一种表达新型冠状病毒RBD蛋白的重组狂犬病毒及其应用的制作方法

一种表达新型冠状病毒rbd蛋白的重组狂犬病毒及其应用
技术领域
1.本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种表达新型冠状病毒rbd蛋白的重组狂犬病毒及其应用。


背景技术：

2.新型冠状病毒(sars-cov-2)属于冠状病毒科，β-冠状病毒属病毒，感染后会引起新型冠状病毒肺炎(covid-19)。宠物猫、宠物犬是现在大多数家庭最常饲养的宠物，与人类亲密无间、同吃同住。在新冠肺炎肆意传播的期间，有研究证实家养宠物也有感染新冠肺炎的风险。因为猫、犬体内的病毒受体ace2与人体中的病毒受体hace2有极大的相似性，所以对于covid-19具有易感性，但无明显的与人体类似的临床症状。此外，由于猫、雪貂、水貂和仓鼠在自然或实验条件下对covid-19感染的易感性高，这些动物被广泛作为研究sars-cov-2致病机理和传播的动物模型。
3.狂犬病是由狂犬病病毒(rabv)感染引起的重要人兽共患传染病，发病后通常导致急性脑炎或脑膜炎，病死率几乎100％。犬传播狂犬病引起的人类病例数超过总病例数的99％。越来越多的证据表明，动物和人类狂犬病完全可以通过合理地使用疫苗加以预防。大规模犬类免疫接种也是消除人类狂犬病的根本措施。


技术实现要素：

4.为了解决现有技术存在的技术问题，本发明提供一种表达新型冠状病毒rbd蛋白的重组狂犬病毒及其应用。
5.第一方面，本发明提供一种表达新型冠状病毒rbd蛋白的重组狂犬病病毒，所述重组狂犬病病毒含有新型冠状病毒的s蛋白的rbd结构；
6.所述s蛋白包括如seq id no.1所示的氨基酸序列。
7.进一步地，所述s蛋白由包括如seq id no.2所示的核苷酸序列编码得到。
8.进一步地，所述s蛋白的rbd结构包括如seq id no.3所示的氨基酸序列。
9.进一步地，所述s蛋白的rbd结构由如seq id no.4所示的核苷酸序列编码得到。
10.进一步地，所述重组狂犬病病毒的p基因和m基因间，包括如seq id no.4所示的核苷酸序列。
11.进一步地，在所述重组狂犬病病毒的p基因和m基因间，tm-cd区前包括如seq id no.4所示的核苷酸序列；
12.所述tm-cd区包括如seq id no.5所示的核苷酸序列。
13.作为一种优选的具体实施方式，所述重组狂犬病病毒在p基因和m基因间包括依次相连的如seq id no.6所示的信号肽序列，如seq id no.4所示的rbd区域的核苷酸序列和如seq id no.5所示的tm-cd区的核苷酸序列。
14.第二方面，本发明提供一种狂犬病疫苗，所述狂犬病疫苗包括所述重组狂犬病病毒。
15.进一步地，所述狂犬病疫苗还包括佐剂，所述佐剂为铝胶、m1313、gel01、gel02或201vg中的一种或多种。
16.本发明进一步提供所述重组狂犬病病毒在制备用于治疗、免疫、检测狂犬病病毒和/或新型冠状病毒的药物中的应用。所述的药物包括药品、生物制品；所述生物制品包括疫苗、检测抗原。
17.本发明进一步提供所述制备方法在提高狂犬病病毒的免疫原性中的应用。
18.本发明具备如下有益效果：
19.本发明通过将新型冠状病毒s蛋白的rbd区域的编码基因整合至狂犬病病毒的基因序列中，得到一种重组狂犬病病毒，该重组狂犬病病毒在灭活后可以同时作为狂犬病毒和新冠病毒的疫苗使用，且均能针对机体产生有效保护，这在狂犬病和新冠肺炎的治疗和免疫的领域，具有重要意义。
附图说明
20.图1为本发明实施例1提供的构建重组狂犬病病毒srv-ncov-s1、srv-ncov-rbd的基因重组策略图。
21.图2为本发明实施例1提供的质粒酶切鉴定电泳图；其中，a为质粒pd-srv-ncov-s1鉴定图(1为marker 15000，2为质粒经bsiwⅰ和pacⅰ双酶切产物，3为marker 2000)；b为质粒pd-srv-ncov-rbd鉴定图(1为质粒经bsiwⅰ和pacⅰ双酶切产物，2为marker 5000)。
22.图3为本发明实施例1提供的重组狂犬病病毒srv-ncov-s1、srv-ncov-rbd激光共聚焦鉴定结果。
23.图4为本发明实施例1提供的重组狂犬病病毒的电镜观察结果；其中，a为srv-ncov-s1观察结果；b为srv-ncov-rbd观察结果。
24.图5为本发明实施例1提供的重组狂犬病病毒的western blot鉴定结果；其中，其中，a为srv-ncov-s1鉴定结果；b为srv-ncov-rbd鉴定结果(m为蛋白marker，1为重组狂犬病病毒，2为母本病毒srv9对照)。
25.图6为本发明实施例2提供的重组狂犬病病毒srv-ncov-s1、srv-ncov-rbd免疫小鼠血清的sars-cov-2elisa效价检测结果。
26.图7为本发明实施例2提供的重组狂犬病病毒srv-ncov-s1、srv-ncov-rbd免疫小鼠血清的rabv中和抗体效价检测结果。
27.图8为本发明实施例3提供的重组狂犬病病毒srv-ncov-rbd免疫猫血清的sars-cov-2elisa效价检测结果。
28.图9为本发明实施例3提供的重组狂犬病病毒srv-ncov-rbd免疫猫血清的rabv中和抗体效价检测结果。
29.图10为本发明实施例4提供的重组狂犬病病毒srv-ncov-rbd免疫犬血清的sars-cov-2elisa效价检测结果。
30.图11为本发明实施例4提供的重组狂犬病病毒srv-ncov-rbd免疫犬血清的rabv中和抗体效价检测结果。
具体实施方式
31.以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
32.以下实施例涉及的材料和主要试剂如下：
33.1.质粒、细胞及抗体
34.狂犬病病毒全长感染性克隆质粒、辅助质粒、bsr细胞均由本实验室保存。fitc标记的rabv n蛋白单抗购自fdi fujirebio公司；rabv-g单抗购自millipore公司；兔抗sars-cov-2rbd蛋白多抗购自北京义翘神州科技股份有限公司；tritc-抗鼠抗体购自sigma公司；fitc标记的羊抗兔igg抗体购自博奥森公司；hrp标记的羊抗兔igg抗体购自bioworld公司。
35.2.主要试剂
36.质粒小量提取试剂盒、pcr回收试剂盒均购自axygen公司；phusion超保真dna聚合酶、t4 dna连接酶均购自neb公司；hst08感受态、dnamarker均购自takara公司；fastdigest限制性内切酶、脂质体lipofectamine3000、opti-mem、胎牛血清、预染蛋白marker、ecl化学发光底物均购自thermo公司；dmem培养液、0.25％胰酶均购自corning公司；氨苄、4％多聚甲醛购自索莱宝公司；rna提取试剂盒购自天根公司；dapi购自碧云天公司；nc膜购自ge公司；脱脂奶粉购自bd公司。
37.实施例1表达ncov s1/rbd蛋白重组rabv的构建
38.1、表达ncov s1/rbd基因的重组rabv构建
39.1.1引物设计与构建策略
40.从genbank获得ncov基因序列(genbank no:nc_045512.2)，利用primer premier软件设计扩增s1基因(核苷酸序列如seq id no.2所示)的引物，引物序列见表1。同时为了增加表达量，在起始密码子atg前引入kozak序列(gccgccacc)。拟将目的基因通过bsiw i+pac i酶切位点，连入可表达外源片段的rabv全长质粒pd-srv9-pm-tmcd中(见图1)，即rabv p-m基因间，已保留有rabv g蛋白基因的tm-cd区(核苷酸序列如seq id no.5所示)。基因序列、引物由吉林省库美生物科技有限公司合成。
41.同时，设计扩增rbd基因的引物，引物序列见表1。通过上游引物通过两次pcr进入ncov s蛋白的信号肽(atgtttgtttttcttgttttattgccactagtctctagtcagtgt)，在起始密码子atg前引入kozak序列。通过bsiw i+pac i酶切位点，连入rabv全长质粒pd-srv9-pm-tmcd中(见图1)。
42.表1 ncov s1/rbd基因扩增引物
[0043][0044]
1.2目的基因的扩增
[0045]
利用合成的s基因为模板，ncov-s1-pm-f+ncov-s1-pm-r引物，利用超保真dna聚合酶对s1基因进行扩增，产物经1％琼脂糖凝胶电泳后，按凝胶回收试剂盒说明书的操作对s基因片段进行回收纯化，将得到的基因片段命名为ncov-s1。利用合成的s基因为模板，ncov-rbd-pm-f1+ncov-rbd-pm-r引物，利用超保真dna聚合酶对rbd基因进行扩增，产物经1％琼脂糖凝胶电泳后，按凝胶回收试剂盒说明书的操作对rbd基因片段进行回收纯化，将得到的基因片段命名为ncov-rbd-i。以ncov-rbd-i pcr产物为模板，ncov-rbd-pm-f2+ncov-rbd-pm-r引物，进行pcr、电泳纯化，将得到的基因片段命名为ncov-rbd-ii(核苷酸序列如seq id no.4所示)。
[0046]
1.3全长质粒的构建
[0047]
将ncov-s1 pcr产物、ncov-rbd-ii pcr产物与可表达外源片段的rabv全长质粒pd-srv9-pm-tmcd(携带rabv g蛋白基因的tm-cd区)用bsiwⅰ和pacⅰ进行双酶切，酶切产物经1％琼脂糖凝胶电泳后回收。将酶切回收产物基因与载体片段通过t4 dna连接酶16℃连接过夜。取连接产物转化stellar感受态，涂布氨苄抗性的lb固体培养基上，30℃培养24h，挑取单菌落于氨苄抗性的lb液体培养基中，30℃培养24h，提质粒进行电泳鉴定、双酶切鉴定。将鉴定正确的质粒送吉林省库美生物科技有限公司测序，测序正确的重组质粒分别命名为pd-srv9-ncov-s1、pd-srv9-ncov-rbd。
[0048]
1.4重组病毒的拯救
[0049]
分别将重组质粒pd-srv9-ncov-s1、pd-srv9-ncov-rbd与辅助质粒pd-n、pd-p、pd-m、pd-g共转染bsr细胞，拯救表达ncov-s1/rbd蛋白的重组rabv，步骤如下：
[0050]
(1)取8μl脂质体lipofectamine 3000加入到240μl opti-mem中，混匀，室温孵育5min；
[0051]
(2)将重组质粒4μg和辅助质粒pd-n(0.625μg)、pd-p(0.3125μg)、pd-m(0.125μg)、pd-g(0.1875μg)加入到opti-mem中，再加入8μl p3000，混匀，室温孵育5min；
[0052]
(3)将(1)与(2)混合、混匀，于室温孵育20min；
[0053]
(4)将已单层的六孔板bsr细胞用双无dmem清洗2次，最后每孔加1.5ml opti-mem；
[0054]
(5)将(3)中的dna-脂质体复合物逐滴、分散加到六孔板细胞中，细胞置于37℃5％co2培养箱静置培养4～6h；
[0055]
(6)吸弃孔中液体，加入含5％fbs和1％双抗的dmem，2ml/孔，37℃ 5％co2培养箱中静置培养；
[0056]
(7)转染后第3天更换新鲜培养液，继续培养至第6天，收获细胞培养混合物，接种96孔bsr细胞进行直接免疫荧光鉴定。
[0057]
2、重组rabv的鉴定
[0058]
使用直接免疫荧光鉴定重组rabv是否拯救成功。将待检测的样品同步接种96孔细胞培养板bsr细胞中，100μl/孔，37℃ 5％co2培养箱培养2天。用80％冷丙酮室温固定30min后，pbst洗板3次，加入fitc标记的抗rabv n蛋白单抗(200倍稀释)，50μl/孔，37℃孵育1小时。pbst洗板3次后，在荧光显微镜下观察荧光情况。
[0059]
2.3重组rabv传代
[0060]
将成功拯救的重组病毒按体积比1/20单层接种bsr细胞，37℃ 5％co2培养箱静置培养4天后，收获上清，继续盲传至第4代。将第4代的重组rabv进行病毒滴度测定。
[0061]
2.4 rabv滴度测定
[0062]
将待测样品使用双无dmem进行10倍倍比稀释，加入96孔细胞板中，100μl/孔，每个稀释度做4个复孔。再加入na细胞悬液，100μl/孔。37℃5％co2培养箱静置培养2天，使用fitc标记的抗rabv n蛋白单抗进行直接免疫荧光鉴定，在荧光显微镜下判定每孔的阴阳性，根据reed-muench算法计算rabv滴度。
[0063]
2.5外源蛋白表达鉴定
[0064]
2.5.1激光共聚焦鉴定
[0065]
将na细胞接种至激光共聚焦小皿中，将重组病毒按moi＝0.3接种细胞中。37℃5％co2培养箱静置培养2天，用4％多聚甲醛固定细胞后，使用rabv-g单抗(200倍稀释)、兔抗sars-cov-2rbd蛋白多抗(200倍稀释)作为一抗，37℃孵育1h；再用tritc-抗鼠抗体(500倍稀释)、fitc-抗兔抗体(300倍稀释)作为二抗，37℃孵育1h，加一滴dapi后，使用激光共聚焦观察荧光情况。
[0066]
2.5.2电镜观察
[0067]
将样品吸附到金属网上，用1％磷钨酸染色2～3分钟，然后，用滤纸吸掉金属网上的残余染色液，最后，利用电镜观察与分析。
[0068]
2.5.3 wb鉴定
[0069]
将重组病毒按1/50体积比加入1m醋酸锌，4℃30min沉淀病毒，4℃10,000rpm 30min收获沉淀，加入适量饱和edta悬浮沉淀，加到蔗糖梯度溶液(20％-30％-40％-55％)的最上层，4℃21,000rpm 90min，吸取30％～40％蔗糖溶液间的病毒条带，再加入ste去蔗糖一次，沉淀用适量ste悬浮，获得纯化的重组病毒。
[0070]
为鉴定重组病毒中各蛋白的表达情况，对纯化的重组病毒进行western blot鉴定。具体步骤如下：将待检样品与5
×
蛋白上样缓冲液充分混合，经sds-page后，将蛋白胶转至nc膜，使用兔抗sars-cov-2rbd蛋白多抗(1000倍稀释)作为一抗，室温孵育2小时；hrp标记的羊抗兔igg抗体(20000倍稀释)作为二抗，孵育1小时后，滴加化学发光底物，放到暴光仪中显色，观察目的条带情况。
[0071]
3、结果
[0072]
3.1重组质粒的鉴定
[0073]
构建的重组质粒pd-srv9-ncov-s1、pd-srv9-ncov-rbd经bsiw i+pac i双酶切鉴定，结果表明，双酶切获得的片段大小与预期片段大小一致，见图2所示，pd-srv9-ncov-s1可见2055bp+17400bp两条带，pd-srv9-ncov-rbd可见714bp+17400bp两条带。质粒的测序结果与预期结果一致，表明构建的质粒完全正确。
[0074]
3.2激光共聚焦鉴定
[0075]
使用rabv-g蛋白单抗、sars-cov-2rbd蛋白多抗对srv-ncov-s1、srv-ncov-rbd感染的na细胞染色、观察。结果见图3所示，在细胞膜上可见红色标记的rabv-g蛋白、绿色标记的rbd蛋白，且两种颜色标记可同时合成黄色，说明两种蛋白可共定位表达在细胞膜上。
[0076]
3.3电镜观察结果
[0077]
将重组病毒进行电镜负染观察。结果见图4所示，可观察到典型的子弹样结构，表明外源蛋白的表达未影响狂犬病病毒的包装。
[0078]
3.4 wb鉴定结果
[0079]
将纯化的重组病毒进行western blot检测，结果如图5所示，样品孔泳道出现一条特异性条带，表明目的蛋白成功表达。
[0080]
实施例2重组狂犬病病毒灭活疫苗对小鼠免疫原性研究
[0081]
1、材料
[0082]
1.1抗原
[0083]
重组病毒srv-ncov-s1、srv-ncov-rbd见实施例1。
[0084]
1.2主要试剂
[0085]
β-丙内酯购自ferak berlin gmbh公司；poly(i:c)、tmb购自sigma公司；201vg佐剂购自赛比克公司；纯化的rbd蛋白购自gene universal公司；脱脂奶粉购自bd公司；elisa板购自corning公司；hrp标记的羊抗鼠igg抗体购自bioworld公司；fitc标记的抗rabv n蛋白单抗购自fujirebio diagnostics公司。
[0086]
1.3实验动物
[0087]
6～8周龄雌性balb/c小鼠购自辽宁长生生物技术股份有限公司。
[0088]
2、方法
[0089]
2.1灭活及检验
[0090]
将抗原均稀释到10
8.8
tcid
50
/ml，按1:3000比例加入β-丙内酯，4℃灭活24h，37℃水解2h。取少量灭活后的抗原按照原倍、10倍和100倍稀释后在bsr细胞上采用直接免疫荧光检测方法进行灭活检验。
[0091]
2.2疫苗的制备
[0092]
将灭活的srv-ncov-s1、srv-ncov-rbd与加入终浓度为0.2mg/ml的poly(i:c)，再按体积比45:55比例加入201vg佐剂，振荡器混匀10min后，20℃静置1h，制备成srv-ncov-s1、srv-ncov-rbd灭活疫苗，疫苗于4℃保存。
[0093]
2.3小鼠免疫
[0094]
将balb/c小鼠随机分为2组，6只/组，分别为灭活疫苗组、佐剂对照组。进行后肢肌肉免疫，100μl/只。首免后第2、4周加强免疫一次，免疫剂量和途径与首免相同。
[0095]
2.4采血
[0096]
分别在首免后第1、2、3、4、5、6、8、12、16周进行小鼠眼眶后静脉丛采血，分离血清，
56℃热灭活30min后，使用间接elisa进行针对ncov rbd igg抗体检测。
[0097]
2.5间接elisa实验
[0098]
(1)包被：将商品化的rbd蛋白稀释至5μg/ml，加入elisa板中，100μl/孔，4℃包被过夜。
[0099]
(2)洗板：pbst洗板，200μl/孔，5min/次，洗板5次。
[0100]
(3)封闭：加入5％脱脂奶粉，l50μl/孔。37℃封闭1h。
[0101]
(4)洗板：pbst洗板，200μl/孔，5min/次，洗板5次。
[0102]
(5)孵育待检血清：使用pbs将待检鼠血清200倍稀释，加入elisa板中，100μl/孔，37℃孵育1h。
[0103]
(6)洗板：pbst洗板，200μl/孔，5min/次，洗板5次。
[0104]
(7)孵育二抗：使用pbs将hrp标记的羊抗鼠igg抗体2万倍稀释，加入elisa板中，100μl/孔，37℃孵育1h。
[0105]
(8)洗板：pbst洗板，200μl/孔，5min/次，洗板5次。
[0106]
(9)显色：加入tmb，100μl/孔，避光显色3～5min。
[0107]
(10)终止显色：加入0.5m h2so4，50μl/孔。使用酶标仪在450nm波长处测定od值。
[0108]
2.6 rabv中和抗体检测
[0109]
在96孔细胞板中，每孔先加入100μl双无培养液，将血清进行3倍稀释至第6列，每个样品4个重复。将标定好病毒使用双无dmem稀释至100tcid
50
/50μl，加入96孔板中，50μl/孔。病毒对照孔中，每孔加入150μl的双无培养液，再将已稀释好的狂犬病病毒cvs11株做4倍梯度稀释，稀释至第6列，做4个重复。细胞对照中不加病毒。37℃、5％co2温箱中感作1小时后加入50μl/孔bhk细胞。37℃5％co2温箱中培养2天。48小时后，利用fitc标记的抗rabv n蛋白单抗进行直接免疫荧光鉴定。在荧光显微镜下观察，根据与标准阳性血清(效价为0.5iu/ml)结果，计算rabv中和抗体效价。
[0110]
3结果
[0111]
srv-ncov-s1、srv-ncov-rbd灭活疫苗免疫的小鼠血清中均能检测到针对ncov rbd蛋白的igg抗体，加强免疫后小鼠血清中的抗体效价有所增加(图6)。抗体效价可至少持续至免疫后16周。此外，srv-ncov-rbd免疫组可早于srv-ncov-s1免疫组产生抗体，且srv-ncov-rbd免疫组igg抗体水平维持时间长于srv-ncov-s1组。
[0112]
免疫的小鼠血清内均能检测到rabv中和抗体效价，且均远高于0.5iu/ml，而rabv中和抗体效价高于0.5iu/ml即被认为具有对机体的保护力(图7)。
[0113]
实施例3 srv-ncov-rbd灭活疫苗对猫的免疫原性研究
[0114]
1、材料
[0115]
1.1抗原
[0116]
重组病毒srv-ncov-rbd见实施例1。
[0117]
1.2主要试剂
[0118]
β-丙内酯购自ferak berlin gmbh公司；tmb购自sigma公司；gel02佐剂购自赛比克公司；纯化的rbd蛋白购自gene universal公司；脱脂奶粉购自bd公司；elisa板购自corning公司；hrp标记的羊抗猫igg抗体购自sigma公司；fitc标记的抗rabv n蛋白单抗购自fujirebio diagnostics公司。
[0119]
2、方法
[0120]
2.1灭活及检验
[0121]
将抗原srv-ncov-rbd按1:3000比例加入β-丙内酯，4℃灭活24h，37℃水解2h。取少量灭活后的抗原按照原倍、10倍和100倍稀释后在bsr细胞上采用直接免疫荧光检测方法进行灭活检验。
[0122]
2.2疫苗的制备
[0123]
将灭活的srv-ncov-rbd与gel 02佐剂按7:1比例混合，4℃旋转混匀30min，制备成srv-ncov-rbd灭活疫苗，疫苗于4℃保存。
[0124]
2.3猫免疫
[0125]
将健康成年猫随机分为2组，3只/组，分别为灭活疫苗组、佐剂对照组。进行皮下注射免疫，1ml/只。首免后第三周加强免疫一次，免疫剂量和途径与首免相同。
[0126]
2.4采血
[0127]
分别在首免后第0、2、3、6、8、13周对实验猫进行静脉采血，分离血清，56℃热灭活30min后，使用间接elisa进行针对ncov rbd igg抗体检测。
[0128]
2.5间接elisa实验
[0129]
(1)包被：将商品化的rbd蛋白稀释至5μg/ml，加入elisa板中，100μl/孔，4℃包被过夜。
[0130]
(2)洗板：pbst洗板，200μl/孔，5min/次，洗板5次。
[0131]
(3)封闭：加入5％脱脂奶粉，l50μl/孔。37℃封闭1h。
[0132]
(4)洗板：pbst洗板，200μl/孔，5min/次，洗板5次。
[0133]
(5)孵育待检血清：使用pbs将待检猫血清200倍稀释，加入elisa板中，100μl/孔，37℃孵育1h。
[0134]
(6)洗板：pbst洗板，200μl/孔，5min/次，洗板5次。
[0135]
(7)孵育二抗：使用pbs将hrp标记的羊抗猫igg抗体5000倍稀释，加入elisa板中，100μl/孔，37℃孵育1h。
[0136]
(8)洗板：pbst洗板，200μl/孔，5min/次，洗板5次。
[0137]
(9)显色：加入tmb，100μl/孔，避光显色3～5min。
[0138]
(10)终止显色：加入0.5m h2so4，50μl/孔。使用酶标仪在450nm波长处测定od值。
[0139]
2.6 rabv中和抗体检测
[0140]
在96孔细胞板中，每孔先加入100μl双无培养液，将血清进行3倍稀释至第6列，每个样品4个重复。将标定好病毒使用双无dmem稀释至100tcid
50
/50μl，加入96孔板中，50μl/孔。病毒对照孔中，每孔加入150μl的双无培养液，再将已稀释好的狂犬病病毒cvs11株做4倍梯度稀释，稀释至第6列，做4个重复。细胞对照中不加病毒。37℃、5％co2温箱中感作1小时后加入50μl/孔bhk细胞。37℃5％co2温箱中培养2天。48小时后，利用fitc标记的抗rabv n蛋白单抗进行直接免疫荧光鉴定。在荧光显微镜下观察，根据与标准阳性血清(效价为0.5iu/ml)结果，计算rabv中和抗体效价。
[0141]
3、结果
[0142]
srv-ncov-rbd灭活疫苗免疫猫后，血清中能检测到针对ncov rbd蛋白的igg抗体，加强免疫后，猫血清中的抗体效价有所增加(图8)，可至少持续至免疫后13周。免疫猫血清
内均能检测到rabv中和抗体效价，且均远高于0.5iu/ml(图9)。
[0143]
实施例4 srv-ncov-rbd灭活疫苗对犬的免疫原性研究
[0144]
1、材料
[0145]
1.1抗原
[0146]
重组病毒srv-ncov-rbd见实施例1。
[0147]
1.2主要试剂
[0148]
β-丙内酯购自ferak berlin gmbh公司；tmb购自sigma公司；gel02佐剂购自赛比克公司；纯化的rbd蛋白购自gene universal公司；脱脂奶粉购自bd公司；elisa板购自corning公司；hrp标记的羊抗猫igg抗体购自sigma公司；fitc标记的抗rabv n蛋白单抗购自fujirebio diagnostics公司。
[0149]
2、方法
[0150]
2.1灭活及检验
[0151]
将抗原srv-ncov-rbd按1:3000比例加入β-丙内酯，4℃灭活24h，37℃水解2h。取少量灭活后的抗原按照原倍、10倍和100倍稀释后在bsr细胞上采用直接免疫荧光检测方法进行灭活检验。
[0152]
2.2疫苗的制备
[0153]
将灭活的srv-ncov-rbd与gel 02佐剂按7:1比例混合，4℃旋转混匀30min，制备成srv-ncov-rbd灭活疫苗，疫苗于4℃保存。
[0154]
2.3犬免疫
[0155]
将健康成年犬随机分为2组，5只/组，分别为灭活疫苗组、佐剂对照组。进行皮下注射免疫，1ml/只。首免后第三周加强免疫一次，免疫剂量和途径与首免相同。
[0156]
2.4采血
[0157]
分别在首免后第0、3、5、7、9、11周对实验犬进行静脉采血，分离血清，56℃热灭活30min后，使用间接elisa进行针对ncov rbd igg抗体检测。
[0158]
2.5间接elisa实验
[0159]
(1)包被：将商品化的rbd蛋白稀释至5μg/ml，加入elisa板中，100μl/孔，4℃包被过夜。
[0160]
(2)洗板：pbst洗板，200μl/孔，5min/次，洗板5次。
[0161]
(3)封闭：加入5％脱脂奶粉，l50μl/孔。37℃封闭1h。
[0162]
(4)洗板：pbst洗板，200μl/孔，5min/次，洗板5次。
[0163]
(5)孵育待检血清：使用pbs将待检犬血清200倍稀释，加入elisa板中，100μl/孔，37℃孵育1h。
[0164]
(6)洗板：pbst洗板，200μl/孔，5min/次，洗板5次。
[0165]
(7)孵育二抗：使用pbs将hrp标记的羊抗犬igg抗体2万倍稀释，加入elisa板中，100μl/孔，37℃孵育1h。
[0166]
(8)洗板：pbst洗板，200μl/孔，5min/次，洗板5次。
[0167]
(9)显色：加入tmb，100μl/孔，避光显色3～5min。
[0168]
(10)终止显色：加入0.5m h2so4，50μl/孔。使用酶标仪在450nm波长处测定od值。
[0169]
2.6 rabv中和抗体检测
[0170]
在96孔细胞板中，每孔先加入100μl双无培养液，将血清进行3倍稀释至第6列，每个样品4个重复。将标定好病毒使用双无dmem稀释至100tcid
50
/50μl，加入96孔板中，50μl/孔。病毒对照孔中，每孔加入150μl的双无培养液，再将已稀释好的狂犬病病毒cvs11株做4倍梯度稀释，稀释至第6列，做4个重复。细胞对照中不加病毒。37℃、5％co2温箱中感作1小时后加入50μl/孔bhk细胞。37℃5％co2温箱中培养2天。48小时后，利用fitc标记的抗rabv n蛋白单抗进行直接免疫荧光鉴定。在荧光显微镜下观察，根据与标准阳性血清(效价为0.5iu/ml)结果，计算rabv中和抗体效价。
[0171]
3、结果
[0172]
srv-ncov-rbd灭活疫苗免疫犬后，血清中能检测到针对ncov rbd蛋白的igg抗体，加强免疫后，igg抗体效价显著增加(图10)。且免疫犬的血清中均能检测到rabv中和抗体效价，且均远高于0.5iu/ml，而rabv中和抗体效价高于0.5iu/ml即被认为具有对机体的保护力(图11)。
[0173]
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。