一种使用转录因子ID4直接转分化包皮来源的间充质干细胞为精子的方法与流程

一种使用转录因子id4直接转分化包皮来源的间充质干细胞为精子的方法
技术领域
1.本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及一种使用转录因子id4直接转分化包皮来源的间充质干细胞为精子的方法。


背景技术：

2.不孕不育症是全球性的医学和社会问题，全球约有10％-20％的育龄夫妻罹患不孕不育症，其中男性因素又占比约50％。世界卫生组织预言不育症、癌症、心血管疾病将成为21世纪危害人类健康最严重的三大疾病。
3.目前治疗人类不孕不育症的方法是辅助生殖技术(assisted reproductive techology，art)与药物治疗和手术治疗相结合，圆了很多不孕不育夫妇成为父母的梦想。然而，很多不育症的男性患者并没能得到根本上的治疗，同时还有相当一部分不育症患者无法通过传统的药物治疗或art来解决生育问题。
4.生精障碍是引起男性不育的重要因素。其中，无精子症占男性不育原因的20％，包括梗阻性无精子症和非梗阻性无精子症。随着近年来胞质内单精子注射(icsi)技术的发展和成熟，icsi技术的临床应用越来越广泛，尤其是用于治疗严重男性不育症，包括少精症和无精子症。部分非梗阻性无精子症患者，通过显微注射术将单倍体精子细胞注射入卵细胞中，例如圆形精子细胞注射术或圆形精子细胞胞核注射术，可能获得具有父方全部遗传信息的后代。但大部分非梗阻性无精子症又称睾丸衰竭症(testicular failure)，没有精子可以回收，这种方法就受到限制，无法获得男性自体的生殖细胞，若不能提供具备受精能力的男性单倍体生殖细胞，辅助生殖技术也无法解决男性不育症患者的难题，尤其是男性需要获得自己遗传基因的后代，必须通过更科学的方式获得自体的单倍体生殖细胞。获得男性自体成体干细胞来源的男性单倍体生殖细胞，可以从根本解决这一难题。
5.目前通过胚胎干细胞分化男性单倍体生殖细胞技术不成熟，有成瘤的风险。既往有将成体干细胞分化为男性生殖细胞，但还没有利用男性自体成体干细胞的研究。


技术实现要素：

6.为了克服现有技术中的缺陷，本发明提供了一种使用转录因子id4直接转分化包皮来源的间充质干细胞为精子的方法，获得具有男性自己遗传密码、具备受精能力的生殖细胞。
7.为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
8.本发明的第一方面是提供一种使用转录因子id4直接转分化包皮来源的间充质干细胞为精子的方法，将转录因子id4通过转染的方式导入间充质干细胞，然后将间充质干细胞诱导培养为所述精子。
9.进一步地，上述转录因子id4的核苷酸序列为seq id no.1。
10.进一步地，上述转染所采用的方式为慢病毒转染、电转染或脂质体转染。
11.进一步地，上述诱导培养所采用的培养基dmem/f12作为基础的培养基，添加有fbs、谷氨酰胺、非必需氨基酸、2-β巯基乙醇、白细胞抑制因子、神经营养因子、碱性成纤维细胞生长因子、重组人干细胞因子和视黄酸。
12.进一步地，上述诱导培养所采用的培养基dmem/f12作为基础的培养基，添加15％的fbs，2mm的谷氨酰胺，0.1mm的非必需氨基酸，0.1mm的2-β巯基乙醇，10ng/ml的白细胞抑制因子，10ng/ml的神经营养因子，10ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子，10ng/ml的重组人干细胞因子以及2μm的视黄酸。
13.进一步地，将转录因子id4通过慢病毒转染的方式导入间充质干细胞，具体的步骤如下：
14.步骤一，计算每孔加入id4过表达慢病毒的添加量，然后将所述慢病毒加入含有间充质干细胞的培养基中，再添加促转染剂，进行转染；
15.步骤二，转染24-48h且细胞已较好地恢复后，去掉原培养基，换用筛选培养基进行筛选培养一段时间，获得稳定细胞株。
16.进一步地，步骤一中以moi值为5的id4过表达慢病毒转染间充质干细胞。
17.进一步地，上述筛选培养基为含6μg/ml嘌呤霉素的新鲜培养基。
18.进一步地，上述慢病毒通过三质粒慢病毒系统进行病毒包装过程，该三质粒慢病毒系统包括以下质粒：携带目的基因或shrna的载体质粒、病毒包装辅助质粒pspax2载体、病毒包装辅助质粒pmd2g载体。
19.本发明采用以上技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：
20.本发明提供的方法利用转录因子id4直接转分化从男性自体包皮培养出的间充质干细胞为男性自体的单倍体生殖细胞，获得具有男性自己遗传密码、具备受精能力的生殖细胞，为治疗生精障碍男性不育提供了一种有效的方案。
附图说明
21.图1显示了慢病毒载体(phblv-cmv-mcs-3flag-ef1-zsgreen-t2a-puro)的结构示意图；
22.图2显示了本发明一实施例中流式细胞仪检测id4慢病毒转染fsmscs的效率(总count数：5000)；98.6％的fsmscs表达zsgreen强荧光；
23.图3显示了本发明一实施例中过表达id4后稳转株细胞中id4的mrna表达水平；
24.图4显示了本发明一实施例中过表达id4的fsmscs稳转株细胞形态，其中图a显示了相同代数的fsmscs细胞形态；图b显示了过表达id4的fsmscs稳转株细胞形态；
25.图5显示了本发明一实施例中real-time qpcr法检测过表达id4的fsmscs稳转细胞经诱导培养后的8个精子发生阶段的基因(ddx4、blimp1、taf4b、magea4、sycp3、piwil2、prm1、acr)的表达变化情况；
26.图6显示了本发明一实施例中id4转分化fsmscs 30天后，单倍体细胞含量占总活细胞量数(总count数：12010)的5.52％。
具体实施方式
27.本发明提供了一种使用转录因子id4直接转分化包皮来源的间充质干细胞为精子
的方法，将转录因子id4通过转染的方式导入间充质干细胞，然后将间充质干细胞诱导培养为所述精子。
28.在本发明一优选的实施方式中，上述转录因子id4的核苷酸序列为seq id no.1。
29.在本发明一优选的实施方式中，上述转染所采用的方式为慢病毒转染、电转染或脂质体转染。
30.在本发明一优选的实施方式中，上述诱导培养所采用的培养基dmem/f12作为基础的培养基，添加有fbs、谷氨酰胺、非必需氨基酸、2-β巯基乙醇、白细胞抑制因子、神经营养因子、碱性成纤维细胞生长因子、重组人干细胞因子和视黄酸。
31.在本发明一优选的实施方式中，上述诱导培养所采用的培养基dmem/f12作为基础的培养基，添加15％的fbs，2mm的谷氨酰胺，0.1mm的非必需氨基酸，0.1mm的2-β巯基乙醇，10ng/ml的白细胞抑制因子，10ng/ml的神经营养因子，10ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子，10ng/ml的重组人干细胞因子以及2μm的视黄酸。
32.在本发明一优选的实施方式中，将转录因子id4通过慢病毒转染的方式导入间充质干细胞，具体的步骤如下：
33.步骤一，计算每孔加入id4过表达慢病毒的添加量，然后将所述慢病毒加入含有间充质干细胞的培养基中，再添加促转染剂，进行转染；
34.步骤二，转染24-48h且细胞已较好地恢复后，去掉原培养基，换用筛选培养基进行筛选培养一段时间，获得稳定细胞株。
35.在本发明一优选的实施方式中，步骤一中以moi值为5的id4过表达慢病毒转染间充质干细胞。
36.在本发明一优选的实施方式中，上述筛选培养基为含6μg/ml嘌呤霉素的新鲜培养基。
37.在本发明一优选的实施方式中，上述慢病毒通过三质粒慢病毒系统进行病毒包装过程，该三质粒慢病毒系统包括以下质粒：携带目的基因或shrna的载体质粒、病毒包装辅助质粒pspax2载体、病毒包装辅助质粒pmd2g载体。
38.下面通过具体实施例和附图对本发明进行详细和具体的介绍，以使更好的理解本发明，但是下述实施例并不限制本发明范围。
39.实施例中方法如无特殊说明的采用常规方法，使用的试剂如无特殊说明的使用常规市售试剂或按常规方法配制的试剂。
40.以下实施例中采用的试剂(和其配制方法)如下：
41.1.人id4目的基因序列信息
42.atgaaggcggtgagcccggtgcgcccctcgggccgcaaggcgccgtcgggctgcggcggcggggagctggcgctgcgctgcctggccgagcacggccacagcctgggtggctccgcagccgcggcggcggcggcggcggcagcgcgctgtaaggcggccgaggcggcggccgacgagccggcgctgtgcctgcagtgcgatatgaacgactgctatagccgcctgcggaggctggtgcccaccatcccgcccaacaagaaagtcagcaaagtggagatcctgcagcacgttatcgactacatcctggacctgcagctggcgctggagacgcacccggccctgctgaggcagccaccaccgcccgcgccgccacaccacccggccgggacctgtccagccgcgccgccgcggaccccgctcactgcgctcaacaccgacccggccggcgcggtgaacaagcagggcgacagcattctgtgccgctga(seq id no.1)。
43.2.慢病毒载体质粒
44.如图1所示，采用购买自上海汉恒生物科技有限公司的phblv-cmv-mcs-3flag-ef1-zsgreen-t2a-puro。
45.3.主要液体及其配制方法
46.(1)fsmscs诱导培养基：dmem/f12作为基础的培养基，添加15％的fbs，2mm的谷氨酰胺，0.1mm的非必需氨基酸(neaa)，0.1mm的2-β巯基乙醇，10ng/ml的白细胞抑制因子(lif)，10ng/ml的神经营养因子(gdnf)，10ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子(fgf-basic)，10ng/ml的重组人干细胞因子(scf)以及2μm的视黄酸(ra)。
47.(2)puro母液(1mg/ml)：取10mg puro粉末溶于10ml dpbs中，吹打混匀，使粉末完全融化，融化后用0.22μm滤菌器过滤除菌，以20μl/管分装，分装后做好标记，放于-20℃保存；使用时每994μl培养基加入6μl puro母液，确保其工作浓度为6μg/ml。
48.(3)1
×
tae溶液：取tris-乙酸盐、edta溶液、去离子水，配制成浓度为40mm tris-乙酸盐、2mm edta的tae溶液，室温下保存。
49.(4)lb液体培养基：在950ml去离子水中加入10g胰化蛋白胨，5g酵母提取物，10gnacl，摇动容器直至溶质溶解，再用5mol/l naoh调节ph至7.0，去离子水定容至1l，高压灭菌。
50.(5)lb固体培养基：在950ml去离子水中加入10g胰化蛋白胨，5g酵母提取物，10gnacl，摇动容器直至溶质溶解，再用5mol/l naoh调节ph至7.0.去离子水定容至1l，再加入15g琼脂粉，121℃，20min高压灭菌，冷却至50-60℃时，倒制平板，紫外下照射冷却，用封口膜封边，并倒置于4℃保存，一个月内使用。
51.(6)10％分离胶(1块胶)：取3.94ml超纯水、3.33ml 30％acr/bic、2.5ml 1.5m tris hcl(ph8.8)、100μl 10％sds、100μl 10％ap、6μl temed，溶解后混合均匀。
52.(7)5％浓缩胶(2块胶)：取4.13ml超纯水、1.0ml 30％acr/bic、0.75ml 0.5m tris hcl(ph6.8)、60μl 10％sds、60μl 10％ap、6μl temed，溶解后混合均匀。
53.(8)氨苄青霉素溶液：取0.5g氨苄青霉素钠溶于10ml水中，配成10mg/ml，用0.22μm的滤器过滤除菌，分装贮存在-20℃。
54.实施例1
55.本实施例提供一种使用转录因子id4直接转分化包皮来源的间充质干细胞为精子的方法，其包括如下步骤：
56.步骤一，lv-hid4-hygro-puro慢病毒包装、纯化：采用三质粒慢病毒系统进行病毒包装过程。三质粒慢病毒系统包括以下质粒：携带目的基因或shrna的载体质粒、病毒包装辅助质粒(pspax2载体)、病毒包装辅助质粒(pmd2g载体)。
57.1.1待293t细胞融合度达到百分之七十左右，传代293t细胞用于转染。需在前一天准备好需要转染的细胞：10cm培养皿每个皿加入1ml 0.25％edta胰蛋白酶消化，轻轻摇晃混匀，使所有细胞都接触到胰蛋白酶，后放置于37℃，二氧化碳体积分数为5％的恒温恒湿培养箱中消化2min，取出在倒置显微镜下观察，此时细胞变圆、悬浮，立即用含血清的培养基终止消化，调整细胞密度后，以适宜的细胞浓度接种在10cm细胞培养皿中，充分混匀，使细胞均匀铺在皿底，置于37℃，二氧化碳体积分数为5％的恒温恒湿培养箱中继续培养。
58.1.2转染前观察细胞密度，待293t细胞融合度达到70～80％，即可进行转染，在转染前2-4h换新鲜的细胞培养液。
59.1.3将脂质体转染试剂轻轻混匀，另取一只洁净无菌离心管，加入25μg dna及适量的dmem培养液(不含抗生素和谷氨酰胺)，移液器轻轻吹打混匀，使其终体积为100μl。
60.1.4另取一只洁净无菌离心管，加入25μl的dmem溶液(不含抗生素和谷氨酰胺)，再加入75μl转染试剂，用枪轻轻吹打混匀；使其终体积为100μl，室温，静置5min。
61.1.5将步骤1.3的dna溶液与步骤1.4的转染试剂溶液混合配制脂转293t细胞混合液，用枪轻轻吹打混匀。转染10cm培养皿的脂转混合液的成分如下(表1)。
62.表1：脂转293t细胞混合液成分
[0063][0064]
1.6将步骤1.5得到的混合溶液在室温下静置20min。若静置过程出现絮状沉淀物，是正常现象，不会影响转染效率。
[0065]
1.7把200μl lipofiter
tm-dna混合物均匀加入十二孔板的一个孔内。加入后轻轻8字摇摆混匀。
[0066]
1.8将孔板放入37℃，二氧化碳体积分数为5％的恒温恒湿培养箱中，培养16h后，去除含有lipofiter
tm-dna的培养液，更换适量新鲜培养基(含10％胎牛血清fbs)继续培养。
[0067]
1.9收病毒：转染后48h，收集病毒上清，收毒时，将10cm培养皿中的培养基用移液枪吸至50ml离心管中，注意不要接触培养皿壁，以防出现细菌污染，收集后补入10ml新鲜培养基(含10％胎牛血清)。置于37℃，二氧化碳体积分数为5％的恒温恒湿培养箱中继续培养到72h，收集转染后72h病毒上清。
[0068]
1.10超速离心：将收集到的装有病毒上清的离心管，4℃，2000g，离心10min，去除细胞碎片；取上清至新的超速离心管，将新管放置于超速离心机中，4℃，82700g，离心120min，弃上清，加入适量新鲜培养基重悬病毒沉淀，最后将超离重悬液均匀分装到已经灭菌处理的病毒管中。
[0069]
1.11病毒保存：分装病毒，做好标记(病毒名称、日期)，-80℃冰箱保存。
[0070]
步骤二，id4过表达人包皮间充质干细胞的构建
[0071]
2.1人包皮间充质干细胞准备
[0072]
[1]待fsmscs生长到融合度为80％-90％时，拿出细胞，10cm培养皿每个皿加入1ml 0.25％edta胰蛋白酶消化，轻轻摇晃混匀，使所有细胞都接触到胰蛋白酶，后放置于37℃，二氧化碳体积分数为5％的恒温恒湿培养箱中消化2min，取出在倒置显微镜下观察，此时细胞变圆、悬浮，立即用含血清的dmem/f-12培养基终止消化，用15ml离心管收集细胞悬液。
[0073]
[2]800g，离心5min，弃去上清，加新鲜培养基，轻轻吹打细胞，计数，制成浓度适宜的细胞悬液，各培养体系接种的细胞数见表2，放入37℃，5％co2培养箱中继续培养。
[0074]
2.2目的细胞慢病毒感染
[0075]
[1]计算每孔慢病毒用量(表2)。
[0076]
[2]拿出前一天铺板的fsmscs，观察细胞状态和密度，确保细胞状态良好，铺板量在30％左右，以moi值为5的id4过表达慢病毒转染fsmscs，并添加终浓度为5μg/ml促转染剂(聚凝胺)。
[0077]
[3]id4过表达慢病毒感染fsmscs 24-48h后，吸掉原培养液，换成等量新鲜的培养基。
[0078]
表2：贴壁细胞接种和病毒感染时感染液体积
[0079][0080]
2.3嘌呤霉素药物筛选
[0081]
[1]在id4过表达慢病毒感染fsmscs 48h后，去掉原培养液，用dpbs温柔地润洗两次，换用含6μg/ml嘌呤霉素的新鲜培养基对细胞进行药物筛选。
[0082]
[2]每2-3天弃去原培养基，更换新鲜的筛选培养基(含6μg/ml的puro)，确保细胞有足够的的营养，每天观察细胞状态、生长状况，若细胞大量死亡，或者细胞状态不好时，可以把puro的浓度减至2-3μg/ml，观察，当细胞状态稍恢复之后，再更换筛选浓度(6μg/ml)进行筛选，整个筛选时间在10-14d左右。
[0083]
[3]冻存id4过表达的fsmscs稳定细胞株。
[0084]
筛选10-14d后，细胞状态良好，生长速度逐渐恢复后，对稳定细胞株进行冻存。提前配制好新鲜的细胞冻存液(细胞冻存液胎牛血清(fbs)与dmso的比例为9:1)。10cm培养皿每个加入1ml 0.25％的edta胰蛋白酶进行消化，轻轻摇晃混匀，使所有细胞都接触到胰蛋白酶，后放置于37℃，二氧化碳体积分数为5％的恒温恒湿培养箱中消化2min，取出在倒置显微镜下观察，此时细胞变圆、悬浮，立即回到操作台中，加入适量新鲜培养液到培养皿中，轻轻吹打，使所有细胞均脱落，轻轻吹打，使所有细胞均脱落，混匀制成细胞悬液，计数，并离心800g，5min。去上清，加入提前配制好的细胞冻存液(细胞冻存液胎牛血清(fbs)与dmso的比例为9:1)，均匀转移到冻存管中，每管大约1ml。在冻存管上标明冻存细胞种类、细胞数量、等信息。后用程序降温盒装好，放入-80℃冰箱过夜，第二天，将冻存管取出，放入液氮内长期保存。
[0085]
步骤三，诱导培养：取出贴壁生长的id4-fsmscs稳转株，弃掉原培养液，加入新鲜的fsmscs诱导培养基继续诱导培养。
[0086]
验证实施例1
[0087]
本实施例采用实时荧光定量pcr检测不同阶段男性生殖细胞基因表达情况，具体
的实验步骤如下：
[0088]
步骤一，trizol法提取细胞总rna
[0089]
1.1试剂耗材准备：
[0090]
rnase free的ep管，rnase free的枪头，rnase free玻璃瓶(已高压灭菌)，rnase free金属器材(已高压灭菌)，氯仿，异丙醇，rnase free水，75％乙醇(无水乙醇溶解在rnase free水中)。
[0091]
1.2样品准备：
[0092]
提前培养好细胞，在显微镜下观察细胞状态良好，且细胞密度达到80-90％，吸掉原培养基，用dpbs轻轻润洗2次，10cm培养皿每个加入1ml trizol，室温，静置裂解10min；10min后用移液枪吹打，使细胞完全裂解脱落，直到培养皿中的裂解液变得清澈透明，并且不粘稠，证明此时细胞已经全部溶解。将上一步得到的细胞裂解液转移至1.5ml ep管中，再次吹打均匀，800g，离心5min，离心完之后将上清转移至新的1.5ml ep管中进行下一步的rna提取操作。
[0093]
1.3 rna抽提操作
[0094]
[1]氯仿抽提：取上述加了trizol的细胞裂解液，每ml加200μl氯仿，使劲摇管20s，室温，静置2-3min，随后4℃，12000rpm，离心15min。离心后，管内分为三层，上层无色，水相；中层相；下层鲜红色，有机相，rna存在于水相。
[0095]
[2]取水相：用移液枪小心吸取水相，转移到新管，吸大约400μl。
[0096]
[3]异丙醇沉淀：在上一步提取的水相中加入600μl的异丙醇，上下颠倒、充分混匀，室温，静置10min，于4℃，12000rpm，离心10min。离心前不可见的rna，在离心后可发现在管侧面和底部，都有形成透明、微白色的沉淀。
[0097]
[4]乙醇清洗：弃去上清，每管加入75％乙醇1ml进行洗涤，让rna沉淀漂起来，或者保持原位，切不可吹散沉淀，避免之后离心rna碎片未能聚集到一起，形成肉眼可见的沉淀，4℃，7500rpm，离心5min。
[0098]
[5]晾干沉淀、无核酸酶水溶解沉淀：尽量吸去上清，在室温下，静置干燥5-10min，直到rna沉淀呈啫喱状、微微湿润，即加入20-40μl无核酸酶水溶解rna沉淀，轻轻吹打混匀，做好标记，进行后续逆转录。切记不能完全干燥，完全干燥会大大降低rna沉淀的溶解度。若不着急逆转录，也可以置于-80℃保存。
[0099]
[6]准备2管装有1.5μl的溶有rna的溶液的ep，测rna浓度。
[0100]
步骤二，检测rna浓度、完整性
[0101]
2.1 nanodrop测浓度
[0102]
开机
→
用无核酸酶水清洗两遍
→
打开程序，选单位ng/μl
→
滴加无核酸酶水2.5μl
→
点击blank
→
移液枪滴加待测样品1μl
→
点击measure。
[0103]
2.2琼脂糖凝胶电泳
[0104]
[1]凝胶制备：取洁净烧瓶，加入100ml 1
×
tae电泳缓冲液，再称量1g琼脂糖溶解于缓冲液中，轻轻摇匀，摇匀后置于微波炉中加热，直琼脂糖完全溶解，溶解后，拿出烧瓶，加入10μl dna荧光染液，冷却到60℃。
[0105]
[2]准备好所需的模具，放入制胶板中，插入适当的样品梳，将溶解的琼脂糖(约50℃)倒入，室温冷却凝固。
[0106]
[3]待溶解的琼脂糖充分凝固后，垂直向上，小心拔出梳子，将凝胶放置在电泳槽中，后加入能覆盖凝胶1-2mm的1
×
tae电泳缓冲液。
[0107]
[4]用移液器吸取rna样品(0.5μl 5
×
loading buffer与2.5μl rna样品)，混匀后，小心加入点样孔。
[0108]
[5]打开电源开关，在100-150v的电压条件下，开始电泳，电泳时间约为30min-60min，关闭电源。
[0109]
[6]凝胶成像仪成像。
[0110]
2.3反转录成cdna
[0111]
[1]将反转录各组分取出，冰上融化，融化后按下表配制反应液。反应液配好后，轻柔混匀分装到0.2mlep管中，加入模板rna和引物(表3)。
[0112]
表3：反转录预变性组分表
[0113][0114]
[2]模板rna与引物的混合物70℃，5min预变性，完成后取出，置于冰上。
[0115]
[3]在冰上配制rt-mix(下表4)，轻柔混匀rt-mix，混匀后向每个样品管加入10μl。
[0116]
表4：反转录组分表
[0117][0118][0119]
[4]反转录程序：包括退火、延伸、逆转录酶失活三步，具体为：25℃8min
→
42℃60mim
→
70℃15min，最后温度降至4℃。
[0120]
2.4实时荧光定量pcr(rt-qpcr)
[0121]
[1]引物序列详见表5，引物干粉由上海生工有限公司合成。
[0122]
表5：real time qpcr目的基因引物序列
[0123][0124][0125]
[2]首先将pcr反应混合液配制好(如下表6)，每孔加入2μl模板。
[0126]
表6：pcr反应混合液组分表
[0127]
[0128]
[3]室温，将pcr反应混合液加入qpcr板中，吹打混匀，离心，使壁上沾到的反应液沉于反应管底部，轻轻放置于上样板上，用三步法进行pcr扩增。
[0129]
[4]数据处理分析：real time qpcr扩增结束后首先确认扩增曲线和融解曲线，融解曲线单峰，确认引物只有一个扩增产物。取各样品3个复孔的平均ct值，用gapdh的表达水平作为内参对照，用2-δδct
法计算目的基因的相对表达水平。
[0130]
验证实施例2
[0131]
本实施例采用流式细胞仪检测id4-fsmscs-30单倍体产率，具体的实验步骤如下：
[0132]
1.id4-fsmscs进行诱导培养至30天，弃去原培养基，加入新鲜培养基，并加入活细胞dna染料(hoechst)，使其终浓度为1μg/ml，置于37℃，5％co2细胞培养箱1小时。
[0133]
2.染色1小时后取出细胞，pbs清洗两次，每次5min。
[0134]
3. 0.25％胰酶消化细胞，800rcf，离心5min，用含2％fbs+dpbs的流式工作液重悬细胞并计数，将细胞分装在5ml流式管中，每管5
×
105个细胞。
[0135]
4. 800rcf，离心5min，吸掉上清。使用200μl流式工作液重悬细胞，使用bd ariaiii流式细胞仪进行细胞流式检测。
[0136]
结果
[0137]
1.流式细胞仪检测id4转染效率
[0138]
取生长状态、细胞密度均适宜的第三代fsmscs，以moi＝5的id4过表达第三代fsmscs，继续培养48小时后，以正常第三代fsmscs为对照，与对照组相比，id4-fsmscs表达强荧光，转染效率为98.6％(如图2)。
[0139]
2.rt-qpcr检测目的基因id4过表达情况
[0140]
选取目的基因id4和内参gapdh的引物，通过rt-qpcr检测moi 5的过表达id4的慢病毒感染第三代fsmscs后48h后的表达情况，结果如图3显示，慢病毒感染细胞48h后，与对照组相比，转染id4过表达慢病毒以后，id4-fsmscs的目的基因id4的mrna相对表达量显著升高，两者差异具有统计学意义(p《0.01)。这说明，id4过表达的fsmscs是构建成功的，目的基因id4在id4-fsmscs中有明显表达，id4-fsmscs相对于正常对照的表达值上调1320.917523
±
83.49887794倍。
[0141]
3.药物筛选完成后id4过表达细胞株的形态观察
[0142]
以moi 5的id4过表达慢病毒感染第三代fsmscs后48h，予嘌呤霉素(puro)6μg/ml的药筛浓度继续培养，药筛初期，细胞部分死亡，且生长速度变缓，4-5d后，细胞慢慢开始恢复增殖状态。以此药筛浓度培养10-14d，具体天数以细胞增殖速度、生长状态恢复为止。结束后予嘌呤霉素(puro)1μg/ml的维持浓度继续培养，以构建稳定表达id4的稳转细胞株。如图4所示，镜下见id4-fsmscs稳转株细胞形态变短、变宽、变扁，呈短缩形，生长相对较缓，而相同代数的fsmscs细胞呈均匀的、长的纺锤形，细胞形态饱满，生长旺盛，说明过表达转录因子id4在一定程度上改变fsmscs的形态，使细胞发生短缩改变。
[0143]
4.id4介导fsmscs转分化为男性单倍体生殖细胞关键基因表达
[0144]
id4过表达稳转细胞株构建完成后(药筛10d，实验第0天)，分别在诱导第0天、7天、14天及21天提取细胞mrna，进行rt-qpcr检测精子发生过程中阶段性表达的基因，包括原始生殖细胞(pgc)特异性标记vasa、lin28a，精原干细胞(sscs)特异性标记taf4b、megea4，减数分裂标记sycp3、piwil2，精子细胞标记prm1、acr，结果如图5所示。过表达id4后，在诱导
培养条件下，fsmscs开始阶段性表达精子发生过程中代表性基因，原始生殖细胞标记物ddx4，id4诱导分化fsmscs过程中，在0、7、14天ddx4的表达量是比较低的，在14天到21天呈现一个持续升高的状态，到第21天时，表达量上调1389.392
±
376.313倍；精原细胞标记magea4的相对表达量从第7天到第14天呈现缓慢上升，从第14天到21天其相对表达量显著上升，到第21天时，表达量上调9022.380
±
862.533倍；减数分裂标记物sycp3的相对表达量从第14天到21天显著上升，到第21天时，表达量上调64.933
±
2.028倍；piwil2的相对表达量从id4诱导分化fsmscs第14天开始呈现明显的升高，到第21天时，表达量上调59.260
±
2.272倍；精子细胞标记acr相对表达量从id4诱导分化fsmscs第14天开始呈现明显的升高，到第21天时，表达量上调32.129
±
9.533倍，结果见表7。结果显示，过表达id4可以促进fsmscs向男性生殖细胞方向分化，甚至突破减数分裂，获得男性单倍体生殖细胞，证明特异性转录因子id4在调控fsmscs向男性单倍体生殖细胞分化过程中起重要作用。
[0145]
表7：诱导后不同时间点8个精子发生特异性基因相对表达情况
[0146][0147]
5.id4介导fsmscs转分化为男性单倍体生殖细胞比例
[0148]
在id4过表达稳转细胞株构建完成后(药筛10d，实验第0天)，更换培养基为fsmscs诱导培养基，继续培养30天，在第30天对细胞用活细胞dna染料(hoechst33342)进行染色后，使用流式细胞仪进行活细胞dna含量检测，以相同代数fsmscs以及正常人精子作为对照，相同代数正常fsmscs经hoechst33342染色后，呈现二倍体、四倍体峰；正常人精子经hoechst33342染色后，呈现单倍体峰；id4诱导分化fsmscs 30天，除二倍体、四倍体峰以外，出现了明显的单倍体峰，如图6所示，且单倍体细胞数量占总活细胞数的5.52％。
[0149]
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。