来源于小豆的蛋白VaVPAC及其编码基因在增强烟草抗旱性方面的应用

来源于小豆的蛋白vavpac及其编码基因在增强烟草抗旱性方面的应用
技术领域
1.本发明涉及植物生物工程技术领域，具体涉及来源于小豆的蛋白vavpac及其编码基因在增强烟草抗旱性方面的应用。


背景技术：

2.随着近年来全球气候变暖不断加剧，干旱胁迫已成为造成作物减产的主要非生物胁迫之一，我国由于干旱造成的粮食损失占全部自然灾害的50％以上。因此，解决干旱问题是实现农业可持续发展的重要挑战。
3.传统作物抗旱育种周期长、投入大且受抗旱种质资源狭窄等因素的制约，导致当前抗旱育种进展缓慢。生物技术育种可以打破物种间限制，提供高效抗旱育种的新途径，因此，鉴定抗旱基因资源是获得抗旱转基因作物新品种的关键。我们通过鉴定小豆的抗旱种质资源，找到了极端耐旱的小豆种质后，以极端抗旱和极端敏感小豆种质作为材料，采用转录组测序方法分析干旱胁迫条件下抗旱种质与敏感种质的基因表达差异，从中鉴定了抗旱基因vavpac(文献：characterization of drought
‑
responsive transcriptome during seed germination in adzuki bean(vigna angularis l.)by pacbio smrt and illumina sequencing，front.genet，2020，11:996.)，并在烟草中通过病毒表达载体超量表达，证实了vavpac能够提高植物耐旱性，可以作为一种抗旱基因资源用于植物的抗旱育种。


技术实现要素：

4.针对现有技术存在的不足，本发明提供了来源于小豆的蛋白vavpac及其编码基因在增强烟草抗旱性方面的应用。
5.本发明方案具体包括以下几个方面：
6.一方面，提供了蛋白vavpac在增强烟草抗旱性方面的应用。该蛋白的氨基酸序列如seq id no.1所示。编码该蛋白的基因序列如seq id no.1所示。
7.另一方面，本发明还提供一种鉴定基因抗旱功能的方法，包括如下步骤：将目的基因导入pvx
‑
lic载体，注射烟草叶片后通过pvx病毒复制超量表达目的基因后，通过完全控水方式导致干旱，观察植物在干旱条件下是否存活，从而鉴定目的基因抗旱功能。其中，所述导入是通过在pvx
‑
lic载体的lic1和lic2位点间插入目的基因。
8.本发明还提供了蛋白vavpac编码基因的制备方法，包括以下步骤：
9.以质量浓度9.0％甘露醇胁迫处理36h后的小豆种子为材料提取总rna，并反转录获得cdna，以该cdna为模板，在引物vavpac
‑
f1和引物vavpac
‑
r1的引导下，进行pcr扩增，回收pcr产物并纯化，得dna片段。
10.本发明所取得的效果：
11.本发明实验证实，将含有蛋白vavpac编码基因的重组表达载体pvx
‑
lic
‑
vavpac注
射烟草瞬时超量表达得到的烟草在干旱条件下抗旱能力明显强于野生型和空载体表达烟草。本发明在利用vavpac蛋白增强植物抗旱性方面具有重要意义。
附图说明
12.图1：vavpac基因cdna编码核苷酸序列的扩增结果。其中，m为d2000plus marker，从上至下的条带大小依次为5000、3000、2000、1000、750、500、250、100bp。
13.图2：导入重组质粒pvx
‑
lic
‑
vavpac质粒的农杆菌pcr鉴定。1
‑
7均为单克隆编号，h2o为空白对照。“m”为marker。
14.图3：rt
‑
pcr检测烟草植株中vavpac的表达。m：dl2000 plus marker；泳道1
‑
5分别为未注射正常生长烟草，未注射干旱处理烟草，转化pvx
‑
lic空载体烟草，转化pvx
‑
lic
‑‑
vavpac质粒烟草。
15.图4：超量表达vavpac烟草在干旱胁迫下的表型。上图从左至右分别为干旱处理前(0d)未注射烟草、未注射烟草、转化pvx
‑
lic空载体烟草，转化pvx
‑
lic
‑
vavpac质粒烟草。下图从左至右分别为未注射烟草正常生长15d、未注射烟草干旱处理15d、转化pvx
‑
lic空载体烟草干旱处理15d、转化pvx
‑
lic
‑
vavpac质粒烟草干旱处理15d。
具体实施方式
16.为了更好理解本发明技术内容，下面提供具体实施例，对本发明做进一步的说明。
17.实施例1、小豆蛋白vavpac及其编码基因与重组表达载体的获得
18.以9.0％甘露醇胁迫处理36h小豆种子为材料提取总rna，并反转录获得cdna，以该cdna为模板，在引物vavpac
‑
f1和引物vavpac
‑
r1的引导下，用常规pcr法进行扩增，反应结束后，对pcr扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，回收并纯化约1131bp的dna片段(图1)；采用lic反应将基因片段连接到载体pvx
‑
lic(在载体pvx
‑
lic的t
‑
dna片段上含有致死基因ccdb，其两侧含lic反应的识别序列。该载体为实验室自有。文献：zhao j,liu q,hu p,et al(2016)an efficient potato virus x
‑
based microrna silencing in nicotiana benthamiana.sci rep 6:20573)，获得重组载体pvx
‑
lic
‑
vavpac，经测序证实，该重组载体pvx
‑
lic
‑
vavpac为在载体pvx
‑
lic的lic1和lic2位点间插入了seq id no.2所示1131bp的dna片段(图2)。将seq id no.2所示基因命名为vavpac，该基因编码具有seq id no.1所示的由376个氨基酸组成的蛋白vavpac。
19.上述引物的序列如下：
20.vavpac
‑
f1 5
’‑
cgacgacaagaccctatggcgagtaggtactgggcag
‑3’
vavpac
‑
r1 5
’‑
gaggagaagagccctcaagcaagattgatagtga
‑3’
21.实施例2、重组根癌农杆菌的获得
22.将实施例1获得的重组载体pvx
‑
lic
‑
vavpac冻融法转化根癌农杆菌gv3101(文献：amanda m davis，anthony hall，andrew j millar，chiarina darrah and seth j davis，protocol:streamlined sub
‑
protocols for floral
‑
dip transformation and selection of transformants in arabidopsis thaliana，2009，5:310.1186/1746
‑
4811
‑5‑
3；公众可从长江大学获得)，获得含有重组载体pvx
‑
lic
‑
vavpac的根癌农杆菌gv3101，将该重组农杆菌命名为gv3101/pvx
‑
lic
‑
vavpac；
23.将空载体pvx
‑
lic通过冻融法转化根癌农杆菌gv3101，获得含有空载体pvx
‑
lic的根癌农杆菌gv3101，将该重组农杆菌命名为gv3101/pvx
‑
lic。
24.实施例3、瞬时表达转基因烟草的获得及鉴定
25.一、转基因烟草的获得
26.利用实施例2获得的两种重组农杆菌gv3101/pvx
‑
lic
‑
vavpac和gv3101/pvx
‑
lic，制备农杆菌悬菌液，悬菌液中培养液与菌体体积比为1:1。本生烟种子播种于培养基质(草炭：蛭石：珍珠岩为1:3:0.5体积比混合)中，在人工温室中培养。当烟草生长到4
‑
5叶时，开始对最顶端完全展开的新叶进行注射。用一次性注射器分别吸取1ml悬菌液，将注射器针头去掉，用手指抵住叶片下部，轻轻用力将注射器内悬菌液压送并渗透到叶片组织中，每棵烟草注射2片叶子，gv3101/pvx
‑
lic
‑
vavpac和gv3101/pvx
‑
lic分别注射5株植物。注射过的烟草植株覆盖塑料薄膜避光培养24h后移至温室中，25℃，16h光照/8h黑暗的光周期下培养。以未注射农杆菌的烟草作为野生型对照，相同生长条件培养。
27.二、转基因烟草的分子检测
28.取步骤一获得的vavpac的阳性转基因植株，转空载体植株和野生型植株，分别提取总rna，反转录获得cdna，以该cdna为模板，用特异引物vavpac
‑
f25
’‑
gtccacaactccgcatctcaac
‑3’
和下游引物vavpac
‑
r2 5
’‑
gcttcatcccaaacaaacctag
‑
3进行rt
‑
pcr扩增，以烟草actin为内参，引物为fc 5
’‑
ccctcccacatgctattct
‑3’
，rc5
’‑
agagcctccaatccagaca
‑3’
。结果如图3所示。结果表明，转空载体植株和野生型植株中不表达目的基因vavpac；而转基因vavpac植株中目的基因vavpac表达，表明获得了vavpac瞬时表达的转基因烟草株系。
29.三、转基因烟草的抗旱表型鉴定
30.取步骤一获得的转基因vavpac的烟草株系、转空载体的烟草株系和野生型株系，在注射7d后进行干旱胁迫处理，15d(土壤含水量降至7.16％)时可观察到未注射野生型植株和空载体对照植株严重萎蔫，而注射pvx
‑
lic
‑
vavpac4基因烟草抗旱性良好(见图4)。由此，vavpac基因能够显著提高烟草抗旱性，该基因可用于植物或作物抗旱育种。
31.以上所述仅为本发明的较佳实施例，但并不构成对本发明的限定，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。