一种提高芒柄花素产量的蒙古沙冬青毛状根系的诱导和培养方法

1.本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种提高芒柄花素产量的蒙古沙冬青毛状根系的诱导和培养方法。


背景技术：

2.沙冬青(ammopiptantus mongolicus(maxim.ex kon)chengf.)又名蒙古沙冬青、大沙冬青，属于豆科蝶形花亚科沙冬青属，是我国荒漠地区唯一的超旱生常绿阔叶灌木树种，被国家列入第1批珍稀濒危保护植物名录。据《中药辞海》、《全国中草药汇编》、《内蒙古植物药志》中记载，沙冬青是传统的民族药材(蒙药)，名“孟和哈日嘎讷”，其枝叶可入药，具有祛风湿、活血、散瘀、止痛的功效，外用还能治疗冻疮、尤其用于治疗风湿性关节炎疾病效果显著。研究表明，沙冬青的乙醇提取物具有良好的体内降血糖活性，从沙冬青种子中提取出抗癌物质ja1对小鼠肿瘤、人肝癌细胞具有明显抑制作用，沙冬青茎秆提取物可以抑制小菜蛾幼虫生长，沙冬青地上部水提物1g/l及以上都对松材线虫具有很好的杀虫效果。沙冬青的化学成分相对比较复杂，从沙冬青中分离提取的化合物主要有生物碱类、黄酮及异黄酮类、有机酸、二苯乙烯类、甾醇及单萜类等，具有抗肿瘤、抗病毒、杀菌、抗氧化、杀虫等作用功效。但是由于沙冬青自然条件下生长缓慢，幼苗存活率很低，缺乏自然更新能力，移植苗根再生力又弱，又由于人为放牧及樵砍破坏，使得这一珍贵荒漠树种日渐稀少，难以发挥其优势。因而，无论从保护濒危物种而言，还是从进一步发掘该物种宝贵资源而言，深入系统地对沙冬青进行种质资源保育扩繁及创新、次生代谢产物开发利用、功能基因挖掘、蛋白组及代谢组等研究势在必行。
3.毛状根(hairy root)，是由发根农杆菌(agrobacterium rhizogenes)侵染植物植株或某一器官、组织产生大量毛状根的表现型。毛状根体系具有激素自养、遗传稳定强、生长速度快以及次生代谢合成能力强等特点，是生产药用植物次生代谢产物的一条有效途径，并为实现次生代谢产物的工业化生产提供了可能；另外，毛状根具备自主生长的特性，还可以诱导为再生植株，能够在后代再生中保持遗传稳定，为分子改良育种提供支持。通常亲本植株能合成的次生代谢物均可利用毛状根来生产，且次生代谢产物的产量往往高于植物自身所能合成的量。利用毛状根生物反应器生产活性物质的方法即可不占用土地又可保护野生资源，是濒危资源可持续发展的有效途径。
4.发根农杆菌是一种寄主非常广泛的土壤细菌，能够侵染几乎所有的双子叶植物和少数的单子叶植物。发根农杆菌的ri质粒被广泛的应用于植物基因工程、植物次生代谢产物的生产、植物品种改良和植物的栽培中。其转化植物产生的毛状根有如下优点：1)毛状根具有生长迅速，激素自主性，2)可以方便的转入外源基因，3)ri质粒转化的植物的毛状根分化正常植株的频率高，倍性稳定，容易建成系列，4)无性系拥有亲本特征次级代谢途径，且次生代谢产物的生产能力高、含量稳定，5)毛状根来源于一个单细胞，为优良系的筛选提供了极大的方便。
5.目前，毛状根的诱导和培养方法在很多植物中都进行了研究，例如发明专利(cn201910261837.4)公开了一种温山药转基因毛状根的诱导方法，该方法中采用了常规的农杆菌活化方法，建立了温山药转基因毛状根诱导体系，实现了温山药的快速有效繁殖。尤其是在药用植物中，毛状根的诱导和培养方法研究更广泛，例如专利一种黄连毛状根的高效诱导方法(cn109511553a)公开了一种黄连毛状根的高效诱导方法，首次建立了黄连毛状根的高效诱导体系，毛状根诱导率高达88.7％，为药用次生代谢产物的提供便利。然而，现阶段国内外学者对沙冬青的研究主要集中于化学成分及药理活性，例如发明专利(cn201711297833.9)提供了一种沙冬青组培苗的繁殖方法，所述的方法从无菌苗上采集外植体进行组培苗的繁殖，具有操作简单，用时短，污染率为零，出苗率高等优点。对于沙冬青毛状根的诱导和培养方法并没有相关的研究，更没有对毛状根培养过程中的菌株活化方法的相关报道。
6.本发明提供了一种提高芒柄花素产量的蒙古沙冬青毛状根系的诱导和培养方法，发明人意外的发现，在蒙古沙冬青毛状根诱导和培养过程中，使用本发明所述的诱导剂对发根农杆菌进行二次活化，利用活化后的发根农杆菌诱导毛状根，得到的蒙古沙冬青毛状根生产芒柄花素的产量显著提高，是一种非常有效的获得蒙古沙冬青芒柄花素的生物生产方法，更可以使濒危资源蒙古沙冬青得到保护。


技术实现要素：

7.针对上述技术问题，本发明提供了一种提高芒柄花素产量的蒙古沙冬青毛状根系的诱导和培养方法，所述的培养方法包括如下步骤：
8.(1)获取蒙古沙冬青外植体：挑选蒙古沙冬青种子，表面消毒处理，将消毒后的种子置于萌发培养基获取无菌幼苗，依据试验选取不同外植体部位用于后续毛状根诱导实验；
9.(2)农杆菌选择与活化：选择农杆菌菌株，从培养平板上挑取单克隆，置于5ml含有相应抗菌素lb液体培养基中，28℃、200r/min振荡培养20h；吸取上述菌液5ml接种于50ml lb液体培养基中进行扩增培养，28℃、240r/min振荡培养使菌液od
600
约1.5；
10.(3)农杆菌的二次活化：步骤(2)得到的农杆菌菌液，5000
×
g离心10min，收集菌体，用诱导剂重悬稀释菌体，使所得侵染菌液od
600
＝0.4-1.0间适宜侵染浓度，用诱导剂二次活化10-40min，得到侵染液；
11.(4)农杆菌侵染外植体：处理蒙古沙冬青外植体，利用步骤(3)得到的侵染液侵染处理后的蒙古沙冬青外植体；
12.(5)毛状根诱导和繁殖：将侵染后的外植体置于促进剂中共培养3-5d；置于含抗菌素的生长培养基12-18d可有毛状根发出；
13.(6)扩大培养：待蒙古沙冬青毛状根长1-3cm时从外植体上切下，置于固体1/2ms培养基离体复壮生长，长至4-5cm将毛状根置于液体b5培养基中离体扩大培养；
14.步骤(3)所述的诱导剂为含100μmol/l-500μmol/l乙酰丁香酮的液体1/2ms培养基，所述的液体1/2ms培养基中蔗糖质量分数5％；步骤(4)所述的侵染外植体的时间为10-30min；步骤(5)所述的促进剂为含有100μmol/l-500μmol/l乙酰丁香酮的固体1/2ms培养基，所述的固体1/2ms培养基中蔗糖质量分数5％。
15.优选的，步骤(3)所述的诱导剂为含300μmol/l乙酰丁香酮的液体1/2ms培养基，所述的液体1/2ms培养基中蔗糖质量分数5％。
16.优选的，步骤(5)所述的促进剂为含100μmol/l乙酰丁香酮的固体1/2ms培养基，所述的固体1/2ms培养基中蔗糖质量分数5％。
17.优选的，步骤(5)所述的将侵染后的外植体置于促进剂中共培养4d；置于含抗菌素的生长培养基12-14d可有毛状根发出；
18.优选的，步骤(1)所述的蒙古沙冬青外植体包括上胚轴、下胚轴、子叶、真叶、茎和根。
19.优选的，步骤(1)所述的蒙古沙冬青外植体为子叶。
20.优选的，步骤(4)所述的侵染外植体的时间为15min。
21.优选的，步骤(4)所述的处理蒙古沙冬青外植体的方法包括：在外植体表面扎孔，划线和切断。
22.优选的，所述的在外植体表面扎孔包括扎通外植体的孔和不扎通外植体的孔两种。
23.优选的，所述的在外植体表面扎孔为不扎通外植体。
24.优选的，步骤(2)所述的农杆菌为农杆菌a4、农杆菌c58c1、农杆菌atcc15834、农杆菌k599、农杆菌lba9402、农杆菌r1601的任一种。
25.优选的，步骤(2)所述的农杆菌为农杆菌a4。
26.优选的，10.所述的提高芒柄花素产量的蒙古沙冬青毛状根系的诱导和培养方法在制备蒙古沙冬青芒柄花素中的应用。
27.本发明的有益效果是：
①
本发明提供了一种新的诱导剂，所述的诱导剂为含100μmol/l-500μmol/l乙酰丁香酮的液体1/2ms培养基，所述的液体1/2ms培养基中蔗糖质量分数5％，用于农杆菌的二次活化；
②
本发明提供了一种新的蒙古沙冬青毛状根系的诱导和培养方法，相较于传统的毛状根诱导和培养方法，所述的方法新增了诱导剂二次活化菌株；
③
本发明提供了提高芒柄花素产量的蒙古沙冬青毛状根系的诱导和培养方法，通过所述的方法，可获得高产芒柄花素的毛状根；
④
所述的方法通过发根农杆菌菌株侵染蒙古沙冬青，诱发毛状根组织生长，建立离体毛状根培养系统，利用毛状根组织旺盛的生长力及其对次生代谢产物高效的生物合成能力，促使蒙古沙冬青芒柄花素含量得到显著提升，较野生植株提高了14倍；
⑤
本发明所述的蒙古沙冬青毛状根具有生长快速，周期短，不受季节限制，次级代谢产物相对产量高等优点，可用于工业化生产蒙古沙冬青芒柄花素。为将来利用毛状根工业化生产蒙古沙冬青次级代谢产物提供了可用途径，另一方面有利于对该濒危资源植物的保护与可持续利用。
附图说明
28.图1蒙古沙冬青无菌苗
29.图2蒙古沙冬青外植体诱导及生长
30.b：蒙古沙冬青子叶外植体
31.c：蒙古沙冬青毛状根诱导
32.d：蒙古沙冬青毛状根伸长生长
33.图3蒙古沙冬青毛状根生长过程
34.e：蒙古沙冬青毛状根离体复壮培养
35.f：蒙古沙冬青毛状根离体增殖生长
36.g：增殖生长60d蒙古沙冬青毛状根组织
具体实施方式
37.下面结合具体的实施例对本发明的技术方案进行详细的说明，但是应当说明的是，本发明的保护范围并不限于以下实施例。本发明以下实施例中，使用的培养基包括1/2ms培养基和b5培养基，均是本领域技术人员常规使用的培养基，在本实验中，上述培养基是发明人从试剂公司购买所得。
38.本发明以下实施例中，菌株来源分别是：
39.农杆菌a4：购自中国农业微生物菌种保藏管理中心，自编号accc10060
40.农杆菌atcc15834：购自美国模式培养物集存库
41.农杆菌c58c1：浙江中医药大学开国银教授实验室保存
42.农杆菌k599：本实验室保存
43.农杆菌lba9402：本实验室保存
44.农杆菌r1601：本实验室保存
45.本发明以下实施例中，所使用的试剂来源公开如下：
46.乙酰丁香酮：购自sigma公司
47.应理解，上述简述和下文的详述为示例性且仅用于解释，而不对本文发明主题做任何限制。
48.芒柄花素为黄酮类化合物，在黄芪、鸡血藤等多种植物中存在。芒柄花素具有抗癌的作用，可以用来防治乳腺癌、前列腺以及结肠癌。专家认为芒柄花素能够降低老年晚期肺癌患者胸水和血清中基质金属蛋白酶、内皮抑素、碱性成纤维细胞生长因子等指标和肿瘤标志物水平，有很明显的临床效果。同时可以改善患者的生存质量，对于临床治疗老年晚期肺癌具有重要的意义。
49.本发明所述的“在外植体表面扎孔”是指：使用尖锐部件例如针，刀等，在外植体的表面扎细小的孔；
50.本发明所述的“扎通外植体的孔”是指尖锐部件伸入到外植体中并将外植体贯穿。
51.本发明所述的“不扎通外植体的孔”是指尖锐部件伸入到外植体内部，但不贯穿外植体。
52.本发明所述的“划线”是指在外植体表面划线。
53.本发明所述的“切断”是指将外植体切断成细小的段。
54.本发明所述的“褐化”是指在植物组织培养中，外植体诱导初分化或再分化过程中，自身组织从表面向培养基释放褐色物质以至培养基逐渐变成褐色，外植体也随之进一步变褐而死亡的现象。
55.实施例一、一种提高芒柄花素产量的蒙古沙冬青毛状根系的诱导和培养方法
56.1.实验方法
57.(1)获取蒙古沙冬青外植体：挑选饱满、大小一致的蒙古沙冬青种子，表面消毒处
理。将消毒后的种子置于萌发培养基获取无菌幼苗，如图1所示，依据试验选取上胚轴、下胚轴、子叶、真叶、茎和根六种不同外植体部位用于后续毛状根诱导实验；
58.(2)农杆菌选择与活化：选择农杆菌菌株，从培养平板上挑取单克隆，置于5ml含有相应抗菌素lb液体培养基中，28℃、200r/min振荡培养20h；吸取上述菌液5ml接种于50ml lb液体培养基中进行扩增培养，28℃、240r/min振荡培养使菌液od
600
约1.5；
59.所述的农杆菌为农杆菌a4、农杆菌c58c1、农杆菌atcc15834、农杆菌k599、农杆菌lba9402和农杆菌r1601。
60.所述的农杆菌a4置于lb液体培养基中活化时，需要在lb液体培养基中添加50μg/ml硫酸卡那霉素kan；所述的农杆菌r1601置于lb液体培养基中活化时，需要在lb液体培养基中添加50μg/ml硫酸卡那霉素kan；所述的农杆菌atcc15834置于lb液体培养基中活化时，需要在lb液体培养基中添加20μg/ml利福平rif；所述的农杆菌k599置于lb液体培养基中活化时，需要在lb液体培养基中添加50μg/ml链霉素strep。
61.(3)农杆菌的二次活化：步骤(2)得到的农杆菌菌液，5000
×
g离心10min，收集菌体，用诱导剂重悬稀释菌体，使所得侵染菌液od
600
＝0.4-1.0间适宜侵染浓度，用诱导剂二次活化10-40min，得到侵染液；
62.所述的诱导剂为含100μmol/l-500μmol/l乙酰丁香酮的液体1/2ms培养基，所述的液体1/2ms培养基中蔗糖质量分数5％；
63.优选的，步骤(3)所述的诱导剂为含300μmol/l乙酰丁香酮的液体1/2ms培养基，所述的液体1/2ms培养基中蔗糖质量分数5％。
64.(4)农杆菌侵染外植体：处理蒙古沙冬青外植体，利用步骤(3)得到的侵染液侵染处理后的蒙古沙冬青外植体；
65.所述的侵染外植体的时间为10-30min；所述的处理蒙古沙冬青外植体的方法包括：在外植体表面扎贯通外植体的孔，扎不贯通外植体的孔，划线和切断。
66.(5)毛状根诱导和繁殖：将侵染后的外植体置于促进剂中共培养4d；置于含抗菌素的生长培养基约15d左右可有毛状根发出；如图2所示；
67.所述的促进剂为含有100μmol/l-500μmol/l乙酰丁香酮的固体1/2ms培养基，所述的固体1/2ms培养基中蔗糖质量分数5％。
68.优选的，步骤(5)所述的促进剂为含100μmol/l乙酰丁香酮的固体1/2ms培养基，所述的固体1/2ms培养基中蔗糖质量分数5％。
69.(6)扩大培养：待蒙古沙冬青毛状根长约2cm时从外植体上切下，置于固体1/2ms培养基离体复壮生长，长至4cm左右将毛状根置于液体b5培养基中离体扩大培养，如图3所示。2.实验数据的处理及结果分析
70.(1)农杆菌菌株筛选
71.上述方法选用农杆菌a4、农杆菌atcc15834、农杆菌c58c1、农杆菌k599、农杆菌lba9402、农杆菌r1601六种常用的菌株，分别以不同侵染浓度对蒙古沙冬青不同外植体部位进行侵染诱导。
72.实验结果显示，不同农杆菌株诱导蒙古沙冬青毛状根组织的敏感性为：农杆菌a4》农杆菌c58c1》农杆菌atcc15834》农杆菌k599，农杆菌r1601与农杆菌lba9402不能成功诱导。a4菌株诱导效果最好，od
600
在0.6～0.7时，蒙古沙冬青毛状根诱导率可达68.2％，毛状
根增殖系数为7.74，相较于其他农杆菌菌株具有显著性。同时，本方法选用蒙古沙冬青无菌苗上胚轴、下胚轴、子叶、真叶、茎和根六种不同外植体部位作为受体组织。实验结果显示，不同蒙古沙冬青外植体组织的敏感性为：子叶》真叶》茎，上、下胚轴和根组织易褐化不能成功诱导。具体结果如表1所示。
73.表1农杆菌菌株及浓度对蒙古沙冬青毛状根诱导影响
[0074][0075]
表中数据说明：诱导率％(上)和增殖系数(下)
[0076]
表中数据后带有不同小写字母表示在0.05水平差异显著
[0077]
(2)外植体处理方式对蒙古沙冬青毛状根诱导的作用分析
[0078]
选用蒙古沙冬青子叶作为外植体，采用不同的处理方式处理，包括扎孔(扎通和不通两种)，划线，切段等，观察毛状根的诱导率。实验结果显示，在子叶外植体上表面(近轴面)扎一定数量的小孔，且不扎通，有利于诱导出毛状根，可将毛状根诱导率提高2倍多，相较于其他组具有显著性。具体如表2所示。
[0079]
表2外植体处理方式对蒙古沙冬青毛状根诱导影响
[0080][0081]
表中数据后带有不同小写字母表示在0.05水平差异显著
[0082]
(3)促进剂的浓度以及诱导剂的浓度和作用时间对毛状根的影响
[0083]
侵染前需用含有不同浓度乙酰丁香酮的诱导剂二次活化农杆菌菌株30min，并用含有不同浓度的乙酰丁香酮的促进剂共培养，统计不同组毛状根的诱导率和增殖系数。
[0084]
实验结果显示，含有乙酰丁香酮的诱导剂对毛状根的诱导率和增殖系数均显著上升，但与乙酰丁香酮的浓度不相关，含有300μmol/l乙酰丁香酮的诱导剂的诱导率最高可达到63％；在不使用诱导剂的情况下，含有乙酰丁香酮的促进剂对毛状根的诱导率和增殖系数均没有显著变化，但是，使用诱导剂后，使用促进剂能够显著提升毛状根的诱导率和增殖系数。其中，诱导剂中含有300μmol/l乙酰丁香酮，促进剂中含有100μmol/l乙酰丁香酮，得到的蒙古沙冬青毛状根的诱导率和增值系数均最高。具体结果如表3所示。
[0085]
表3含有不同浓度乙酰丁香酮的诱导剂和促进剂对蒙古沙冬青毛状根的影响
[0086][0087][0088]
表中数据说明：诱导率％(上)和增殖系数(下)
[0089]
表中数据后带有不同小写字母表示在0.05水平差异显著
[0090]
根据上述实验结果，选择含300μmol/l乙酰丁香酮的液体1/2ms(蔗糖质量分数5％)作为诱导剂，在不同诱导时间下观察蒙古沙冬青毛状根的生长情况。
[0091]
实验结果显示，在0-30min内，诱导剂对毛状根的诱导率随着时间的增加而上升，超过30min后，诱导剂对毛状根的诱导率下降。在30min时，诱导率最高，为68.15％，增殖系数为7.74，相较于其他活化时间具有显著性差异。具体结果如表4所示。
[0092]
表4诱导剂的诱导时间对蒙古沙冬青毛状根诱导影响
[0093][0094]
表中数据后带有不同小写字母表示在0.05水平差异显著
[0095]
(4)蒙古沙冬青毛状根离体增殖培养方法对毛状根的影响
[0096]
蒙古沙冬青毛状根离体增殖生长：以有利于蒙古沙冬青生长的1/2ms和b5培养基的固体、液体培养方式做比较。待在1/2ms固体培养基上离体复壮生长的蒙古沙冬青毛状根长至4cm左右长，将其置于不同培养条件进行离体增殖培养60d，发现液体培养方式非常有利于蒙古沙冬青毛状根生物量的增殖，是固体培养方式的4.5倍以上，具有显著性差异；b5培养基更有利于蒙古沙冬青毛状根增殖，是1/2ms培养基的1.55倍，具有显著性差异。
[0097]
表5培养方式对蒙古沙冬青毛状根离体扩繁影响
[0098][0099][0100]
表中数据后带有不同小写字母表示在0.05水平差异显著
[0101]
(5)蒙古沙冬青毛状根中芒柄花素含量分析
[0102]
将上述方法得到的蒙古沙冬青毛状根与野外成株(来自内蒙古阿拉善、呼和都呼木和磴口地区)地上药用部分进行醇提得到粗提物，hplc分析检测其主要药用成分芒柄花素的含量。发现上述方法诱导所获毛状根可显著提升蒙古沙冬青芒柄花素含量，生长60d的含量显著高于野外多年生植株。
[0103]
表6蒙古沙冬青芒柄花素在毛状根及野生植株中的含量
[0104][0105]
表中数据后带有不同小写字母表示在0.05水平差异显著
[0106]
综上所述，本发明提供了提高芒柄花素产量的蒙古沙冬青毛状根系的诱导和培养方法，通过所述的方法，可获得高产芒柄花素的毛状根；本发明提供了一种新的诱导剂，所述的诱导剂为含100μmol/l-500μmol/l乙酰丁香酮的液体1/2ms培养基，所述的液体1/2ms培养基中蔗糖质量分数5％，用于将农杆菌进行二次活化；本发明提供了一种新的蒙古沙冬青毛状根系的诱导和培养方法，相较于传统的毛状根诱导和培养方法，所述的方法新增了诱导剂二次活化菌株；所述的方法通过发根农杆菌菌株侵染蒙古沙冬青，诱发毛状根组织生长，建立离体毛状根培养系统，利用毛状根组织旺盛的生长力及其对次生代谢产物高效的生物合成能力，促使蒙古沙冬青芒柄花素含量得到显著提升，较野生植株提高了14倍；本发明所述的蒙古沙冬青毛状根具有生长快速，周期短，不受季节限制，次级代谢产物相对产量高等优点，可用于工业化生产蒙古沙冬青芒柄花素。为将来利用毛状根工业化生产蒙古沙冬青次级代谢产物提供了可用途径，另一方面有利于对该濒危资源植物的保护与可持续利用。