一种抗HLA-G1、HLA-G4及HLA-G5异构体分子的单克隆抗体及其用途的制作方法

本发明属于生物医药领域，涉及抗hla-g异构体抗体(ywhg-4)的以下方面：采用hla-g分子重链第106～126位氨基酸序列的抗原肽(rgyynqseasshtlqwmigc) 为免疫原，制备抗hla-g异构体hla-g1、hla-g4及hla-g5的抗体(ywhg-4)；编码本发明所述ywhg-4抗体的核酸分子及氨基酸序列，以及所述抗体(ywhg-4)用于hla-g1、hla-g4及hla-g5免疫印迹、免疫组化、elisa及流式细胞术等检测的用途。

背景技术：

1、人类白细胞抗原-g(human leukocyte antigen-g,hla-g)基因，全长6.0kb，位于人类第6号染色体短臂远侧6p21.3。在蛋白质翻译过程中，hla-g mrna第 1外显子编码信号肽，第2、3和第4外显子分别编码细胞外区的α1、α2和α3 结构域，第5位外显子编码跨膜区；第6外显子编码仅含6个氨基酸残基的hla-g 分子胞内段；由于外显子6内含有终止密码子，第7外显子不被转录；第8外显子对应于hla-g基因的3′utr。hla-g初始转录产物经选择性剪接，可产生7 种成熟mrna，分别编码7种不同分子量的异构体分子(hla-g1、-g2、-g3、-g4、 -g5、-g6及hla-g7)。其中hla-g1、hla-g2、hla-g3及hla-g4含有跨细胞膜区，为膜结合型异构体；hla-g5、hla-g6及hla-g7缺乏跨细胞膜结构，为可溶性异构体。hla-g1～-g7异构体分子的分子量分别为39kd,31kd,22kd,30kd, 34kd,23kd及16kd。

2、hla-g1是由全长hla-g mrna编码，由胞外区α1、α2及α3结构域，跨膜区及胞内结构域组成。hla-g2缺乏α2结构域，由胞外区α1及α3结构域，跨膜区及胞内结构域组成；hla-g3缺乏α2和α3结构域，由胞外区α1结构域，跨膜区及胞内结构域组成；hla-g4缺乏α3结构域，由胞外区α1及α2结构域，跨膜区及胞内结构域组成；hla-g5及hla-g6胞外区结构域分别与hla-g1及 hla-g2相同，但它们由含有内含子4的hla-g mrna编码，因内含子4中含有终止密码子，所编码的蛋白分子缺乏由外显子5所编码的跨膜区，形成可溶性hla-g 分子。编码hla-g7的mrna由于内含子2中含有终止密码子，胞外区仅含α1结构域及由内含子2所编码的2个氨基酸残基相连(图1)。

3、在正常生理情况下，hla-g分子仅表达在母胎界面的绒毛外滋养层细胞，维持妊娠过程中的母胎免疫耐受。病理情况下，hla-g分子能在肿瘤细胞及病毒感染等病理组织细胞中诱导性表达，与疾病的发生及进展密切相关。hla-g分子是体内一个重要的免疫致耐分子，也是一种重要的免疫检查点分子，其免疫抑制功能主要通过结合免疫抑制性受体免疫球蛋白样转录物-2(immunoglobulin-like transcript-2,ilt2/lilrb1/cd85j)、免疫球蛋白样转录物-4 (ilt4/lilrb2/cd85d),传递抑制信号，诱导免疫耐受。具体作用机制有：①与表达在t细胞、nk细胞和b细胞上的ilt2结合，抑制t细胞和nk细胞免疫杀伤活性，及b细胞增殖和抗体分泌等功能。②与树突状细胞(dc)上的ilt2、 ilt4结合，抑制dc细胞的成熟和分化，诱导产生耐受性dc细胞。③与骨髓来源抑制性细胞(mdsc)和巨噬细胞(mф)上的ilt2、ilt4结合，诱导促炎抗肿瘤的m1向免疫致耐性m2细胞分化等。因此，hla-g在肿瘤等疾病的发生发展中起到重要作用。基于hla-g为靶点的肿瘤免疫治疗已在美国进入i期临床试验。

4、hla-g与受体ilt2、ilt4结合，具有分子结构特异性。受体ilt2、ilt4与 hla-g结合的位点hla-g胞外区α3结构域。ilt2仅结合hla-g/β2m复合物，而 ilt4不仅可以与hla-g/β2m结合，同时可以与不含β2m的游离hla-g分子结合。由于hla-g1、-g2、-g3、-g4、-g5、-g6及hla-g7在表达机制及分子结构上存在差异，如hla-g3、-g4、及hla-g7异构体胞外区不含α3结构域，不能与ilt2 和ilt4结合。不同hla-g异构体分子可在病理生理过程中发挥特定的免疫学效应。在不同病理状态下，尤其在肿瘤组织细胞中，hla-g异构体表达存在广泛的异质性，不同hla-g分子异构体的表达具有特定的临床意义。因此，分析特定 hla-g异构体分子表达及不同hla-g异构体分子表达谱，对于阐述特定hla-g异构体分子的生物学功能及其临床意义具有重要意义。

5、目前国内外用于hla-g免疫组化和免疫印迹的抗体主要有4h84，mem-g1， mem-g2，2a12及5a6g7。其中抗体4h84，其识别位点位于7种hla-g异构体分子均具有的胞外区α1结构域，特异性上能够检测目前已知的含有α1结构域的7 种hla-g异构体分子(hla-g1，hla-g2，hla-g3，hla-g4，hla-g5，hla-g6及hla-g7)，但在免疫组化中不能区分具体特定hla-g异构体分子的表达。抗体 mem-g1及mem-g2由全长hla-g重链免疫小鼠得到，具体识别位点无法预测，这两种抗体理论上，与抗体4h84相似，能够识别7种hla-g异构体分子(hla-g1， hla-g2，hla-g3，hla-g4，hla-g5，hla-g6及hla-g7)，但同样不能区分具体特定hla-g异构体分子的表达。抗体2a12及5a6g7，由位于hla-g5和hla-g6 分子羧基端22个氨基酸残基免疫小鼠获得，能够识别hla-g5和hla-g6分子。但抗体2a12及5a6g7同时还可以识别其他分子量在36-175kda范围内的未知的其他非hla-g5和hla-g6分子，在免疫组化的应用上可能存在交叉反应，出现假阳性，不能正确hla-g5和hla-g6分子表达。用于流式细胞术检测hla-g分子的单抗有87g及mem-g/9，但只能检测hla-g1及hla-g5分子。

6、因此，在靶向精准医疗的背景下，现有的检测hla-g分子的抗体不都是尽如人意，迫切需要开发更多针对不同hla-g异构体分子的单克隆抗体。

技术实现思路

1、鉴于现有hla-g抗体存在上述不足，本发明的目的是提供一种抗hla-g1、 hla-g4及hla-g5异构体分子的特异性单克隆抗体(ywhg-4)、编码本发明所述抗体(ywhg-4)的核酸分子及氨基酸序列；以及所述ywhg-4抗体用于hla-g1、hla-g4 及hla-g5免疫组化、免疫印迹及流式检测等用途。

2、本发明采用hla-g分子重链第106-126位氨基酸序列的抗原肽第为免疫原，其氨基酸序列为seq id no.23所示氨基酸序列(rgyynqseasshtlqwmigc)。rgyynqseasshtlqwmigc肽段位于hla-g1、hla-g4及hla-g5异构体分子共同含有的α1及α2铰链区，并基于此制备抗hla-g1、hla-g4及hla-g5异构体分子的特异性单克隆抗体(ywhg-4)(图1)。

3、根据发明人的研究成果，本发明提供了一种抗hla-g异构体分子hla-g1、 hla-g4及hla-g5的单克隆抗体(ywhg-4)，至少包括重链高变区cdr1、cdr2和cdr3 中的一种或多种，或/和轻链高变区cdr1、cdr2和cdr3中的一种或多种；

4、所述单克隆抗体(ywhg-4)抗体轻链的氨基酸序列如seq id no.1所示或经替换、缺失或添加一个或多个氨基酸形成的与seqid no.1所示序列具有同等功能的氨基酸序列；所述抗体轻链高变区cdr1的氨基酸序列为seq id no.2所示的序列qsivhsngnty或经替换、缺失或添加一个或多个氨基酸形成的与seq id no.2 所示的序列具有同等功能的氨基酸序列；所述轻链高变区cdr2的氨基酸序列为 seq id no.3所示的序列kvs或经替换、缺失或添加一个或多个氨基酸形成的与 seq id no.3所示的序列具有同等功能的氨基酸序列，和所述轻链高变区cdr3 的氨基酸序列为seq id no.4所示的序列fqashvpyt或经替换、缺失或添加一个或多个氨基酸形成的与seq id no.4所示的序列具有同等功能的氨基酸序列；

5、所述单克隆抗体(ywhg-4)抗体重链的核苷酸序列如seq id no.5所示或经替换、缺失或添加一个或多个氨基酸形成的与seq id no.5所示序列具有同等功能的氨基酸序列；所述抗体重链高变区cdr1的氨基酸序列为seq id no.6所示的序列gyastnyl或经替换、缺失或添加一个或多个氨基酸形成的与seq id no.6所示的序列具有同等功能的氨基酸序列，所述重链高变区cdr2的氨基酸序列为seq id no.7所示的序列inpgsgri或经替换、缺失或添加一个或多个氨基酸形成的与 seq id no.7所示序列具有同等功能的氨基酸序列，和所述重链高变区cdr3的氨基酸序列为seq id no.8所示的序列arhygnsawfay或经替换、缺失或添加一个或多个氨基酸形成的与seq id no.8所示的序列具有同等功能的氨基酸序列。

6、进一步地，所述单克隆抗体(ywhg-4)还包括轻链框架区(framework region， fr)和重链框架区；其中，所述轻链框架区包括轻链fr1、fr2和fr3中的一种或多种，所述轻链fr1的氨基酸序列为seq id no.9所示的序列 gdivitqdelslpvslgdqaaiscrs或该序列经替换、缺失或添加一个或多个氨基酸形成的与seq id no.9所示序列具有同等功能的氨基酸序列；所述轻链fr2的氨基酸序列为seq id no.10所示的序列lewylqkpgqspklliy或经替换、缺失或添加一个或多个氨基酸形成的与seq id no.10所示序列具有同等功能的氨基酸序列；所述轻链fr3的氨基酸序列为seq id no.11所示的序列nrfsgvpdrfrgsgsgtdftlkisrveaedlgvyyc或经替换、缺失或添加一个或多个氨基酸形成的与 seq idno.11所示序列具有同等功能的氨基酸序列；所述重链框架区包括重链 fr1、fr2和fr3中的一种或多种，其中：所述重链fr1的氨基酸序列为seq id no.12 所示的序列vqlqqsgaevvrpgtsvkvsckas或经替换、缺失或添加一个或多个氨基酸形成的与seq idno.12所示序列具有同等功能的氨基酸序列；所述重链fr2的氨基酸序列为seq id no.13所示的序列vewikqrpgqglewigv或经替换、缺失或添加一个或多个氨基酸形成的具有与seqid no.13所示序列同等功能的氨基酸序列；所述重链fr3的氨基酸序列为seq id no.14所示的序列yysekfkgkttltadksssn aymqlssltsddsavyfc或经替换、缺失或添加一个或多个氨基酸形成的与seq id no.14所示序列具有同等功能的氨基酸序列。

7、进一步地，所述单克隆抗体(ywhg-4)中编码轻链可变区的核苷酸序列为seq idno.15所示的序列或该序列经替换、缺失或添加一个或多个核苷酸形成的与 seq id no.15所示序列具有同等功能的核苷酸序列，所述单克隆抗体(ywhg-4) 中编码重链可变区的核苷酸序列为seq id no.16所示的序列或该序列经替换、缺失或添加一个或多个核苷酸形成的与seq id no.16所示序列具有同等功能的核苷酸序列。

8、根据本发明的一个方面，本发明提供了一种优选的抗hla-g异构体hla-g1、 hla-g4及hla-g5分子的单克隆抗体(ywhg-4)，所述单克隆抗体(ywhg-4)由保藏编号为cctccno:2021204的杂交瘤产生，保藏机构为：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉，保藏时间为2021年8月11日。

9、本发明还提供了所述抗hla-g1、hla-g4及hla-g5异构体分子抗体(ywhg-4) 用于hla-g异构体hla-g1、hla-g4及hla-g5分子免疫组化、免疫印迹及流式细胞术等检测的用途，具有特异性高，亲和力强等特点。

10、为更清楚了解本技术的发明构思和技术方案，下文将通过具体实施例和附图进一步解释本技术，其中关于实施方式中的技术方案仅是优选的实施方式，不应被解释为限制本技术的范围。对于本领域技术人员来说，在不脱离本技术的技术原理的前提下，还可以做出若干改进和调整，这些改进和调整也应视为落入本技术的保护范围之中。

11、除非另有定义，本文使用的所有科技术语应视为具有本领域普通技术人员所理解的相同含义。氨基酸残基的缩写是本领域中所用的指代20个常用氨基酸的标准3字母和/或1字母代码。

12、本发明中提及的轻链高变区或重链高变区，其中“高变区”又被称之为互补决定区(complementarity determining region，cdr)。

13、本发明中提及的“序列”可以指包含某些生物学功能等同的氨基酸序列或“保守性替代”，“其它序列”可以包含功能非等同的氨基酸或“非保守性替代”，其经基因工程改造以改进cdr或含cdr抗体的特性。在不实质性地影响抗体活性的前提下，本领域技术人员可以对本技术中的序列进行操作，即替换、添加和/或缺失一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或多个)氨基酸，以获得所述抗体或其功能性片段序列的变体。它们应被视为包括在本技术保护的范围内。例如，在可变区将具有类似性质的氨基酸进行替换。本发明中提及的变体的序列可以与其来源序列有至少有95％、96％、97％、98％或99％的一致性。序列一致性可以使用序列分析软件测量。例如使用缺省参数的计算机程序blast，尤其是blastp或tblastn。本文所述的多种氨基酸序列详见序列表。