工程化细胞外囊泡及其应用的制作方法

本发明涉及生物医药领域，尤其涉及一种工程化细胞外囊泡、制备方法及其应用。

背景技术：

1、细胞外囊泡(extracellular vesicle,ev)是由细胞分泌的，能够被受体细胞摄取的膜性囊泡小体，直径大约为30-1000nm。ev作为蛋白质、rna、脂质等生物大分子在细胞间转运的载体，是细胞与细胞间通讯的重要媒介。因ev广泛存在于人体的各种体液中，既可以作为液体活检的样本来源，也被认为是一种天然驯化的药物载体。

2、在ev的研究与应用中，如何制备具有特定功能的ev是一项关键技术环节。以开发药物载体为例，为提高ev的组织靶向性，需要在其表面高表达与目的细胞具有高亲和力的靶向分子。又或者需要将具有治疗效果的多肽、蛋白质载带到ev中。对ev体外诊断试剂盒的开发而言，则需要获得装载有特定待测物分子的ev作为标准品。

3、根据已有的报道，目前有约20种蛋白被报道可用于目的蛋白在ev中的装载(theranostics,2019；9(4):1015-1028)。wo2013084000a2、wo2014168548a2、wo2018015535a1、wo2019040920a1等专利申请也描述了将蛋白质成分装载到ev的方法。

技术实现思路

1、本技术的发明人在研究中意外发现一类细胞外囊泡(ev)支架蛋白，这些支架蛋白在自然分泌的细胞外囊泡中本底表达很低，但这些蛋白在ev的构建、目的蛋白的展示、药物装载等方面表现出意想不到的优异效果。基于以上发现，发明人完成本发明。

2、在第一个方面，本发明提供一种工程化细胞外囊泡(extracellular vesicle,ev)，其包含作为支架蛋白的跨膜蛋白，所述跨膜蛋白为免疫球蛋白超家族成员，所述跨膜蛋白在未工程化的细胞外囊泡中的本底表达水平低。

3、在本发明的一些实施方案中，所述跨膜蛋白在未工程化的细胞外囊泡中的本底表达水平低于cd81的本底表达水平，例如，所述低于cd81的本底表达水平是指在对所述未工程化细胞外囊泡总蛋白的质谱检测中，将cd81的ibaq数值设为1，所述跨膜蛋白的ibaq数值与所述cd81的ibaq数值之比小于0.5、0.4、0.3、0.2、0.1、0.09、0.08、0.07、0.06、0.05、0.04、0.03、0.02或0.01。

4、在本发明的一些实施方案中，其中所述跨膜蛋白满足以下至少一个条件：

5、(a)所述跨膜蛋白与bcam具有相似性，所述相似性是指当以bcam蛋白作为标准时，所述跨膜蛋白与bcam相比的e value<＝1.0e-4，所述e value通过公式(i)计算，所述公式(i)来源于ncbi blast程序，

6、e＝k*m*n*exp(-lambda*s)    (i)

7、其中，k和lambda是与数据库和算法有关的常量，m代表目标序列的长度，n代表数据库的大小，s值表示两序列的同源性，s分值越高表明它们之间的同源性越大；

8、(b)所述跨膜蛋白为单次跨膜蛋白，所述单次跨膜蛋白的胞外区包含1、2、3、4、5、6、7、8、或9个免疫球蛋白结构域(immunoglobulin domain,ig domain)；和

9、(c)所述跨膜蛋白的胞外区同时包含igv结构域和igc结构域。

10、在本发明的一些实施方案中，所述跨膜蛋白满足选自以下的组合：a和b、a和c、b和c、以及a和b和c。

11、在本发明的一些实施方案中，所述跨膜蛋白选自bcam、mcam、icam5、alcam、cd276、cadm1、vcam1、cadm2、nectin4、cadm4、cadm3、ager、cd96，以及其变体。

12、在本发明的一些实施方案中，所述跨膜蛋白的胞外区包含3、4或5个免疫球蛋白结构域，

13、特别地，所述跨膜蛋白的胞外区同时包含igv结构域和igc结构域，

14、更特别地，所述igc结构域为igc2结构域，

15、更特别地，所述跨膜蛋白的胞外区包含5个免疫球蛋白结构域，所述5个免疫球蛋白结构域从n端到c端依次为2个igv结构域和3个igc结构域。

16、在本发明的一些实施方案中，所述跨膜蛋白选自bcam、mcam、alcam、cd276、cadm1、cadm2、nectin4、cadm4、cadm3、ager、cd96，以及其变体；

17、特别地，所述跨膜蛋白选自bcam、mcam、alcam、cadm1、cadm2、cadm4、cadm3、ager，以及其变体；

18、更特别地，所述跨膜蛋白选自bcam、mcam、alcam，以及其变体。

19、在本发明的一些实施方案中，所述单次跨膜蛋白是包含目的多肽区段的融合蛋白；优选地，所述目的多肽区段位于所述融合蛋白的n端或c端；优选地，所述目的多肽区段使得该融合蛋白具有治疗、靶向和/或亲和标签功能。

20、在本发明的一些实施方案中，所述目的多肽区段是治疗性多肽区段，例如，所述治疗性多肽区段为人白细胞介素家族成员(例如，il-2,il-7,il-10,il-11,il-12,il-15和il-23)，肿瘤坏死因子家族成员(例如，tnf,lta,ltb,faslg,tnfsf8,tnfsf9,tnfsf10,tnfsf11,tnfsf12,tnfsf13,tnfsf14,tnfsf15,tnfsf18和eda)，干扰素(inf-α,inf-β和inf-γ)，t cell engager(例如，4-1bb,ox40,cd28,cd40,cd40l,cd47,cd27,cd70,cd80,cd86,gitrl,icosl,cd155,cd112,tim-3,btla)，其他细胞因子(例如，g-csf,epo,tpo,gm-csf,egf,bfgf,fviia,atⅲ,tnk,α-glucosidase,bmp-2,hirudin)。

21、在本发明的一些实施方案中，所述目的多肽区段是靶向细胞的多肽区段，特别地，所述靶向细胞的多肽区段选自抗体或其抗原结合片段、细胞表面受体或配体

22、在本发明的一些实施方案中，所述目的多肽区段是亲和标签，特别地，所述亲和标签选自his标签、谷胱甘肽巯基转移酶(gst)、s-肽、zz结构域、白蛋白结合结构域(abd)、ha、myc、flagtm、麦芽糖结合蛋白(mbp)、钙调蛋白结合肽(cbp)、sumo、链球菌蛋白g(proteing)和金葡菌蛋白a(protein a)。

23、在本发明的一些实施方案中，所述细胞外囊泡内包含治疗剂；特别地，所述治疗剂选自治疗性多肽、多核苷酸和小分子化合物。

24、在第二个方面，本发明提供一种药物组合物，其包含所述的细胞外囊泡和药学上可接受的载体。

25、在第三个方面，本发明提供一种工程化细胞，其用于生产所述的细胞外囊泡。

26、在第四个方面，本发明提供一种治疗疾病的方法，其包括向有此需要的对象施用所述的细胞外囊泡、所述的药物组合物或所述的细胞。

27、在第五个方面，本发明提供一种制备所述细胞外囊泡的方法，其包括

28、1)在细胞中表达所述单次跨膜蛋白，和

29、2)分离所述细胞外囊泡。

30、在第六个方面，本发明提供一种向靶细胞递送治疗剂的方法，其包括

31、1)制备所述细胞外囊泡，其中所述跨膜蛋白是包含亲和标签的融合蛋白，和

32、2)使所述细胞外囊泡与所述靶细胞接触。

33、在第七个方面，本发明提供一种分离所述细胞外囊泡的方法，其包括

34、1)在细胞中表达所述跨膜蛋白，所述跨膜蛋白包含亲和标签，

35、2)使所述细胞外囊泡与能够结合所述亲和标签的结合剂接触，和

36、3)基于所述亲和标签与所述结合剂的结合来分离所述细胞外囊泡。

37、与现有技术报道的工程化细胞外囊泡不同，现有技术所使用的用于细胞外囊泡构建的蛋白都是优先选择在ev表达水平高的膜蛋白，而本发明选择的是在ev上本底表达很低甚至没有表达的膜蛋白。当使用这类蛋白构建ev时，来自内源蛋白(例如，ev自身的非融合蛋白)的竞争更小，有助于这类蛋白(例如，携带目的蛋白的融合蛋白)被主动分拣到ev中，增加其在ev中的相对含量，从而大大提高ev携带的活性成分的含量。