一种用于肝癌诊断及预后预测的引物、试剂、试剂盒及其应用的制作方法

1.本发明涉及生物检测领域，具体涉及一种用于肝癌诊断及预后预测的引物、试剂、试剂盒及其应用。


背景技术：

2.肝癌，是五大常见恶性肿瘤之一，致死率高，我国是肝癌的高发国家，肝癌病例超过全球病例数的一半，可见肝癌已经成为我国最重要的公共健康和社会问题之一。现有的研究认为，肝癌是多因素、多步骤的复杂过程，受环境和因此双重因素影响。乙型肝炎病毒(hbv)和丙型肝炎病毒(hcv)感染、黄曲霉素、饮水污染、酒精、肝硬化、性激素、亚硝胺类物质、微量元素等都与肝癌发病相关。
3.目前，手术切除是肝癌一种常用的手术治疗方法，但术后高复发率(5年为50％-70％)是影响肝癌术后生存的最大障碍。因此，寻找具有高特异性及灵敏性的肝癌生物标记物对肝癌诊断以及术后预后预测，提高病人长期生存，指导临床制定个体化治疗方案具有重要意义。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种能够高效、准确进行肝癌诊断和预后预测的引物，同时本发明还提供用于肝癌诊断及预后预测的试剂、试剂盒及其应用。
5.为解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：
6.一种用于肝癌诊断及预后预测的引物，所述引物的序列为：
7.正向引物：5'-ctcctcaagctgtgttacaactc-3'；
8.反向引物：5'-ggaatccagctgtgcttgtatag-3'。
9.本发明还提供一种用于肝癌诊断及预后预测的试剂，所述试剂包括所述用于肝癌诊断及预后预测的引物。
10.本发明中，进一步优选的方案为，所述试剂还包括管家基因引物。
11.本发明中，进一步优选的方案为，所述管家基因引物为内参gapdh的pcr引物，其序列为：
12.正向引物：5'-ccatcaatgaccccttcattgacc-3'，
13.反向引物：5'-gaaggccatgccagtgagcttcc-3'。
14.本发明还提供一种用于肝癌诊断及预后预测的试剂盒，所述试剂盒包括所述用于肝癌诊断及预后预测的引物。该试剂盒可以应用于肝癌诊断或肝癌预后预测中。
15.本发明还提供另一种用于肝癌诊断及预后预测的试剂盒，所述试剂盒所述用于肝癌诊断及预后预测的试剂。该试剂盒可以应用于肝癌诊断或肝癌预后预测中。
16.本发明中，进一步优选的方案为，所述试剂盒还包括dna聚合酶、缓冲液、荧光染料。
17.本发明中，进一步优选的方案为，所述试剂盒还包括对照品。
18.与现有技术相比，本发明具有如下优点：本发明的引物，能够对肝癌的高特异性关联基因进行扩增，用于肝癌诊断及预后预测的检测，可以高效、准确的进行肝癌识别和术后预后预测，具有良好的敏感性和特异性。
19.下面结合说明书附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。
附图说明
20.图1为实验例1中荧光定量pcr检测新鲜肝癌组织配对正常肝细胞中的相对表达量测试数据图；
21.图2为蛋白免疫印迹(western blot)实验检测commd10在8对新鲜肝癌组织及配对正常肝组织中的检测图及相对表达量数据图；
22.图3为免疫组织化学实验(immunohistochemistry assay)检测commd10在正常肝组织、肝硬化组织、肝癌旁组织及肝癌组织中的表达量测试图；
23.图4为克隆形成实验(colony formation assay)检测稳定过表达及敲低commd10的hepg2肝癌细胞的克隆形成能力的测试及数据图；
24.图5为用活细胞计数试剂盒(cell counting kit-8)检测过表达commd10的smmc-7721、hepg2及敲低commd10表达的qgy-7703、hepg2肝癌细胞的增殖能力的数据图；
25.图6为commd10稳定敲低的hepg2肝癌细胞的裸鼠皮下成瘤照片；
26.图7为commd10稳定敲低的hepg2肝癌细胞的裸鼠皮下成瘤体积数据折线图；
27.图8为kaplan-meier法分析commd10表达与肝癌患者预后的相关性数据分析图；
28.其中，图4-图7中，vector为正常细胞组。
具体实施方式
29.下面，结合附图以及具体的实施方式对本发明做进一步的描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合成新的实施例。除特殊说明的之外，具体实施方式中的实施例与实验例，其中的设备和试剂材料均从市场途径获得，具体的实施例是示范性的，仅用于解释本技术，而不能理解作为本技术保护范围的限制。
30.一种用于肝癌诊断及预后预测的引物，所述引物的序列为：
31.正向引物(序列1)：5'-ctcctcaagctgtgttacaactc-3'；
32.反向引物(序列2)：5'-ggaatccagctgtgcttgtatag-3'。
33.本发明的用于肝癌诊断及预后预测的引物，能够对commd10基因进行扩增，经过研究证实，铜代谢基因commd10的表达与肝癌相关，具体的，commd10基因在肝癌患者组织中表达降低，低表达commd10基因促进肝癌细胞增殖，并且commd10基因低表达与患者不良预后也存在关联性。因此可以通过对commd10基因的表达水平可以判断患者是否患有肝癌，并可以根据表达水平将患者进行分层预测生存情况，相较于现有的诊断方法和试剂，本发明能够大幅提高肝癌诊断及预后预测的敏感性与特异性，对后续指导临床制定个性化治疗方案具有重要的意义。
34.本发明的引物，可以进一步应用到对肝癌诊断及预后预测的试剂或者试剂盒中，对应的试剂及试剂盒中，还可以包括管家基因引物；其中，管家基因引物可以为内参gapdh
的pcr引物，其序列为：
35.正向引物(序列3)：5'-ccatcaatgaccccttcattgacc-3'，
36.反向引物(序列4)：5'-gaaggccatgccagtgagcttcc-3。
37.对应的试剂盒中，还可以包括dna聚合酶、缓冲液、荧光染料，还可以包括对照品。
38.本发明的引物、试剂、试剂盒，主要系基于荧光定量pcr方法检测待检测肝细胞中的commd10基因的相对表达水平。
39.实验例1
40.1、commd10在临床肝癌样本中表达水平的检测
41.实验材料：48对新鲜配对的肝癌组织标本及肝癌石蜡组织切片
42.实验方法与结果分析：
43.1)real-time pcr：利用trizol(invitrogen，carlsbad，美国加州)试剂提取新鲜配对肝癌组织标本的总rna。commd10和gapdh的逆转录引物购自英潍捷基公司。
44.commd10的pcr引物序列为：
45.正向引物：5'-ctcctcaagctgtgttacaactc-3'；
46.反向引物：5'-ggaatccagctgtgcttgtatag-3'；
47.管家基因为内参gapdh的pcr引物，序列为：
48.正向：5'-ccatcaatgaccccttcattgacc-3'
49.反向：5'-gaaggccatgccagtgagcttcc-3'
50.根据premix ex taq ii(takara)说明书要求配置pcr反应液(20μl体系)，将样品加入到实时pcr的专用pcr管中后，设置abi7500(perkin elmer/applied biosystems)的pcr反应条件为：95℃5s，60℃34s，40cycles。完成实时pcr后对熔解曲线进行分析，并分析pcr产物是否特异。数据按2-δδct公式计算出基因的相对表达量；结果参见图1，可以看出与正常肝细胞相比，commd10基因在肝癌组织细胞中的表达水平明显降低。
51.2)western blot：通过全蛋白提取试剂盒(杭州弗德生物有限公司)提取8对新鲜配对肝癌组织样本的总蛋白，使用bio-rad公司bca protein assay reagengt kit进行蛋白定量，煮沸变性。
52.sds-page电泳：浓缩胶恒定电压在100v，分离胶恒定电压在120v，至跑出目的蛋白(commd10分子量为23kd，gapdh为37kd)。
53.转膜：tenon微型电转系统200ma进行转膜，commd10约转50min，gapdh约转1h。
54.封闭：5％脱脂牛奶室温孵育1h。
55.敷一抗：commd10兔多克隆抗体(1:1000，abcam)，gapdh鼠单克隆抗体,1:5000，proteintech)，4℃孵育过夜。
56.敷二抗：hrp标记的抗兔及抗鼠二抗(1:10000，杭州弗德生物有限公司)室温孵育1h。
57.ecl超敏化学发光试剂(南京凯基生物科技发展有限公司)对条带进行检测；结合图2，可以看出与正常肝组织细胞相比，commd10在肝癌组织中的表达水平明显降低。
58.3)免疫组织化学：利用中杉金桥免疫组化试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)检测正常肝组织及肝癌组织中commd10的表达。
59.实验材料：正常肝组织、肝癌组织切片，中杉金桥免疫组化试剂盒。
60.实验方法与结果分析：
61.免疫组化步骤：将组织切片置于60℃烤箱烘烤1h，依次进行二甲苯脱蜡、梯度酒精脱水，高压热修复抗原，过氧化物酶抑制剂处理15min，孵育山羊抗兔commd10(1：200)4℃过夜，次日孵育hrp标记的免疫组化二抗，dab显色，苏木素复染、脱水、封片。
62.结合图3，结果分析：采用ris评分系统分析commd10的表达。结果显示，commd10在肝癌组织中呈阴性或浅黄色弱阳性表达，在正常肝组织中呈棕褐色强阳性表达。
63.2、瞬时过表达及敲低commd10的hepg2肝癌细胞株克隆形成能力检测
64.克隆形成实验：shcommd10病毒和vector分别稳定转染hepg2肝癌细胞，利用5μg/μl的嘌呤霉素对细胞进行筛选。筛选后的hepg2肝癌细胞经消化制成单细胞悬液后，按照预定数量接种于六孔板中，每个剂量组3个复孔。照射后将细胞置于37℃，5％co2饱和湿度培养箱内继续培养10-14天，期间根据培养液ph值变化适时更换新鲜培养液。当培养板孔中出现肉眼可见克隆时，终止培养。pbs清洗2遍，甲醇固定，苏木素染色。显微镜下计数含50个细胞以上的克隆数，计算克隆形成率；结合图4，可以看出，与对照组相比，过表达的commd10的hepg2肝癌细胞克隆形成能力明显降低，而敲低commd10表达的hepg2肝癌细胞克隆形成能力明显提升。
65.3、cck-8实验检测commd10表达对肝细胞癌增殖能力的影响
66.用commd10过表达质粒瞬时转染smmc-7721、hepg2细胞，commd10sirna瞬时转染qgy-7703、hepg2细胞，细胞经消化制成单细胞悬液后，按照预定数量接种于九十六孔板中，每组设置5个复孔。铺板后第一天开始用cck-8试剂盒检测各组细胞吸光度值。结合图5，结果显示，与对照组相比，commd10过表达组肝癌细胞(smmc-7721、hepg2)增殖明显降低，而commd10敲低组肝癌细胞(qgy-7703、hepg2)增殖能力明显增强。
67.4、稳定敲低commd10的hepg2肝癌细胞皮下成瘤能力的检测
68.采用shcommd10病毒和vector分别稳定转染hepg2肝癌细胞，利用5μg/μl的嘌呤霉素对细胞进行筛选。然后收集稳定转染的hepg2细胞并按照5
×
106个细胞/只进行裸鼠皮下注射，期间每5天观察并记录裸鼠皮下成瘤情况，注射后第25天处死裸鼠并收集皮下肿瘤。结合图6-图7，结果显示，与vector注射组相比，shcommd10稳定敲低组hepg2细胞的皮下肿瘤体积明显增大，表明敲低commd10表达能促进肿瘤的生长。
69.5、kaplan-meier法分析commd10表达与肝癌患者预后相关性
70.收集肝癌石蜡标本并进行切片，采用免疫组织化学法检测commd10的表达，并利用ris评分系统对免疫组织化学实验结果进行评分。结合图8，结果表明，commd10低表达与南方医院训练集284例肝癌患者、南方医院内部验证集142例肝癌患者和珠江医院外部验证集61例肝癌患者的更差预后相关。
71.上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。