ab、struδs和s三个部分，其中orf1ab序列从266到21555，包含所有非结构蛋白的序列；struδs序列从25393到29674，包含除s蛋白外所有的结构蛋白与辅助蛋白的序列；s序列从21563到25384，包含s蛋白的序列(具体序列见附件)；
[0108]
(2)将orf1ab拆分成6个约3kb的片段，将struδs拆分成3个约3kb的片段，将s拆分成2个3kb的片段，每个片段均采用体外合成的方法，并在相邻片段上设计overlap片段。
[0109]
(3)将上一步骤拆分的片段利用酵母体内平台进行酵母同源重组，利用相邻片段间的overlap通过同源重组的方法组装成为orf1ab、struδs及s三个完整的片段，同时分别组装到质粒载体pjs356和peasy-t-cag上得到三个质粒sars-cov-2orf1ab、sars-cov-2struδs和sars-cov-2s。其中在orf1ab、struδs编码序列两端分别加上5’utr及3’utr与polya尾巴，同时每条序列的5’加上cmv的增强子；在s蛋白编码序列的3’端加上polya尾巴；并在5’加上cag的增强子；
[0110]
酵母同源重组的具体操作步骤如下：首先制备酵母感受态，从平板上挑取酵母菌
株并接种到5ml酵母浸出粉胨葡萄糖培养基(ypd)，培养过夜；从扩摇的菌液中取出适量再次接种到5ml ypd，在30℃，200rpm条件下培养至od
600
＝0.4～0.6。清洗菌体，取待连接的dna片段(约3kb)150ng、线性化的载体100ng，混合均匀，并加入感受态酵母细胞；随后，从同源臂的两端约100bp设计引物扩增，挑取酵母单克隆过夜培养，按照pcr程序处理进行junction pcr；验证正确后，从平板上挑取菌体，接种于5ml液体sc-leu培养基，培养过夜，收集菌体；最后，重悬菌体并提取酵母总dna备用；
[0111]
(4)将酵母总dna转入大肠杆菌，挑选单克隆，验证正确后，大量扩增并提取质粒，保存质粒以备用；
[0112]
具体操作步骤如下：首先挑取epi300单克隆并接种于5ml lb液体培养基，过夜培养，采用电转的方式转染酵母总dna，将转移菌液涂在抗性平板上挑取单克隆，按照pcr程序处理进行junction pcr；随后选择验证正确的菌提取质粒，并进行酶切验证，酶切验证正确后进行测序验证；验证正确后，大量扩增大肠杆菌，并提取质粒，保存质粒以备用。
[0113]
第二步：sars-cov-2vlp表达及制备方法
[0114]
(1)对sars-cov-2基因组拆分成而构建的三个质粒分别进行验证。首先分别将三个质粒单独转染293t细胞，然后裂解细胞，分别提取细胞内的rna及蛋白，并分别进行rt-pcr及western blot等的验证；同时通过sars-cov-2struδs中的egfp和sars-cov-2orf1ab中的mcherry的荧光成像的方法实现对质粒表达的验证。
[0115]
(2)293t长至密度约为80％，分别转染sars-cov-2struδs，sars-cov-2struδs与sars-cov-2s，sars-cov-2struδs与sars-cov-2orf1ab，及sars-cov-2struδs、sars-cov-2s及sars-cov-2orf1ab，培养基为opti-mem；6h后，更换培养基为dmem，48h后收集上清溶液。
[0116]
(3)配置浓度为10％(w/v)的peg20000溶液，以体积比1:1混合peg20000与病毒上清溶液，4度放置16h进行浓缩，离心收集沉淀物，然后用opti-mem重悬以备用，以上方法可用于vlp的侵染等实验。将收集的上清过20％(w/v)的蔗糖溶液，以30000rpm超速离心4h对vlp进行初步纯化，此vlp纯化方法主要用于rna、蛋白及vlp形貌等的表征。
[0117]
在一些实施方案中，质粒共转制备vlp及其验证，包括下述任一种步骤：
[0118]
(1)将struδs的质粒单转入293t细胞制备struδs的vlp
[0119]
将293t铺在100mm的细胞培养皿，至细胞密度约为90％时，用转染试剂lipo8000在每个培养皿中转染15μg sars-cov-2struδs，6h后更换培养基。48h后收集上清容液，即为vlp。将培养皿中细胞裂解进行rt-pcr与western blot以验证质粒在293t细胞中的表达；采用荧光成像的方法验证质粒的表达，采用western blot分析vlp中的n蛋白，采用透射电镜表征的方法验证vlp的大小与形貌；
[0120]
(2)将struδs与s的质粒共转入293t细胞制备struδs+s的vlp
[0121]
将293t铺在100mm的细胞培养皿，至细胞密度约为90％时，用转染试剂lipo8000在每个培养皿中转染15μg sars-cov-2struδs与15μg sars-cov-2s，6h后更换培养基；72h后收集上清容液，即为struδs+s的vlp。采用荧光成像的方法验证质粒的表达，采用western blot分析胞内表达及vlp中的s蛋白和n蛋白；采用透射电镜表征的方法验证vlp的大小与形貌；
[0122]
(3)将struδs与orf1ab的质粒共转入293t细胞制备struδs+orf1ab的vlp
[0123]
将293t铺在100mm的细胞培养皿，至细胞密度约为90％时，用转染试剂lipo8000在每个培养皿中转染15μg sars-cov-2struδs与15μg sars-cov-2orf1ab，6h后更换培养基。48h后收集上清容液，即为struδs+orf1ab的vlp。采用荧光成像的方法验证质粒的表达，采用western blot分析胞内表达及vlp中的n蛋白，采用透射电镜表征的方法验证vlp的大小与形貌；
[0124]
(4)将struδs，s与orf1ab的质粒共转入293t细胞制备struδs+s+orf1ab的vlp
[0125]
将293t铺在100mm的细胞培养皿，至细胞密度约为90％时，用转染试剂lipo8000在每个培养皿中转染15μg sars-cov-2struδs，15μg sars-cov-2s与15μgsars-cov-2orf1ab，6h后更换培养基；48h后收集上清溶液，即为struδs+s+orf1ab的vlp；采用荧光成像的方法验证质粒的表达，采用western blot分析胞内表达及vlp中的s蛋白和n蛋白，采用透射电镜表征的方法验证vlp的大小与形貌；
[0126]
(5)将struδs，orf1ab与s
突变
的质粒共转入293t细胞制备struδs+s
突变
+orf1ab的vlp
[0127]
首先，通过pcr的方法对s蛋白质粒(即sars-cov-2s)进行单位点的突变，本案例以n331q、n501y、d614g及p681h为例；将每个s突变质粒转染293t细胞，裂解细胞，采用rt-pcr的方法验证s突变质粒的表达。然后，制备s突变vlp，对于每种s蛋白突变，将293t细胞铺在100mm的细胞培养皿，至细胞密度约为90％时，用转染试剂lipo8000在每个培养皿中转染15μg sars-cov-2struδs，15μg sars-cov-2s
突变
与15μg sars-cov-2orf1ab的质粒，6h后更换培养基；48h后收集上清溶液，即为struδs+s
突变
+orf1ab的vlp；采用荧光成像的方法验证质粒的表达，采用western blot分析胞内表达及vlp中的s蛋白和n蛋白，采用透射电镜表征的方法验证vlp的大小与形貌。
[0128]
下面通过实施例，并结合附图，对本发明的技术方案作进一步详细的说明，但本发明不限于下面的实施例。除非另有说明，本发明中以及下述实施例中所述的sars-cov-2基因组及其部分的核苷酸编号均以ncbi序列号nc_045512.2为准，s蛋白及其突变体的氨基酸位置编号均以s蛋白的氨基酸序列为准，即以s蛋白的第1位氨基酸为编号1。
[0129]
实施例1：材料和方法
[0130]
质粒：基于酵母中的tar系统构建sars-cov-2s、orf1ab-mcherry和struδs-egfp三个质粒，以制备sars-cov-2的病毒颗粒。。在密码子优化过的编码sars-cov-2s糖蛋白的cdna序列的5’端添加cag启动子，在其3’端添加bgh poly(a)signal，将该带有启动子和poly(a)signal的序列拆分为两个带有重叠序列的片段(seq id no:1,seq id no:2)，通过酵母中的同源重组将带有启动子和poly(a)signal的sars-cov-2s糖蛋白的cdna序列组装并克隆到peasy-t1载体上，形成质粒peasy-t-s(在以下实施例中也被称为sars-cov-2s质粒或s质粒)。在sars-cov-2的orf1ab的5’端添加cmv启动子、5’utr，并在3’端添加3’utr、hdv、sv40 polya和mcherry编码基因，并将由此获得的序列拆分为六个带有重叠序列的片段(seq id no:3-8)，在酵母中将这些重叠片段组装并克隆到pjs356载体(pjs356载体是在pr415质粒的基础上加入用于诱导低拷贝质粒的高表达的ori2-oriv元件和用于在大肠杆菌中高效表达的sopa、sopb、repe及sopc功能元件获得的)中，形成质粒pjs356-orf1ab-mcherry(在以下实施例中又可称sars-cov-2orf1ab质粒、sars-cov-2orf1ab-mcherry质粒、orf1ab-mcherry质粒或orf1ab质粒)。在编码全部结构蛋白(刺突蛋白除外)和全部辅助
蛋白(辅助蛋白包括orf3a，orf3b，orf6，orf7a，orf7b，orf8，orf10)的dna序列的3’端添加cmv启动子、t7启动子、5’utr，并在3’端添加3’utr、hdv、sv40 polya和egfp编码基因，并将由此获得的序列拆分为三个带有重叠序列的片段(seq id no:9-11)，在酵母中将这些重叠片段组装，克隆到pjs356载体中，形成质粒pjs356-struδs-egfp(在以下实施例中又可称sars-cov-2struδs质粒、sars-cov-2struδs-egfp质粒、struδs-egfp质粒或struδs质粒)。通过酶切和测序验证获得的质粒。
[0131]
将通过生信分析得到的sars-cov-2基因组rna(nt 19900-20000或19773-20335)的包装信号(packaging signal，简称ps)的dna序列插入pegfp-n1载体中egfp基因的3'非编码区，构建质粒pegfp-n1-ps101或pegfp-n1-ps583。从质粒pjs356-orf1ab-mcherry扩增得到ps101(nt 19900-20000)或ps583(nt 19773-20335)。用not i限制性核酸内切酶处理质粒pegfp-n1，插入含ps的片段以产生pegfp-n1-ps101或pegfp-n1-ps583。
[0132]
定点突变：利用sars-cov-2s质粒作为模板构建s蛋白基因突变体，包括sars-cov-2s(n331q)，sars-cov-2s(n501y)，sars-cov-2s(d614g)和sars-cov-2s(p681h)共四种质粒。选择目标突变位点附近15-20碱基作为正向引物，反向引物选择互补序列作为反向引物，其列于表1。定点突变pcr后，用限制性内切酶dpni消化模板链。产物直接转化至大肠杆菌dh5α感受态细胞，选择单克隆并测序。
[0133]
orf1b rna二级结构的预测：使用biopython从参考基因组中选取sars-cov-2，sars-cov和类蝙蝠sars-cov的orf1b区域中的序列(nt 19500-20400)。二级结构由具有默认参数的rna结构web服务器预测，并由vienna rna web服务器进行可视化分析。
[0134]
相似结构的多序列比对和预测：我们预测并比较了orf1b 3'末端的保守rna茎环，这是sars相关病毒中预测的包装信号。使用locarna web服务器对sars-cov-2(nc-045512.2:19773-20355)，sars-cov(nc-004718.3:19712-20294)和类蝙蝠sars-cov(mg772933.1:19773-20355)进行比对。
[0135]
细胞构建和培养：本研究构建了稳定表达人ace2的293t细胞(293t/hace2)。用hace2质粒转染293t细胞产生受体hace2，并在2μg/ml嘌呤霉素下进行筛选。通过蛋白质印记来检测hace2细胞的表达。293t细胞在添加10％fbs、1％青霉素和链霉素的dmem培养基中培养，并将其培养在37℃，5％co2培养箱中。293t/hace2细胞在添加10％fbs、1％青霉素和链霉素以及2μg/ml嘌呤霉素的dmem培养基中培养，并将其培养在37℃，5％co2培养箱中。
[0136]
vlps的构建：为了获得vlps，使用lipofectamine 8000与sars-cov-2s(10μg),orf1ab-mcherry(10μg)和struδs-egfp(10μg)质粒混合后转染到293t细胞中，并在含有10％fbs的dmem培养基中培养48小时。为了形成组装有包装信号的vlp(egfp-ps101)或者vlp(egfp-ps583)，将pegfp-n1-ps101(1μg)或pegfp-n1-ps583(1μg)与sars-cov-2s(10μg)和struδs(10μg)质粒一起共转染到293t细胞48小时。
[0137]
vlp纯化：转染后48小时后收集培养基上清并用0.45μm滤膜进行过滤。将培养基上清加到20％蔗糖垫上，并使用sw32转子以30000rpm超速离心3小时。纯化后的vlp用于拍摄透射电子显微镜。对于蛋白质免疫印迹分析，将培养基上清加到20％至40％密度梯度蔗糖的顶部，并使用sw41转子以30000rpm超速离心4小时。采用peg20000浓缩的方法收集vlp用于荧光成像。
[0138]
rna提取和rt-pcr：通过fastpure细胞/组织总rna分离试剂盒v2细胞培养基上清
的总rna，并根据试剂盒说明书在48小时转录成cdna。使用cdna作为模板，设计表1中列出的特异性引物用以扩增sars-cov-2s，n，nsp1，nsp16或orf3a的编码区，通过在1％琼脂糖凝胶电泳验证pcr产物。
[0139]
蛋白质免疫印迹分析：用含有蛋白酶抑制剂和pmsf的ripa缓冲液在冰上裂解细胞或vlp五分钟，并以13000g离心5分钟除去大的细胞碎片。蛋白质裂解物在100度下煮沸10分钟，在4-20％丙烯酰胺凝胶上分离，并转移到硝酸纤维素膜上。用含1％tween-20和5％牛奶的tbst缓冲封闭硝酸纤维素膜，4度过夜，然后与irdye 680rd山羊抗小鼠抗体或irdye 800cw山羊抗兔抗体一起温育。通过chemidoc mp成像系统来获得分析结果。
[0140]
透射电子显微镜：将vlp粘附到碳涂覆的铜网上10分钟，并用2％(w/v)磷钨酸(ph 7.1)染色1分钟，用200kv透射电子显微镜观察样品。
[0141]
量子点纳米信标的制备：将碲粉(20mg)和硼氢化钠(11mg)加入含1ml超纯水的圆底烧瓶中，将混合物在无氧和冰浴条件下搅拌5小时以获得碲氢化钠。为了制备镉前体，将氯化镉，氯化锌和n-乙酰基-l-半胱氨酸按照1:1:4的混合并通过naoh将ph调节至9.0。将bhq2和硫代磷酸酯共修饰的dna，镉前体和碲氢化钠混合并转移到四聚氟乙烯内衬的不锈钢高压反应釜中。将混合物加热至200度36分钟以获得bhq2-dna功能化的cdte:zn
2+
qds，通过用amicon ultra-4离心过滤装置(50kda)以8000rpm离心10分钟来纯化量子点。对bhq2-dna功能化的cdte:zn
2+
qds进行95度退火处理保持10分钟并在室温下保持30分钟以形成茎环结构。
[0142]
vlp的荧光标记：为了构建带荧光标记vlp，在转染sars-cov-2质粒后6小时加入40μl退火的量子点纳米信标(10μm)到培养基中以标记病毒基因组，并且在病毒自组装期过程中将纳米信标标记在vlp中。在2ml收集的病毒液中加入0.5μl dio(1mm)，在37℃下孵育1小时以标记病毒囊膜。
[0143]
病毒感染和荧光成像：将293t/hace2细胞接种于共聚焦培养皿中，在含10％fbs、1％青霉素和链霉素和2μg/ml嘌呤霉素的dmem中培养。荧光标记的vlp与宿主细胞293t/hace2在4℃孵育保持30分钟，并用新鲜培养基替换培养基以除去未结合的颗粒。共聚焦培养皿用封口膜密封，然后转移到37度5％co2培养箱中。通过ultraview vox共聚焦激光扫描系统在488nm和561nm激发下进行成像。
[0144]
实施例2结果和讨论
[0145]
结果
[0146]
sars-cov-2vlp的构建和表征
[0147]
为组装具侵染能力的sars-cov-2vlp，我们将sars-cov-2基因组的cdna全长分为三部分：sars-cov-2orf1ab(核苷酸位置：266-21555)、sars-cov-2s(核苷酸位置：21563-25384)和sars-cov-2struδs(核苷酸位置：25393-29674)，且都包含组成型启动子，具体如图1a所示。使用化学合成的病毒基因组dna片段，分别在酵母中进行组装构建成分别含有sars-cov-2orf1ab、sars-cov-2s和sars-cov-2struδs的质粒；构建好的质粒共转染到293t细胞中以产生sars-cov-2vlp(图1b)。在293t细胞中，dna片段被翻译并表达病毒蛋白；包含包装信号(ps)序列的sars-cov-2orf1ab rna与结构蛋白组装形成sars-cov-2vlp；sars-cov-2vlp的感染性是由刺突蛋白与宿主细胞表面hace2受体的结合所介导。在病毒粒子中仅组装包包装序列基因，不组装所有结构蛋白基因的情况下，已受sars-cov-2vlp感染
的细胞不会产生子代病毒(图1c)。因此，我们的sars-cov-2vlp构建策略有望为病毒学研究提供一个安全且通用的平台。
[0148]
sars-cov-2刺突糖蛋白(s)作为受体结合位点，可以介导膜融合和病毒进入。我们组装并优化了s蛋白编码序列，并在哺乳动物细胞中表达s蛋白。将sars-cov-2s质粒转染293t细胞，通过rt-pcr分析s基因的结果如图6a所示。表达的sars-cov-2s蛋白通过蛋白免疫印迹验证，结果显示有两个主要条带，180kda的全长蛋白和110kda的裂解蛋白(图6b)。
[0149]
sars-cov-2struδs基因序列与egfp融合构建成质粒，命名为sars-cov-2struδs-egfp(图7a)；同时，我们构建了结构蛋白(e，包膜；m，膜；n，核衣壳)和辅助蛋白的表达载体。为了验证sars-cov-2struδs-egfp质粒的活性，在293t细胞中通过rt-pcr分析了orf3a和n基因(图7b)；在质粒转染24小时后观察到egfp表达(图7c)，并通过蛋白免疫印迹确定sars-cov-2n蛋白的表达(图7d)。结构蛋白可以组装成病毒样颗粒vlp(struδs)；我们在转染后48小时收集培养基，转移至超离管中(底部含20％蔗糖垫)以分离vlp。通过蛋白免疫印迹法验证vlp(struδs)中确实含有sars-cov-2n蛋白(图7d)；vlp(struδs)的形态大小则通过tem进行观察，我们发现不含刺突蛋白的球形颗粒的估计直径为75
±
14nm(n＝30，图7e)。
[0150]
我们将sars-cov-2orf1ab基因序列与mcherry序列融合构建成质粒，质粒表达的多聚蛋白1a(pp1a)和pp1ab可以被病毒蛋白酶自切割成16个非结构蛋白(nsp)(图8a)。通过rt-pcr评估sars-cov-2orf1ab-mcherry质粒的活性，同时使用共聚焦显微镜可在转染后48小时内观察到mcherry信号(图8b和8c)。
[0151]
vlp(struδs-s)的组装和分泌依赖于sars-cov-2s质粒和struδs-egfp质粒的共表达；转染后24h，共聚焦显微镜检测到egfp的荧光，蛋白免疫印迹检测到sars-cov-2s和n蛋白，这表明sars-cov-2s和struδs-egfp rna可以在转染的细胞中表达(图9a和9b)。为表征其形貌和尺寸，对vlp(struδs-s)负染色后在tem下进行透射电镜观察(图9c)；观察结果表明vlp(struδs-s)是带有刺突蛋白的球形颗粒，平均大小估计为74
±
16nm(n＝30，不包含刺突)。同时我们也对组装vlp(struδs-s)的结构蛋白进行蛋白免疫印迹分析，也能得到预期分子量的条带(图9b)。
[0152]
vlp(struδs-orf1ab)是由sars-cov-2struδs-egfp质粒和orf1ab-mcherry质粒共转染293t细胞而产生的；在转染后24小时对细胞进行成像，可以观察到明显的荧光(图10a)；同时，通过蛋白免疫印迹检测到sars-cov-2n蛋白在转染细胞中的表达(图10b)。接着，进行透射电镜观察以分析vlp(struδs-orf1ab)的形态特征。不含刺突蛋白的球形颗粒的直径约为79
±
13nm(n＝30，图10c)。vlp(struδs-orf1ab)的sars-cov-2n蛋白通过蛋白免疫印迹法测定(图10b)。
[0153]
要制备sars-cov-2vlp，需要三质粒共转染到239t细胞中。转染后24小时内，能观察到egfp和mcherry信号，表明在细胞中质粒进行了复制和转录(图2a)。为了检测sars-cov-2s和n蛋白的表达，在转染后48小时，收集细胞裂解产液进行蛋白免疫印迹分析。同时，为了分析病毒颗粒的形态表征，进行了透射电镜观察；透射电镜图像显示圆形病毒颗粒且具有典型尖峰冠状，且颗粒的直径约为76
±
12nm(n＝30，不包含刺突)。sars-cov-2vlp和其他vlps似乎具有相似的形状和尺寸(图2c)。病毒粒子中的sars-cov-2s和n蛋白，通过蛋白免疫印迹进行分析可得到预期的条带(图2b)。
[0154]
为了避免潜在的生物安全问题，将拯救的病毒样颗粒在bsl-3实验室进行了安全测试。我们构建的293t/hace2细胞株对sars-cov-2感染具有易感性；细胞表达的hace2受体，可以通过蛋白免疫印迹进行验证(图11a)。用sars-cov-2vlp去感染293t/hace2细胞，以测试受感染的细胞是否产生了子代病毒。病毒结构蛋白是否在细胞中进行了表达并组装成子代病毒，用蛋白免疫印迹进行检测，结果显示没能观察到对应的条带。结果表明，sars-cov-2vlp不能进行复制、表达结构蛋白，进而不能在宿主细胞中组装产生子代病毒。由于sars-cov-2vlp无法复制，感染sars-cov-2vlp和野生型sars-cov-2病毒的293t/hace2细胞的代表性图像显示病毒存在显着的滴度差异(图11c)。因此，我们构建的sars-cov-2vlp，可以作为一种安全、适宜的模型来研究sars-cov-2病毒的生命周期和感染机制，有望进一步理解病毒的生命周期，为抗病毒药物及疫苗的开发提供一定理论基础。
[0155]
为了进一步探究病毒基因组rna的组装，我们利用sars-cov-2vlp感染293t/hace2细胞(图2e)。在病毒颗粒感染48小时后，通过共聚焦显微镜成像可以观察到mcherry信号，但可能由于orf1ab-mcherry mrna的低拷贝数，受感染细胞中的红色荧光非常微弱(图2d)。vlp(mcherry)由sars-cov-2s质粒、struδs-egfp质粒和mcherry质粒(直接将mcherry插入pegfp-n1载体获得)三质粒共转染组装而成。在vlp(mcherry)感染的细胞中未观察到荧光信号，表明没有包装信号(ps)序列的mcherry mrna无法包装成颗粒。这说明位于orf1ab片段中的sars-cov-2包装信号，对于病毒rna组装形成颗粒具有重要作用。
[0156]
sars-cov-2中包装信号的预测和验证
[0157]
根据之前的报道，冠状病毒的核衣壳通过识别特定的包装信号(ps)序列与病毒rna相互作用，以促进基因组rna组装成病毒颗粒。用生物信息学分析进行预测sars-cov-2的ps位置，预测结果表明ps在靠近orf1b区域的3'末端。同时，我们预测了sars-cov-2、sars-cov和类蝙蝠sars-cov的rna二级结构；预测结果表明，三种类型的病毒的rna二级结构中有都含有两个稳定的茎环(sl1和sl2)(图3a)。ps共有结构的多重比对进一步证实了rna茎环具有高度保守性，尤其是sl1和sl2(图12)。这些结果表明，稳定的茎环结构可能在sars-cov-2中具备ps功能。为了进一步探究，根据包装序列的生信预测结果，我们选择了两个区域来测试包装活性，一个是包含保守茎环结构的短区域(ps101,nt 19900-20000)，另外一个是带有额外侧翼序列的较长区域(ps583,nt 19773-20335)。
[0158]
将预测的ps序列与egfp报告基因的3'非编码区融合表达，构建了质粒pegfp-n1-ps101和质粒pegfp-n1-ps583并分别转染到293t细胞中；egfp-ps101和egfp-ps583 rna的表达通过rt-pcr来确定(图s8a和3b)。为了证实预测的ps rna的组装，收集vlp(egfp-ps101)和vlp(egfp-ps583)并用于感染293t/hace2细胞，如图3e所示。sars-cov-2s质粒、struδs质粒和pegfp-n1-ps101/pegfp-n1-ps583质粒共转染到293t细胞中，分别产生vlp(egfp-ps101)或vlp(egfp-ps583)。转染细胞中，s蛋白、n蛋白和egfp进行表达并组装成vlp，通过蛋白免疫印迹对几个蛋白进行分析(图13b和3c)。在vlp中检测到结构蛋白，而egfp未能被检测到。为了验证egfp-ps101或egfp-ps583 rna是否被包装到vlp中，用vlp感染293t/hace2细胞并检查受感染细胞中的egfp表达(图3e)。在vlp(egfp-ps101)或vlp(egfp-ps583)感染细胞48小时后，观察到egfp的绿色荧光，并且具有较高的荧光强度，这说明其具有更好的包装活性。如图13c和3d所示，vlp感染细胞中的低荧光信号可能是由于包装到vlp中的egfp-ps rna拷贝数较低。vlp(egfp)是通过sars-cov-2s质粒、struδs质粒和
pegfp-n1质粒共转染得到，并作为对照组，表面不含ps序列的egfp mrna不能被包装到vlp中(绿色荧光蛋白)。这些结果证实预测的序列在sars-cov-2中具有ps功能，对于将病毒基因组rna组装成vlp非常重要。
[0159]
结构蛋白在病毒感染和组装中的作用评估
[0160]
此前的报道证实，sars-cov-2s蛋白关联受体结合和膜融合，s蛋白的突变将极大地影响对宿主的感染能力。我们在sars-cov-2s质粒的基础上分别构建了4个不同区域的突变，包括rbd区域22553位点a到c置换和rbd区域22555位点c到g置换的n331q突变、23063位点a-t置换的n501y；rbd区附近23403位点的a到g置换的d614g；以及弗林蛋白酶区附近23604位点c到a置换的p681h突变；s突变体的构建和表征如图14-17所示。vlp s(突变)由sars-cov-2s(突变)质粒、struδs质粒和orf1ab质粒的共转染细胞后组装完成。病毒粒子中的sars-cov-2s和n蛋白通过蛋白质印迹进行鉴定，预期条带如图18所示。vlp s(突变)的形态和大小利用透射电镜进行分析，结果表明突变体与具有野生型s蛋白的vlp相似(图18)。为了检测s突变病毒颗粒的感染性，用dio标记脂质包膜产生荧光vlp s(突变)去感染293t/hace2细胞。将细胞在感染后1小时或2小时进行固定，接着随机选择500个细胞在共聚焦显微镜下成像，统计有色颗粒用于分析。与野生型s的vlp相比，vlp(n501y)、vlp(d614g)和vlp(p681h)具有更高的传染性，而vlp(n331q)的传染性则明显降低(图4a)。结果与之前的报告一致，表明我们构建的系统可以用于评估s突变对sars-cov-2组装和感染性影响的能力。
[0161]
为了研究核衣壳(n)在病毒rna包装中的必要性，我们在质粒sars-cov-2struδs上删除了n蛋白的编码区，从而构建了质粒sars-cov-2struδs-egfp/δn((又可称sars-cov-2struδs-egfp/δn质粒、struδs-egfp/δn质粒或struδs/δn质粒)图19a)。sars-cov-2struδs-egfp/δn质粒的活性和表达分别通过rt-pcr和蛋白免疫印迹进行检测(图19b和19c)。vlp(δn)可以通过sars-cov-2s质粒、struδs-egfp/δn质粒和orf1ab三质粒共转染细胞后得到。vlp(δn)呈球形、具有冠状结构，直径为81
±
17nm(n＝30，不包括刺突)，如tem图像所示。产生的vlp，我们用蛋白免疫印迹检测进行检测，检测到s蛋白，未能检测到n蛋白，这与预期的结果一致(图4c)。病毒rna组装过程中是否依赖核衣壳，是通过将vlp(δn-egfp-ps583)感染293t/hace2细胞确定的；vlp(δn-egfp-ps583)是通过与质粒sars-cov-2s质粒、struδs/δn质粒以及包装信号质粒pegfp-n1-ps583共转染产生。在vlp(δn-egfp-ps583)感染的细胞中观察到egfp的绿色荧光很少，如图4b所示；这与vlp(egfp-ps583)感染的细胞存在显着差异。结果表明，n蛋白对于vlp的形成不是必需的，但它在病毒rna包装中发挥重要作用。
[0162]
关于冠状病毒的早期报道中，膜(m)和包膜(e)蛋白作为主要的功能成分，在病毒颗粒的产生中发挥了重要作用；本研究也探究了m和e蛋白对vlp制备的影响。分别删除m或e蛋白编码序列，得到sars-cov-2struδs-egfp/δm质粒和sars-cov-2struδs-egfp/δe质粒，并通过rt-pcr和蛋白免疫印迹进行验证(图20和22)。将struδs突变体质粒，即sars-cov-2struδs-egfp/δm质粒或sars-cov-2struδs-egfp/δe质粒与质粒sars-cov-2s和orf1ab-mcherry共转染到293t细胞中，分别产生struδs突变体病毒颗粒rvp(δm)或rvp(δe)。tem图像和蛋白质印迹分析表明，缺乏m或e蛋白的病毒颗粒在转染细胞中仍然可获得(图4c、21a和23a)。struδs突变体病毒颗粒进一步用于感染293t/hace2细胞，在感染48
小时后没能观察到荧光信号(图21b和23b)，这与sars-cov-2vlp感染后宿主细胞的表现相反，表明即使缺失m或e基因，转染细胞也能产生突变病毒粒子，但病毒粒子的功能受到了影响。与n缺失的突变体不同，m或e蛋白的缺失不影响病毒rna的包装。
[0163]
sars-cov-2基因组中开放阅读框10(orf10)区域位于n基因下游，在之前的报道中orf10蛋白似乎没有发挥重大作用。我们构建了敲除orf10编码序列的sars-cov-2struδs-egfp/δorf10质粒，并进行表征(图24)；该质粒与质粒sars-cov-2s、orf1ab共转染细胞，从而产生vlp(δorf10)。vlp(δorf10)表现出与我们构建的sars-cov-2vlp具有相似的形态和功能(图4c)，表明orf10基因的缺失对病毒颗粒的组装没有影响。
[0164]
为了进一步确认上述结构蛋白/辅助蛋白对vlp组装的影响，我们对vlp中的基因组和囊膜分别进行了荧光标记，并通过荧光共定位效率初步探究了vlp的组装效率(图25)，结论与上述验证结果基本一致。
[0165]
rsars-cov-2病毒进入293t/hace2细胞的实时成像。
[0166]
我们制备了双荧光标记的sars-cov-2vlp(qd-dio)，以深入了解病毒进入过程，如图5a所示。病毒rna与靶核酸序列杂交形成复合物，用量子点(qd)纳米信标标记后带有红色荧光，复合物最终被病毒颗粒包裹。在qd标记病毒内部观察到暗电子致密核心(图5b)。为了获得双荧光颗粒，用dio标记脂质包膜。rna-qd和env-dio的荧光共定位证实了成功构建双色rsars-cov-2(qd-dio)(图5c)，其中rsars-cov-2也即sars-cov-2vlp。
[0167]
为了显示病毒进入的动态过程，通过共聚焦显微镜成像在293t/hace2细胞中跟踪sars-cov-2vlp(qd-dio)颗粒。在实时成像期间，只有包含qd和dio信号共定位，才当作单个病毒粒子。在293t/hace2细胞的膜上观察到双色颗粒，并以主动方式转运到宿主细胞中(图5d)。该病毒颗粒的轨迹如图5e所示。本研究中，我们对活细胞中的2000多个单病毒颗粒的轨迹进行了跟踪和分析。结果表明，47.5％病毒颗粒通过内吞作用进入293t/hace2细胞中，而其他颗粒仅附着在细胞膜表面，没有转运到细胞质中。
[0168]
病毒核心在胞吞进入宿主细胞过程中从包膜中的释放也被实时成像捕获。对活细胞中rsars-cov-2(qd-dio)颗粒的跟踪显示，病毒核心释放到细胞质中。具有qd和dio共定位信号(黄色)的病毒粒子在细胞质中成像，并且在病毒粒子的动态运动期间观察到红点与绿点的分离(图5f)。rna-qd和env-dio的轨迹在分离行为后有所不同，如图5g所示。结果表明病毒核心从内体中成功逃逸，这是产生感染的必要过程。本研究中，我们在293t/hace2细胞中分析了1000个单个粒子，并捕获了64个类似事件。较低的比例可能是由于在观察过程中被跟踪的粒子移出焦平面或荧光信号的光漂白。
[0169]
讨论
[0170]
为了研究sars-cov-2，我们构建了病毒基因组拆分系统(split-virus-genom，svg)，并进行了对应的表征分析。利用该系统产生了具有单轮感染的sars-cov-2vlp，有望用于生物学探索和疫苗开发。包含包装信号的sars-cov-2orf1ab rna被组装到rsars-cov-2中，而结构基因不在病毒粒子中，从而确保了系统的安全性。我们设计了一系列带有病毒基因的突变或缺失的rsars-cov-2突变体，以确定病毒成分的功能；探究了四种结构蛋白和orf10蛋白在sars-cov-2vlp感染和组装中的作用。同时，我们引入纳米信标和亲脂性染料，通过实时成像显示sars-cov-2vlp通过内吞作用进入宿主细胞的动态过程。根据研究需要，可以在系统中设计各种荧光探针，从而可视化病毒生命周期的其他步骤。另外，在bsl-2实
验室进行病毒学实验的通用平台对于研究sars-cov-2非常重要。基于我们构建的系统，可运用于目前几种类型的sars-cov-2研究：(1)sars-cov-2的功能分析可以通过设计rsars-cov-2突变体来进行每个成分的功能分析。(2)特定序列sars-cov-2包装信号的预测和验证，为研究参与病毒rna组装的分子机制提供了可靠的途径。(3)基于多色标记sars-cov-2vlp的单一病毒颗粒追踪，能够对活宿主细胞中病毒颗粒的侵染过程进行实时和精确地成像。(4)组装的具有不同成分的vlp促进了载体和疫苗的开发。结合这些优势，svg系统可发展为研究sars-cov-2和其他冠状病毒的宝贵平台。
[0171]
我们的实验结果证实svg系统具备安全性。sars-cov-2的全基因组分为三个部分，病毒rna组装所必需的包装信号位于orf1ab片段中。我们的系统缺乏多个基因片段，不会生产野生型病毒。与包含部分功能结构的假病毒不同，我们生产的病毒体几乎具有sars-cov-2的所有成分。然而，由于病毒包装的rna中缺乏结构基因，sars-cov-2vlp无法复制和组装子代病毒。这些单轮感染性病毒粒子无法对宿主细胞进行多轮感染，阻断了病毒的传播。不需要构建特定的稳定细胞系来生产可以在bsl-2实验室中安全操作的病毒颗粒，例如反式互补系统。根据病毒研究的需要，可以进一步从三个片段中删除一些orf基因，产生安全性更高的rsars-cov-2突变体。
[0172]
在svg系统中，我们惊讶地发现编码m蛋白的基因的缺失并不影响病毒颗粒的形成，而在vlp(δm)感染的细胞中却未观察到病毒rna表达的mcherry信号。这可能是由于突变病毒粒子中缺乏m蛋白干扰了病毒粒子的功能。因此，sars-cov-2m蛋白在病毒功能中起主要作用，但对于病毒颗粒的形成并不是必需的。它不同于sars-cov，在sars-cov中m蛋白是病毒组装的关键因素。我们开发的系统也有一些限制。病毒组装效率有待提高，这对系统的进一步提升和疫苗开发具有重要意义。病毒体包装的rna片段的优化可以促进sars-cov-2感染和复制的研究。本发明的svg系统、组合物和方法可用作促进中和试验和抗病毒测试的强大工具，利用该病毒基因组拆分系统可获得多种假病毒颗粒，可用于病毒抗体的中和抗体试验、抗病毒药物的筛选、病毒疫苗的制备等。总之，我们为sars-cov-2的研究开发了一个svg系统，可以在bsl-2实验室进行操作。产生的病毒粒子rsars-cov-2很容易进行工程改造，用于分析病毒生命过程和每个组件的功能。
[0173]
表1
[0174][0175]
下面的序列中，带有下划线的序列为同源臂
[0176]
s蛋白表达序列拆分片段(包含密码子优化的s蛋白基因组3822bp)：
[0177]
s-片段1(seq id no：1)：
[0178]
gcagtgagcgcaacgcaattaatgtgagttagctcactcattaggcaccccaggctttacactttatgcttccggctcgtatgttgtgtggaattgtgagcggataacaatttcacacaggaaacagctatgaccatgattacgccaagcttggtaccgagctcggatccactagtaacggccgccagtgtgctggaattctgcagatataacttcgtataatgtatgctatacgaagttatccgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattgtgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtcgaggtgagccccacgttctgcttcactctccccatctcccccccctccccacccccaattttgtatttatttattttttaattattttgtgcagcgatgggggcggggggggggggggggcggggcgaggggcggggcggggcgaggcggagaggtgcggcggcagccaatcagagcggcgcgctccgaaagtttccttttatggcgaggcggcggcggcggcggccctataaaaagcgaagcgcgcggcgggcgggagtcgctgcgcgctgccttcgccccgtgccccgctccgccgccgcctcgcgccgcccgccccggctctgactgaccgcgttactcccacaggtgagcgggcgggacggcccttctcctccgggctgtaattagctgagcaagaggtaagggtttaagggatggttggttggtggggtattaatgtttaattacctggagcacctgcctgaaatcactttttttcaggttggaccggtgccaccatgttcgtgttcctggtgctgctgcccctggtgagcagccagtgcgtgaacctgaccacccgcacccagctgccccccgcctacaccaacagcttcacccgcggcgtgtactaccccgacaaggtgttccgcagcagcgtgctgcacagcacccaggacctgttcctgcccttcttcagcaacgtgacctggttccacgccatccacgtgagcggcaccaacggcaccaagcgcttcgacaaccccgtgctgccc
ttcaacgacggcgtgtacttcgccagcaccgagaagagcaacatcatccgcggctggatcttcggcaccaccctggacagcaagacccagagcctgctgatcgtgaacaacgccaccaacgtggtgatcaaggtgtgcgagttccagttctgcaacgaccccttcctgggcgtgtactaccacaagaacaacaagagctggatggagagcgagttccgcgtgtacagcagcgccaacaactgcaccttcgagtacgtgagccagcccttcctgatggacctggagggcaagcagggcaacttcaagaacctgcgcgagttcgtgttcaagaacatcgacggctacttcaagatctacagcaagcacacccccatcaacctggtgcgcgacctgccccagggcttcagcgccctggagcccctggtggacctgcccatcggcatcaacatcacccgcttccagaccctgctggccctgcaccgcagctacctgacccccggcgacagcagcagcggctggaccgccggcgccgccgcctactacgtgggctacctgcagccccgcaccttcctgctgaagtacaacgagaacggcaccatcaccgacgccgtggactgcgccctggaccccctgagcgagaccaagtgcaccctgaagagcttcaccgtggagaagggcatctaccagaccagcaacttccgcgtgcagcccaccgagagcatcgtgcgcttccccaacatcaccaacctgtgccccttcggcgaggtgttcaacgccacccgcttcgccagcgtgtacgcctggaaccgcaagcgcatcagcaactgcgtggccgactacagcgtgctgtacaacagcgccagcttcagcaccttcaagtgctacggcgtgagccccaccaagctgaacgacctgtgcttcaccaacgtgtacgccgacagcttcgtgatccgcggcgacgaggtgcgccagatcgcccccggccagaccggcaagatcgccgactacaactacaagctgcccgacgacttcaccggctgcgtgatcgcctggaacagcaacaacctggacagcaaggtgggcggcaactacaactacctgtaccgcctgttccgcaagagcaacctgaagcccttcgagcgcgacatcagcaccgagatctaccaggccggcagcaccccctgcaacggcgtggagggcttcaactgctacttccccctgcagagctacggcttccagcccaccaacggcgtgggctaccagccctaccgcgtggtggtgctgagcttcgagctgctgcacgcccccgccaccgtgtgcggccccaagaagagcaccaacctggtgaagaacaagtgcgtgaacttcaacttcaacggcctgaccggcaccggcgtgctgaccgagagcaacaagaagttcctgcccttccagcagttcggccgcgacatcgccgacaccaccgacgccgtgcgcgacccccaga
[0179]
s-片段2(seq id no：2)：
[0180]
cttcgagctgctgcacgcccccgccaccgtgtgcggccccaagaagagcaccaacctggtgaagaacaagtgcgtgaacttcaacttcaacggcctgaccggcaccggcgtgctgaccgagagcaacaagaagttcctgcccttccagcagttcggccgcgacatcgccgacaccaccgacgccgtgcgcgacccccagaccctggagatcctggacatcaccccctgcagcttcggcggcgtgagcgtgatcacccccggcaccaacaccagcaaccaggtggccgtgctgtaccaggacgtgaactgcaccgaggtgcccgtggccatccacgccgaccagctgacccccacctggcgcgtgtacagcaccggcagcaacgtgttccagacccgcgccggctgcctgatcggcgccgagcacgtgaacaacagctacgagtgcgacatccccatcggcgccggcatctgcgccagctaccagacccagaccaacagcccccgccgcgcccgcagcgtggccagccagagcatcatcgcctacaccatgagcctgggcgccgagaacagcgtggcctacagcaacaacagcatcgccatccccaccaacttcaccatcagcgtgaccaccgagatcctgcccgtgagcatgaccaagaccagcgtggactgcaccatgtacatctgcggcgacagcaccgagtgcagcaacctgctgctgcagtacggcagcttctgcacccagctgaaccgcgccctgaccggcatcgccgtggagcaggacaagaacacccaggaggtgttcgcccaggtgaagcagatctacaagaccccccccatcaaggacttcggcggcttcaacttcagccagatcctgcccgaccccagcaagcccagcaagcgcagcttcatcgaggacctgctgttcaacaaggtgaccctggccgacgccggcttcatcaagcagtacggcgactgcctgggcgacatcgccgcccgcgacctgatctgcgcccagaagttcaacggcctgaccgtgctgccccccctgctgaccgacgagatgatcgcccagtacaccagcgccctgctggccggcaccatcaccagcggctggaccttcggcgccggcgccgccctgcagatccccttcgccatgcagatggcctaccgcttcaacggcatcggcgtgacccagaacgtgctgtacgagaaccagaagctgatcgccaaccagttcaacagcgccatcggcaagatccaggacagcctgagcagcaccgccagcgccctgggcaagctgcaggacgtggtgaaccagaacgcccaggccctgaacaccctggtgaagcagctgagc
agcaacttcggcgccatcagcagcgtgctgaacgacatcctgagccgcctggacaaggtggaggccgaggtgcagatcgaccgcctgatcaccggccgcctgcagagcctgcagacctacgtgacccagcagctgatccgcgccgccgagatccgcgccagcgccaacctggccgccaccaagatgagcgagtgcgtgctgggccagagcaagcgcgtggacttctgcggcaagggctaccacctgatgagcttcccccagagcgccccccacggcgtggtgttcctgcacgtgacctacgtgcccgcccaggagaagaacttcaccaccgcccccgccatctgccacgacggcaaggcccacttcccccgcgagggcgtgttcgtgagcaacggcacccactggttcgtgacccagcgcaacttctacgagccccagatcatcaccaccgacaacaccttcgtgagcggcaactgcgacgtggtgatcggcatcgtgaacaacaccgtgtacgaccccctgcagcccgagctggacagcttcaaggaggagctggacaagtacttcaagaaccacaccagccccgacgtggacctgggcgacatcagcggcatcaacgccagcgtggtgaacatccagaaggagatcgaccgcctgaacgaggtggccaagaacctgaacgagagcctgatcgacctgcaggagctgggcaagtacgagcagtacatcaagtggccctggtacatctggctgggcttcatcgccggcctgatcgccatcgtgatggtgaccatcatgctgtgctgcatgaccagctgctgcagctgcctgaagggctgctgcagctgcggcagctgctgcaagttcgacgaggacgacagcgagcccgtgctgaagggcgtgaagctgcactacacctaatgtacaaggaattctaactagagctcgctgatcagcctcgactgtgccttctagttgccagccatctgttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccctggaaggtgccactcccactgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcatcgcattgtctgagtaggtgtcattctattctggggggtggggtggggcaggacagcaagggggaggattgggaagagaatagcaggcatgctggggaataacttcgtataatgtatgctatacgaagttatatccatcacactggcggccgcctcgagcatgcatctagagggcccaattcgccctatagtgagtcgtattacaattcactggccgtcgttttacaacgtcgtgactgggaaaaccctggcgttacccaacttaatcgccttgcagcacatccccctttcgccagctggcgtaatagcgaagaggcccgcaccgatcgcccttcccaacagttgcgcagcct
[0181]
orf1ab序列拆分片段：
[0182]
orf1ab-片段1(seq id no：3)：
[0183]
ctgcctggcggcagtagcgcggtggtcccacctgaccccatgccgaactcagaagtgaaacgccgtagcgccgatggtagtgtggggtctccccatgcgagagtagggaactgccaggcatcaaataaaacgaaaggctcagtcgaaagactgggccttcctgccactcatcgcagtactgttgtaattcattaagcatgtagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctggtttagtgaaccgtcagatcgattaaaggtttataccttcccaggtaacaaaccaaccaactttcgatctcttgtagatctgttctctaaacgaactttaaaatctgtgtggctgtcactcggctgcatgcttagtgcactcacgcagtataattaataactaattactgtcgttgacaggacacgagtaactcgtctatcttctgcaggctgcttacggtttcgtccgtgttgcagccgatcatcagcacatctaggtttcgtccgggtgtgaccgaaaggtaagatggagagccttgtccctggtttcaacgagaaaacacacgtccaactcagtttgcctgttttacaggttcgcgacgtgctcgtacgtggctttggagactccgtggaggaggtcttatcagaggcacgtcaacatcttaaagatggcacttgtggcttagtagaagttgaaaaaggcgttttgcctcaacttgaacagccctatgtgttcatcaaacgttcggatgctcgaactgcacctcatggtcatgttatggttgagctggtagcagaactcgaaggcattcagtacggtcgtagtggtga
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[0184]
orf1ab-片段2(seq id no：4)：
[0185]
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[0186]
orf1ab-片段3(seq id no：5)：
[0187]
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[0195]
struδs蛋白表达序列拆分片段：
[0196]
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[0198]
struδs-片段2(seq id no：10)：
[0199]
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[0200]
struδs-片段3(seq id no：11)：
[0201]
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gtcgccttgcgtataatatttgcaaaaaacccctcaagacccgtttagaggccccaa
[0202]
实施例1中使用的5’utr(seq id no：12)
[0203]
attaaaggtttataccttcccaggtaacaaaccaaccaactttcgatctcttgtagatctgttctctaaacgaactttaaaatctgtgtggctgtcactcggctgcatgcttagtgcactcacgcagtataattaataactaattactgtcgttgacaggacacgagtaactcgtctatcttctgcaggctgcttacggtttcgtccgtgttgcagccgatcatcagcacatctaggtttcgtccgggtgtgaccgaaaggtaag
[0204]
实施例1中使用的3’utr(包含polya尾巴，seq id no：13)
[0205]
caatctttaatcagtgtgtaacattagggaggacttgaaagagccaccacattttcaccgaggccacgcggagtacgatcgagtgtacagtgaacaatgctagggagagctgcctatatggaagagccctaatgtgtaaaattaattttagtagtgctatccccatgtgattttaatagcttcttaggagaatgacaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa
[0206]
本发明的实施方式并不限于上述实施例所述，在不偏离本发明的精神和范围的情况下，本领域普通技术人员可以在形式和细节上对本发明做出各种改变和改进，而这些均被认为落入了本发明的保护范围。