一种酶活提高的丙氨酸-乙醛酸转氨酶突变体及应用

一种酶活提高的丙氨酸
‑
乙醛酸转氨酶突变体及应用
技术领域
1.一种酶活提高的丙氨酸
‑
乙醛酸转氨酶突变体及应用，属于基因工程与应用和微生物技术领域。


背景技术：

2.氨基乙酰丙酸(5
‑
aminolevulinic acid，5
‑
ala)作为一种重要的高附加值生物基化工产品，广泛应用于医药，农业，饲料等领域。目前，5
‑
ala的合成主要时化学合成法生产，但是化学合成方法成本高、污染重，限制了其在各领域的推广应用。随着生物技术的不断发展，通过构建微生物细胞工厂来发酵法合成5
‑
ala具有低成本和无污染的优势而逐渐成为研究的热点。生物体内合成5
‑
ala主要有两种途径，分别为c4途径和c5途径。其中c4途径以琥珀酰辅酶a和甘氨酸为底物，经过5
‑
ala合成酶催化直接合成5
‑
ala；而c5途径以谷氨酸为底物，通过三步催化反应得到5
‑
ala。相比于c5途径的多步酶催化反应，c4途径只涉及一步酶促反应，具有明显优势。虽然c4途径中的底物琥珀酰辅酶a为tca循环中间代谢物可以通过途径改造实现自我供给，但胞内甘氨酸合成通量不足，而且甘氨酸合成途径中关键酶的酶活力不高，现有利用c4途径合成5
‑
ala的菌株和工艺中通常需要外源添加甘氨酸，以保证5
‑
ala的过量合成和积累。
3.目前，研究者已经实现在多种宿主中合成5
‑
ala，例如，荚膜红球菌，大肠杆菌，谷氨酸棒状杆菌，枯草芽孢杆菌以及酿酒酵母等等。其中细菌体内的甘氨酸供给主要通过丝氨酸合成代谢途径产生，并伴随1碳单位的代谢。有研究者试图利用该途径，通过对5
‑
ala合成菌株代谢工程改造达到甘氨酸胞内合成和供给的目的。例如ding等在利用c4途径合成5
‑
ala的工程菌株中表达解除丝氨酸反馈抑制的sera实现甘氨酸的胞内供给，但5
‑
ala产量只比对照菌株提升14％(ding et al.j ind microbiol biotechnol,2017,44(8):1127
‑
1135)；zou等在谷氨酸棒状杆菌中打通丝氨酸合成(serabc)途径，5
‑
ala产量提高70％，进一步强化丝氨酸转化为甘氨酸的酶(glya)，5
‑
ala产量提高150％，达到了590mg/l(zou et al.biotechnology letters,2017,39(9):1369)；此外，甘氨酸也可通过乙醛酸途径产生，例如，ren等在大肠杆菌中引入外源基因acea和agxt,构建了乙醛酸途径积累了521mg/l 5
‑
ala，相比对照菌株提升了38％(ren et al.acs synth biol.2018.7.2750
‑
2757)。
4.虽然上述工作已经取得一定成效，但丝氨酸合成途径提供甘氨酸合成的代谢路径较长，反应步骤较多，已有乙醛酸途径合成甘氨酸的酶活较低。以上基因工程操作能够增加工程菌株积累5
‑
ala，但其最终的产量依然很低，无法满足工业化规模的生产应用。
5.本领域仍需要酶活更高的酶来催化合成甘氨酸，进一步优化构建合成5
‑
ala工程菌株，从而能够实现高效率、低成本合成5
‑
ala。


技术实现要素：

6.本发明提供了一种酶活提高的丙氨酸
‑
乙醛酸转氨酶突变体及其应用。
7.技术方案如下：
8.一种酶活提高的丙氨酸
‑
乙醛酸转氨酶突变体；突变是核酸序列为seq id no.3和编码突变氨基酸序列为seq id no.4的丙氨酸
‑
乙醛酸转氨酶突变体。
9.所述的突变体是将出发核酸序列为seq id no.1和氨基酸序列为seq id no.2的丙氨酸
‑
乙醛酸转氨酶的第20位异亮氨酸，第124位组氨酸，第142甘氨酸，第196,201天冬氨酸，第231色氨酸，第256天冬酰胺，第341为天冬酰胺，第360位精氨酸，第391位赖氨酸分别突变为苏氨酸，精氨酸，色氨酸，酪氨酸，甘氨酸，半胱氨酸，亮氨酸，甘氨酸，半胱氨酸，谷氨酸；同时在第84位半胱氨酸、第207位丝氨酸、第217位苏氨酸、第293位赖氨酸发生同义突变到得突变的核酸序列为seq id no.3编码突变氨基酸序列为seq id no.4的丙氨酸
‑
乙醛酸转氨酶。
10.本发明的酶活提高的丙氨酸
‑
乙醛酸转氨酶突变体应用提高5
‑
氨基乙酰丙酸的产率。
11.具体说明如下：
12.本发明的一种酶活提高的丙氨酸
‑
乙醛酸转氨酶突变体,通过将出发核酸序列为seq id no.1和氨基酸序列为seq id no.2所述丙氨酸
‑
乙醛酸转氨酶，将其第20位异亮氨酸，第124位组氨酸，第142甘氨酸，第196,201天冬氨酸，第231色氨酸，第256天冬酰胺，第341为天冬酰胺，第360位精氨酸，第391位赖氨酸分别突变为苏氨酸，精氨酸，色氨酸，酪氨酸，甘氨酸，半胱氨酸，亮氨酸，甘氨酸，半胱氨酸，谷氨酸；同时在第84位半胱氨酸、第207位丝氨酸、第217位苏氨酸、第293位赖氨酸发生同义突变到得突变的核酸序列为seq id no.3编码突变氨基酸序列为seq id no.4的丙氨酸
‑
乙醛酸转氨酶突变体。
13.本发明的一种酶活提高的丙氨酸
‑
乙醛酸转氨酶突变体，丙氨酸
‑
乙醛酸转氨酶的来源为人源(homo sapiens)。
14.本发明的一种酶活提高的丙氨酸
‑
乙醛酸转氨酶突变体，丙氨酸
‑
乙醛酸转氨酶突变体的基因序列为seq id no.3和氨基酸序列为seq id no.4。
15.本发明的提供了携带上所述基因的重组质粒，重组质粒的构建方法为：先根据确定的突变序列，通过生物公司合成的方式将带有突变位点的基因序列合成在puc18质粒上(来源为addgene(https://www.addgene.org/))；然后将突变的基因序列构建到表达载体上得到重组质粒。
16.本发明提供了重组质粒的构建方案，包括如下过程：
17.获得agxt
m
片段：以seq id no.5所示agxt
‑
f和以seq id no.6所示agxt
‑
r为引物，以seq id no.12所示puc18
‑
agxt
m
为模板，通过pcr的方法，得到以seq id no.2所示agxt
m
片段；
18.获得pzy48片段：以seq id no.7所示pzy48
‑
f和以seq id no.8所示pzy48
‑
r为引物，以seq id no.13所示质粒pzy48为模板(来源为addgene(https://www.addgene.org/))，通过pcr扩增，得到以seq id no.3所示pzy48片段；
19.构建pzy48
‑
agxt
m
质粒：将与上述步骤获得的agxt
m
和pzy48片段通过cpec的方法连接得到质粒命名为pzy48
‑
agxt
m
，以seq id no.9所示；
20.携带丙氨酸
‑
乙醛酸转氨酶突变基因或突变酶的宿主细胞大肠杆菌mg1655
‑
pzy48
‑
agxt
m
的构建：
21.将携带丙氨酸
‑
乙醛酸转氨酶突变基因或突变酶的重组质粒pzy48
‑
agxt
m
转化至
大肠杆菌e.coli mg1655感受态细胞中，得到菌株mg1655
‑
pzy48
‑
agxt
m
。
22.工程大肠杆菌mg1655
‑
haam的构建：将pzy48
‑
agxt
m
质粒与以seq id no.9所示puc18
‑
hema
‑
acea质粒(来源于kunqiang hong et al.,(2021).development and characterization of a glycine biosensor system for fine
‑
tuned metabolic regulation in escherichia coli,journal of agricultural and food chemistry,under reviewer.)共转入大肠杆菌e.coli mg1655中，得到菌株得到菌株mg1655
‑
pzy48
‑
agxt
m
‑
puc18
‑
hema
‑
acea(菌株名称简称为mg1655
‑
haam)。
23.本发明提供了上述携带权丙氨酸
‑
乙醛酸转氨酶突变体或重组质粒的宿主细胞大肠杆菌mg1655
‑
pzy48
‑
agxtm。
24.本发明提供了上述丙氨酸
‑
乙醛酸转氨酶突变体或基因或重组质粒或宿主细胞mg1655
‑
haam在制备5
‑
氨基乙酰丙酸方面的应用。
25.本发明的有益效果为：
26.(1)本发明的突变体是通过将出发核酸序列为seq id no.1和氨基酸序列为seq id no.2所述丙氨酸
‑
乙醛酸转氨酶，将其第20位异亮氨酸，第124位组氨酸，第142甘氨酸，第196,201天冬氨酸，第231色氨酸，第256天冬酰胺，第341为天冬酰胺，第360位精氨酸，第391位赖氨酸分别突变为苏氨酸，精氨酸，色氨酸，酪氨酸，甘氨酸，半胱氨酸，亮氨酸，甘氨酸，半胱氨酸，谷氨酸；同时在第84位半胱氨酸、第207位丝氨酸、第217位苏氨酸、第293位赖氨酸发生同义突变到得突变的核酸序列为seq id no.3和突变氨基酸序列为seq id no.4的丙氨酸
‑
乙醛酸转氨酶突变体。此突变的酶活可达298.98mmol min
‑1od
600
‑1ml
‑1，比野生型提高了73％；
27.(2)将次突变体用于大肠杆菌mg1655生产5
‑
氨基乙酰丙酸产量为69.64mg l
‑1,比对照提高了25％。
附图说明
28.图1为seq id no.9所示pzy8
‑
agxt
m
质粒的示意图；
29.图2为seq id no.10所示puc18
‑
hema
‑
acea质粒的示意图；
30.图3为工程大肠杆菌mg1655
‑
haam的5
‑
ala产量示意图。
具体实施方式
31.本发明通过下述实施例进一步阐明，但任何实施例或其组合不应当理解为对本发明的范围或实施方式的限制。除非另有说明，所有技术和科学术语都具有本领域所知的常见含义。所有专利、专利申请、公开出版物、序列、以及其他公开材料均援引加入本文，除非另有说明。
32.下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
33.下面结合实施例对本发明做进一步说明，下述实施例是为了使本领域的技术人员能够更好地理解本发明，但对本发明不作任何限制。
34.本发明所用到的原始菌株e.coli mg1655为通用菌株。
35.原始质粒puc18和pzy48来源为addgene(https://www.addgene.org/)。
36.本发明所用到的质粒puc18
‑
hema
‑
acea来源于kunqiang hong et al.,(2021).development and characterization of a glycine biosensor system for fine
‑
tuned metabolic regulation in escherichia coli,journal of agricultural and food chemistry,under reviewer.)。
37.所用限制性内切酶、dna聚合酶等分子生物学试剂购买自thermo公司(http://www.thermoscientificbio.com/fermentas)。
38.所用pcr仪,电转仪和细胞破碎仪购自bio
‑
rad(http://www.bio
‑
rad.com/)。
39.所用其他生化试剂从生工生物工程(上海)股份有限公司(http://www.sangon.com/)购买。
40.lb固体培养基(蛋白胨10g/l，酵母抽提物5g/l，氯化钠10g/l，琼脂2％)余量是水。
41.lb液体培养基(蛋白胨10g/l，酵母抽提物5g/l，氯化钠10g/l)余量是水。
42.丙氨酸
‑
乙醛酸转氨酶酶活测定方法：
43.以丙氨酸和乙醛酸为底物，通过hplc法测定催化反应中生成的丙酮酸的量；
44.其中酶活测定体系：10mm丙氨酸,10mm乙醛酸,1mm plp(磷酸吡多醛),50mm磷酸盐缓冲液(ph 7.0),和适量体积的酶液，37℃，220rpm震荡反应2
‑
6h，反应完成后，取反应液以hplc测定催化反应中生成的丙酮酸的量.
45.hplc方法：使用安捷伦(agilent
‑
1100)高效液相色谱仪对取样反应液中的组分进行测定。丙酮酸浓度测定采用伯乐(biorad)公司的aminex hpx
–
87h有机酸分析柱。
46.一个单位丙氨酸
‑
乙醛酸氨基转移酶活性定义：从每od
600
菌液提取的每毫升酶液每分钟催化底物产生丙酮酸(mmol)的量。
[0047]5‑
氨基乙酰丙酸的测定方法：采用modified ehrlich’s reagent方法(feng ll,et al.(2016).biotechnol bioeng 113(6):1284
‑
1293.)检测。
[0048]
实施例1
[0049]
pzy48
‑
agxt
m
质粒的构建：
[0050]
获得agxt
m
片段：以seq id no.5所示agxt
‑
f和以seq id no.6所示agxt
‑
r为引物，以seq id no.12所示puc18
‑
agxt
m
为模板，通过pcr的方法，得到以seq id no.3所示agxt
m
片段；
[0051]
获得pzy48片段：以seq id no.7所示pzy48
‑
f和以seq id no.8所示pzy48
‑
r为引物，以质粒pzy48为模板(来源为addgene(https://www.addgene.org/))，通过pcr扩增，得到以seq id no.13所示pzy48片段；
[0052]
构建pzy48
‑
agxt
m
质粒：将与上述步骤获得的agxt
m
和pzy48片段通过cpec方法(quan,j.,&tian,j..(2014).methods in molecular biology,1116,103.)连接得到质粒命名为pzy48
‑
agxt
m
，以seq id no.9所示，质粒示意图为图1；
[0053]
携带丙氨酸
‑
乙醛酸转氨酶突变基因或突变酶的宿主细胞大肠杆菌mg1655
‑
pzy48
‑
agxt
m
及其对照菌株mg1655
‑
pzy48
‑
agxt的构建：
[0054]
将携带丙氨酸
‑
乙醛酸转氨酶突变基因或突变酶的重组质粒pzy48
‑
agxt
m
及其对照质粒pzy48
‑
agxt(以seq id no.11所示)转化至大肠杆菌e.coli mg1655感受态细胞中，得到菌株mg1655
‑
pzy48
‑
agxt
m
和mg1655
‑
pzy48
‑
agxt,其中对照质粒pzy48
‑
agxt或对照菌株mg1655
‑
pzy48
‑
agxt携带野生型丙氨酸
‑
乙醛酸转氨酶基因(以seq id no.1所示)或酶
(以seq id no.2所示)。
[0055]
工程大肠杆菌菌株mg1655
‑
haam及其对照菌株mg1655
‑
haa的构建：
[0056]
将pzy48
‑
agxt
m
和pzy48
‑
agxt质粒与以seq id no.10所示puc18
‑
hema
‑
acea质粒(如图2所示)分别共转入大肠杆菌e.coli mg1655中，得到菌株mg1655
‑
pzy48
‑
agxt
m
‑
puc18
‑
hema
‑
acea(菌株名称简称为mg1655
‑
haam)及其对照菌株mg1655
‑
pzy48
‑
agxt
‑
puc18
‑
hema
‑
acea(菌株名称简称为mg1655
‑
haa)。
[0057]
实施例2
[0058]
丙氨酸
‑
乙醛酸转氨酶酶活测定：
[0059]
取对照菌株mg1655
‑
pzy48
‑
agxt和mg1655
‑
pzy48
‑
agxt
m
单克隆菌株至新鲜的lb液体培养基中，在37℃，220rpm的条件下培养至od
600
为0.6时停止培养。取8ml的菌液在12000rpm，4℃离心5min，将细胞沉淀重悬用等体积的50mm磷酸钾缓冲液(ph 7.0)悬浮，并使用超声均化器(vc130pb，sonics&materials，inc.，newtown，conn)破碎细胞。破碎的混合液以12000rpm和4℃离心10分钟，使用上清液用于酶活性试验。通过丙氨酸和乙醛酸形成丙酮酸的浓度来测定转氨酶活性。反应体系：10mm丙氨酸，10mm乙醛酸，1mm吡哆醛
‑
5'
‑
磷酸盐，50mm磷酸钾(ph7.0)以及适量的酶，反应在30℃条件下进行2
‑
6小时，然后使用hplc定量。一个单位丙氨酸
‑
乙醛酸氨基转移酶活性定义为从每od
600
菌液提取的每毫升酶液每分钟催化底物产生丙酮酸(mmol)的量。
[0060]
实施例3
[0061]
丙氨酸
‑
乙醛酸转氨酶突变体的应用：
[0062]
将携带有丙氨酸
‑
乙醛酸转氨酶突变体的pzy48
‑
agxt
m
及其对照质粒pzy48
‑
agxt与以seq id no.9所示puc18
‑
hema
‑
acea质粒分别共转入大肠杆菌e.coli mg1655中，得到菌株mg1655
‑
haam及其对照菌株mg1655
‑
haa，进行5
‑
ala发酵，具体步骤如下：
[0063]
(1)活化菌株：将权利要求10携带有丙氨酸
‑
乙醛酸转氨酶突变体菌株mg1655
‑
haam及其对照菌株mg1655
‑
haa在lb固体培养基中划线，37℃培养10
‑
20h，使菌株复壮；
[0064]
(2)种子液的培养：将步骤(1)获得的活化菌接种到lb液体培养基中，37℃，220rpm培养10
‑
20h，然后将所得菌液按初始od
600
＝0.02的接种量接种到新鲜的lb培养基，37℃，220rpm培养10
‑
20h，得到种子液；
[0065]
(3)5
‑
ala发酵：将步骤(2)所获得的种子液按初始od
600
＝0.02接种到装有50ml新鲜的lb培养基的500ml厌氧瓶中，加入氨苄青霉素，使浓度为100μg/l，在37℃，转速220rpm的条件下至发酵液中的5
‑
ala产量不再增加时停止发酵；在发酵过程中，间隔12h取一次样，分别测定发酵液中的5
‑
ala浓度，并记录。
[0066]
(4)5
‑
ala检测：将发酵液12000rpm离心10min除去固体杂质，将上清液按照一定的比例稀释。取稀释液250μl，先后加入125μl的乙酸钠缓冲液(量取5.7ml的冰乙酸、称取8.2g无水乙酸钠，加水定容至100ml)和62.5μl的乙酰丙酮，100℃反应15min。冷却至室温，加入modified ehrlich's reagent试剂(分别取1ml的双蒸水，0.2g对一二甲基苯甲醛，1ml高氯酸，加8ml冰乙酸，定容到10ml)440μl反应20min，然后测量反应液在554nm下的吸光度，根据标准曲线计算出5
‑
ala的浓度。标准曲线的绘制：取1g/l的5
‑
ala母液，然后梯度稀释，根据上述方法测量其在554nm下的吸光度。以5
‑
ala浓度(mg/l)为横坐标，以od
554
值为纵坐标，绘制5
‑
ala的标准曲线。
[0067]
发酵结果为：经过24h发酵，携带有丙氨酸
‑
乙醛酸转氨酶突变体菌株mg1655
‑
haam的5
‑
ala产量最高，为69.64mg/l，相比于对照菌株提升了25％，如图3所示。
[0068]
本发明公开和提出的技术方案，本领域技术人员可通过借鉴本文内容，适当改变条件路线等环节实现，尽管本发明的方法和制备技术已通过较佳实施例子进行了描述，相关技术人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和技术路线进行改动或重新组合，来实现最终的制备技术。特别需要指出的是，所有相类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，他们都被视为包括在本发明精神、范围和内容中。本发明未尽事宜属于公知技术。