Prelp作为银屑病诊断标志及治疗靶点的应用

prelp作为银屑病诊断标志及治疗靶点的应用
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，涉及prelp基因的应用。具体地说，涉及prelp基因作为银屑病标志物及治疗靶点的应用，以及其在制备银屑病诊断及预后评估试剂或试剂盒中的应用。


背景技术：

2.银屑病是一种常见的由免疫介导的皮肤病，全球发病率约1.9%。银屑病不仅会影响患者的身体健康，而且干扰患者的生活水平，心理健康。银屑病的发生与遗传背景，环境因素和免疫应答异常有关，最终导致角质形成细胞异常的增殖或关节滑膜细胞与软骨细胞的炎症反应。在银屑病的发病机制中，th细胞被认为是关键的致病因子，其中cd4+t细胞产生ifn
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γ，il
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2等细胞因子与疾病的严重程度相关。il
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23/th17轴中，il
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17，il
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22，il
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23，tnf
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α等也是影响银屑病的关键分子，其中il
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17是一种中心促炎分子，il
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17激活角质形成细胞表达细胞因子包括il
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6，il
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8等，趋化因子包括cxcl1，cxcl2，ccl20等。il
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17a还能诱导β防御素，s100a家族的抗菌肽表达，从而激活固有免疫系统。il
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17a可以诱导角质形成细胞的增殖，在il
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17a敲除的小鼠中，表皮几乎不增殖。另外血清中il
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17的水平和银屑病严重程度相关。
3.银屑病的诊断包括皮肤镜，皮肤超声和病理诊断等，k16，ki67，s100a7/8是常见的诊断标志物，然而这些分子仍缺乏特异性，因此有必要探索银屑病其他的诊断标志。银屑病的治疗包括局部用药如糖皮质激素，维a酸类药物等；系统药物如甲氨蝶呤，环孢素，生物制剂等；物理治疗如uva,uvb等。近年来，生物治疗取得了较大进展，一系列针对特异性靶点的生物制剂和小分子药物被研发出来，显示出了良好的疗效。目前针对银屑病的生物制剂主要是tnf
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α抑制剂，il12/il23抑制剂和il
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17a抑制剂。由于银屑病具有病程长，易复发的特点，目前的治疗方式仍不能解决上述问题，同时许多治疗方式有较大的副作用，因此探究银屑病其他方面的发病机制，寻找更有效的治疗靶点至关重要。
4.prelp(proline/arginine
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rich end leucine
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rich repeat protein)属于小亮氨酸富集蛋白聚糖家族，以往的研究表明它可以与基底膜上的ⅰ型胶原和软骨上的ⅱ型胶原结合，在破骨细胞的形成，呼吸道细菌感染和肝细胞癌中发挥作用。然而其在银屑病中的作用尚缺乏研究，深入探讨其在银屑病中的作用机制或许对银屑病的诊断和治疗至关重要。


技术实现要素：

5.针对上述问题，本发明的目的在于提供一种新的潜在的银屑病诊断和治疗的靶点
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prelp：在三种针对il
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17a的生物制剂治疗银屑病后，prelp的表达明显增加；prelp在银屑病患者的皮损中明显低于非皮损处；prelp抑制il
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17诱导的角质形成细胞的增殖。
6.为了实现上述目的，本发明提供了如下技术方案。
7.本发明提供了prelp基因的表达水平的检测试剂在制备用于银屑病辅助诊断试剂
盒中的应用。
8.进一步地，所述试剂盒通过逆转录pcr、实时定量pcr检测样本中prelp基因的表达水平。
9.优选地，所述试剂盒中含有扩增prelp基因的特异性引物。
10.更优选地，扩增prelp基因的特异性引物序列如seqid no.1和seq id no.2所示。
11.优选地，所述所述样本为组织或细胞。
12.进一步地，所述prelp基因在银屑病样本中表达下调。
13.本发明还提供了 prelp基因过表达试剂在制备用于治疗银屑病的药物中的应用。
14.进一步地，所述prelp基因过表达试剂包括prelp过表达质粒。
15.本发明还提供了prelp基因过表达试剂在制备抑制il
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17诱导细胞增殖的试剂中的应用。
16.进一步地，prelp基因过表达试剂包括prelp过表达质粒。
17.与现有技术相比本发明的有益效果。
18.本发明首次发现prelp与银屑病发生的相关性，并通过检测银屑病人皮肤和构建的细胞系中的prelp的表达，可以检测银屑病的发生，因此，prelp可作为银屑病发生或发展的特异性的生物标志物；同时将prelp作为靶标对银屑病的治疗具有很好的效果，对银屑病的治疗提供了新的靶标。
附图说明
19.图一为geo数据集中prelp在转录水平的表达。**代表p值<0.01,****代表p值<0.0001。
20.图二为prelp免疫组化结果图。*代表p值<0.05。
21.图三为prelp在咪喹莫特诱导的小鼠皮肤中的pcr验证。
22.图四为prelp在hacat细胞中的表达结果。
23.图五为prelp在hacat细胞中过表达的构建和prelp对细胞增殖的影响。
具体实施方式
24.下为了能够更清楚地理解本发明的上述目的、特征和优点，下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是，本发明还可以采用不同于在此描述的其他方式来实施，因此，本发明并不限于下面公开说明书的具体实施例的限制。
25.实施例1。
26.1. 实验方法。
27.数据集：检索geo数据库中secukinumab，ixekizumab和brodalumab治疗银屑病的数据集，分别是gse137218，gse31652和gse117468对治疗前后的样本中prelp的表达进行分析。对gse117468数据集中皮损处和非皮损的prelp表达进行分析。
28.临床样本：收集2018年
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2020年期间在中国医科大学附属第一医院接受皮肤病理检查并且病理诊断为银屑病的样本，另外收集正常人的皮肤样本作为对照。组织标本通过甲醛固定后石蜡包埋。
29.细胞及小鼠：人角质形成细胞系hacat培养在含有10％胎牛血清(gibco，ny，usa)的dmem(invitrogen，carlsbad，ca，usa)培养基中，添加100u/ml青霉素和100μg/ml链霉素(gibco，ny，usa)。在37℃含有5％co2的环境中培养细胞。10ng/ml il
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17（mce,china）用于刺激细胞。c57/bl6小鼠（长生生物，china）用咪喹莫特乳膏处理背部皮肤，对照组小鼠用凡士林处理，七天后取小鼠皮肤，提取rna。
30.免疫组化：切片进行梯度脱蜡，柠檬酸盐 ph6.0 用于修复抗原。将载玻片与prelp抗体（1:100 稀释，zen
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bio,china）在4℃下孵育过夜。然后使用elivision super kit（中国迈新）进行免疫染色。
31.rna提取及荧光定量pcr：用mirneasy mini kit（qiagen，germany）收集mrna，然后通过nd1000nanometer测量。使用goscript逆转录试剂盒（promega，usa）合成cdna。然后通过rtsybr green qpcr mastermix（promega，usa）进行rt
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pcr，然后用7900ht fast real
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time pcr system（美国applied biosystems）检测，反应条件设为95℃ 2min，95℃延长15 s和60℃ 1min为40个循环，然后计算每个pcr产物的熔解曲线以确认合成特异性。
32.引物序列如下：人prelp sense seqid no.1：aggtgcatcacctggatcat；anti
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sense seqid no.2：cgggtcttggtcgtcttgtt；小鼠prelp sense seqid no.3：ccagaacttctagctggctct； anti
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sense seqid no.4：ggttttggtcttgtcggttgg。
33.免疫印迹：细胞用冷pbs洗涤两次，然后使用ripa（beytotime，china）和1mm pmsf、1*蛋白酶抑制剂混合物（beytotime，china）和 1*蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物（beytotime，china）在冰上裂解10分钟，收集样本4℃ 15000rpm离心15min，收集上清液备用。bca protein assay kit(beytotime,china)测蛋白浓度。30ug蛋白与5*sds buffer(beytotime,china)混合后，99℃煮沸10分钟。样品用于蛋白质印迹分析。
34.免疫荧光：细胞接种于24孔板，4%多聚甲醛固定液（beyotime,china）固定细胞，1%bsa和0.1%triton
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x100（beyotime,china）封闭。然后一抗孵育4℃过夜。使用抗兔fluro 488二抗，在荧光显微镜下观察。
35.转染：lipofectamine 3000(thermo,usa)按照说明书转染dna质粒(genechem,shanghai,china)。6孔板质粒用量为2ug。
36.cck8：细胞接种于96孔板，刺激后加入10ul细胞计数试剂（beyotime，china），2小时后，450nm检测。
37.统计分析：使用graphpad prism 7.0软件分析及作图，根据情况采用配对t检验或wilcoxon符号秩检验进行统计学分析。数据至少重复三次，p＜0.05被认为有统计学意义。
38.2. 实验结果。
39.如图一所示，prelp在三种靶向il
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17a药物治疗后，表达均明显升高，而在银屑病患者中，prelp在皮损中的表达明显低于非皮损处。
40.如图二所示，在银屑病组织中对上述数据集的结果进行验证，prelp在银屑病皮损中的表达低于正常人。
41.如图三所示，在咪喹莫特诱导的银屑病小鼠模型的皮损中，prelp的表达低于对照组。
42.如图四所示，il
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17刺激后，hacat细胞中的prelp表达下调。
43.如图五所示，成功构建了prelp过表达的hacat细胞系，prelp抑制il
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17诱导的hacat细胞的增殖。
44.上述结果表明prelp是il
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17a抗体治疗银屑病的潜在靶点，prelp在治疗后明显升高；体外实验证实了prelp抑制il
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17诱导的角质形成细胞的增殖，因此prelp有望成为辅助il
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17a抗体治疗银屑病的靶点。prelp在银屑病皮损处的表达明显低于非皮损处，且在银屑病患者皮肤中的表达低于正常人皮肤；在咪喹莫特诱导的小鼠银屑病模型中，prelp的表达低于正常对照组；在il
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17刺激的hacat细胞中，prelp的表达低于对照组，因此prelp有望成为银屑病诊断的靶点。