羊毛囊发生发育相关circrna表达谱及其构建方法和应用
技术领域：
：1.本发明涉及生物
技术领域：
：，具体涉及一种羊毛囊发生发育相关circrna表达谱及其构建方法和应用。
背景技术：
：：2.绒山羊的皮肤中有两种毛囊，即初级毛囊和次级毛囊。初级毛囊产粗毛，次级毛囊产绒毛。绒山羊皮肤和毛囊结构特征不仅是其生物学特征的重要内容，而且对绒毛产量和品质有直接重要的影响。绒山羊皮肤毛囊性状对绒毛产量和品质有直接重要的影响，开展绒山羊毛囊生长发育领域的研究，其最终的目标就是想揭示绒毛生长的机理，找到与绒毛生长相关的重要基因。毛囊的发生发育可能与一些蛋白编码基因，目前，认为调节毛囊形态发生的信号分子大部分属于wnt传导通路、肿瘤坏死因子(tnf)家族、成纤维细胞生长因子(fgf)家族、骨形成蛋白(bmp)家族、sonichedgehog(shh)传导通路、转化生长因子(tgf)家族和notch传导通路等。这些编码基因有的是毛囊发育的刺激物，有的是抑制物，被反复利用，相互调控。3.circrna是一类比较特殊的rna，它没有游离的5'帽子结构和3'poly(a)结构，并且对核酸酶不敏感。circrna的种类按其来源可分为以下四种，包括内含子circrna(introncircrna，icircrna)、外显子circrna(exoncircrna，ecircrna)、外显子内含子结合circrna(exon-introncircrna，eicircrna)和基因间circrna(intergeniccircrna)四大类型。circrna的作用机制主要包括：调控亲本基因的表达；与rna结合蛋白相互作用；翻译蛋白质；作为竞争性内源rna调控基因的表达。4.目前，circrna通过竞争性结合mirna从而调控基因的表达来完成生命活动的调节成为研究热点。研究表明circlmo7可通过竞争性结合mir-378a-3p，增强mir-378a-3p靶基因hdac4表达量，促进肌细胞增殖，抑制牛成肌细胞分化；circarf3吸附mir-103，缓解mir-103对traf3的靶向抑制作用，通过促进线粒体自噬缓解脂肪炎症。circrna3669作为cerna吸附mir-26a，并解除mir-26a在奶山羊子宫内膜上皮细胞(eec)中对rcn2的下调作用。circrna已在多种组织和细胞中取得了研究，然而，circrna在绒山羊胚胎期毛囊发生发育调控作用研究还十分匮乏。技术实现要素：5.有鉴于此，本发明致力于提供一种羊毛囊发生发育相关circrna表达谱及其构建方法和应用，为今后探究circrna作为cerna在毛囊的发生发育中的分子机制提供了重要依据。6.本发明一方面提供了一种一种羊毛囊发生发育相关circrna的构建方法，包括以下步骤：7.(1)rna文库构建与测序：对羊胎儿期的体侧皮肤的样本构建rna文库并进行测序；27b-3p、circrna3236和chi-mir-16b-3p具有靶向结合关系。22.本发明第二方面提供了一种羊毛囊发生发育相关circrna表达谱，采用羊毛囊发生发育相关circrna的构建方法获得。23.本发明第三方面提供了所述的羊毛囊发生发育相关circrna的构建方法，或所述的羊毛囊发生发育相关circrna表达谱在调控羊皮肤毛囊发生发育中的应用。24.建立了绒山羊胚胎期皮肤毛囊中circrna的表达谱，发现circrna的亲本基因可能参与绒山羊毛囊发生发育。构建了差异表达circrna的circrna-mirna-mrna的共表达网络，并进行了初步验证。为今后探究circrna作为cerna在毛囊的发生发育中的分子机制提供了重要依据本发明采用上述技术方案具有以下有益效果：25.(1)本发明建立了绒山羊胚胎期皮肤毛囊中circrna的表达谱，发现circrna的亲本基因可能参与绒山羊毛囊发生发育。26.(2)本发明构建了差异表达circrna的circrna-mirna-mrna的共表达网络，并进行了初步验证。为今后探究circrna作为cerna在毛囊的发生发育中的分子机制提供了重要依据附图说明27.图1所示为实施例1中circrna的鉴定结果，左侧表示circrna的数量，右侧表示circrna宿主基因的数量。28.图2所示为实施例1中circrna的预测结果图。其中，a：羊毛囊中circrna的特征图，每个基因circrna数量的分布。x轴代表circrna/宿主基因的数量，y轴代表circrna的数量。b：框图显示外显子衍生圆环rna的外显子长度，x轴表示圆环rna包含的外显子数量，y轴表示外显子长度。c：已鉴定的环状rna在每个染色体上的分布，x轴代表染色体的数量，y轴代表按不同染色体分类的环状rna的数量。d：绒山羊毛囊中环状rna的分类。。29.图3所示为实施例1中circrna的表达结果图。a：显示每个样本中circrna表达丰度的方框图。b：每个样本中circrna表达密度分布的密度图。30.图4所示为实施例1中不同组的差异表达circrna。左侧表示上调的circrna，右侧表示下调的circrna。31.图5所示为实施例1中circrna在不同时期的表达量和表达趋势。0.8《|rs|《1表示强相关性；0.6《|rs|《0.8表示有很强的相关性；0.4《|rs|《0.6表示中度相关性；0.2《|rs|《0.4表示相关性较弱；0《|rs|《0.2表示无相关性；|rs|和1之间的接近度表示两个变量之间的接近度和相关性。32.图6所示为实施例1中绒山羊毛囊circrna-mirnamrna调控网络分析。在d45vsd75之间，6a代表上调的circrna网络，6b下调的circrna网络。33.图7所示为实施例2中ircrna3236靶向chi-mir-27b-3p和chi-mir-16b-3p。其中，7a：circrna3236中chi-mir-27b-3p的预测结合位点和突变位点。7b：circrna3236中chi-mir-16a-3p的预测结合位点和突变位点。7c：通过双荧光素酶报告基因检测circrna3236和chi-mir-27b-3p之间的相互作用。7d：通过双荧光素酶报告基因检测circrna3236和chi-mir-16b-3p。具体实施方式34.除非另有定义，本发明中所使用的所有科学和技术术语具有与本发明涉及
技术领域：
：的技术人员通常理解的相同的含义。35.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。36.下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。37.下面结合具体实施例详细描述本发明，这些实施例用于理解而不是限制本发明。38.下述实施例中所有动物实验均按照科技部(中国北京)的“实验动物指南”进行。所有手术均按欧盟委员会(1997)的建议进行，并经内蒙古农业大学实验动物伦理委员会批准。39.实施例140.一种羊毛囊发生发育相关circrna的构建方法，包括以下步骤：41.(1)准备试验动物与样品42.于内蒙古金莱牧业选取三岁母羊进行同期发情处理，记录配种时间。采取胎儿期45天、55天、65天、75天各三只羊皮肤样品后，立即用dpec水处理，并置于液氮中。随后放入-80℃冰箱中保存，供rna-seq和rt-qpcr试验使用。43.(2)rna文库构建与测序44.按照制造商的程序，使用trizol试剂(invitrogen，carlsbad，ca，usa)分离和纯化总rna。使用nanodropnd-1000(nanodrop，willington，de，usa)对每个样本的rna数量和纯度进行量化。用安捷伦2100评估rna的完整性。用大约5微克的总rna来消耗核糖体rnatmrrna去除试剂盒(illumina，sandiego，usa)和剩余的rna片段用rna序列库制备试剂盒(illumina)进行反向转录，形成最终产物cdna。最后，在illuminahiseq4000(联川生物，中国浙江杭州)上按照供应商推荐的方案进行配对末端测序。对内蒙古绒山羊(阿尔巴斯型)胎儿期四个时期进行高通量测序。45.首先，构建了绒山羊胎儿期12个去核糖体rna文库，分别为d45-1、d45-2、d45-3、d55-1、d55-2、d55-3、d65-1、d65-2、d65-3、d75-1、d75-2和d75-3(其中d代表天数)。46.使用illuminahiseq4000平台对这些库进行rna-seq，从中获得了来自12个库的1063299566个原始读取(表1)。在这些原始读取中，通过去除带接头(adaptor)的reads、含有n(n表示无法确定碱基信息)的比例大于5％的reads和低质量reads(质量值q≤10的碱基数占整个read的20％以上)获取了1023889360有效读取。每个库的q20(质量值≥30的碱基所占比例，错误率《0.001)在99.90％，q30(质量值≥20的碱基所占比例，错误率《0.01)在98.1％以上(table1)，表明测序准确率较高。47.表1[0048][0049]将1023889360有效读取与参考基因组进行比对，比对到参考基因组上的reads数目占validreads的百分比高于94％，比对到参考基因组唯一位置的reads数目占validreads的百分比高于77％，比对到参考基因组多处位置的reads数目占validreads的百分比高于17％。因此，数据的利用率正常，获得的原始数据在数量和质量上都满足后续circrna的分析要求(表2)。[0050]表2[0051][0052](3)转录本的鉴定[0053]根据circrna结构特征以及剪接序列特征，采用circexploter2和ciri两款软件预测circrna。并且依据circrna起始、终止位置来整合两个软件的结果。以下为circrna鉴定标准1.mismatch≤2；2.back-splicedjunctionsreads≥1；3.twosplicesites在基因组上距离小于100kb。按照以上鉴定筛选标准，更精确地鉴定出circrna。[0054]结果显示，每个文库中共鉴定出circrna均在2800个以上，对应的亲本基因均在1700个以上(图1)。研究发现大多数circrnas包含2到4个外显子(图2a)。同时，circrnas的外显子长度包括只有一个外显子的长度比由多个外显子组成的circrnas长(图2b)。染色体分布分析表明，circrnas几乎分布于所有染色体上；其中，1号、10号和11号染色体的circrnas数量高于其他染色体(图2c)。最后，在绒山羊皮肤毛囊中exoncircrnas占所有circrnas的92.01％(图2d)[0055](4)差异表达分析[0056]为进一步探究circrna在绒山羊毛囊早期发生发育过程中的调控作用，将四个时期形成六个比对组，通过计算circrnas的srpbm值来进行差异表达分析(图3a和图3b)。对鉴定到的circrna进行差异表达分析时，默认采用差异倍数(foldchange)和pvalue进行差异circrna筛选：即同时满足log2foldchange(sprom)绝对值大等于1且pvalue小等于0.05。[0057]结果显示：d75vsd45，circrna上调59个，下调33个；d75vsd55，circrna上调61个，下调102个；d75vsd65，circrna上调32个，下调33个；d65vsd55，circrna上调67个，下调169；d65vsd45，circrna上调96个，下调63个；d55vsd45，circrna上调76个，下调42个(图4)。[0058]进一步探究circrna差异表达规律分析发现，d65vsd55差异表达的circrna最多，而d75vs65差异表达的circrna最少(图4)。[0059](5)qrt-pcr验证circrnas结果[0060]为验证circrnas测序结果的准确性，采用qrt-pcr(图5)测定6个差异表达的circrna,circrna2049、circrna3411、circrna2225、circrna5681、circrna1604、circrna4351)的相对表达，qrt-pcr结果与转录组测序数据一致。[0061]qrt-pcr的具体方法：根据生产厂家的说明书，使用trizol试剂(takara,dalian,liaoning,china)从12个绒山羊胎儿期皮肤样本中提取总rna。随后，使用带有primescriptrtreagentkit和gdnaeraser的试剂盒(takara,dalian,liaoning,china)将rna反向转录到cdna。然后，在实时荧光定量系统(roche,basel,switzerland)上，采用tbgreenpremixex-taqⅱ(takara,dalian,liaoning,china)进行qrt-pcr，条件为：95℃，30s，和然后在95℃下40次循环10s，60℃下30s，然后72℃下10s。以β-actin为参考吉恩，使用2‑△△ct方法计算表达水平。[0062](6)宿主基因go富集分析和kegg通路分析[0063]基因本体分析包括描述基因和基因产物的细胞和分子作用的三个领域(生物过程(bp)、细胞成分(cc)和分子功能(mf))。kegg是一个系统分析基因功能的途径数据库，连接基因组和功能信息。为了探讨decircrnas的宿主基因在绒山羊毛囊发生发育中调控作用，对各个比对组差异表达的circrna的宿主基因进行了go和keggpathway富集分析。go富集结果表明，在hairfolliclemorphogenesis、hairfolliclematuration、celldevelopment等与毛囊生长发育相关的生物学过程中有基因富集；keggpathaway分析表明:在notchsignalingpathway、nf-kappabsignalingpathway、pi3k-aktsignalingpathway等信号通路中有基因富集。因此，差异表达的circrna对应的亲本基因可能参与毛囊生长发育的过程，进而发挥调控作用。[0064](7)cerna调控网络的构建[0065]竞争性内源性rna(cerna)假说是一种新的转录后基因调控模型。根据这个假设，cerna减少了指定mirna的表达。为了构建circrna-mirna的cerna网络，整合mirna文库数据和mrna文库数据，利用miranda和targetscan分析circrna和mrna与mirna结合位点。[0066]选择d75vsd45中的外显子circrna构建cerna调控网络，在上-下-上调节模式下，预测了46个circrna-mirna和49个mirna-mrna相互作用(图6a)。如图6a所示，上调的circrna9106可作为多个mirnas(chi-mir-1、chi-mir-18a-3p和chi-mir-93-3p)的海绵。[0067]值得注意的是，三个circrna8058、circrna663和circrna8624包含chi-mir-133a-5p的种子靶点，通过寻找mirna靶点进行鉴定。此外，这些mirnas可以下调其靶基因的表达(chi-mir-133a-5p被预测与flrt1、sox5和rbpjl基因结合)。[0068]进一步使用miranda和targetscan构建了一个自下而上的共表达网络，其中预测了56个circrna-mirna和77个mirna-mrna相互作用(图6b)。在向下-上-下共表达网络中，circrna3382、circrna1448和circrna1896三个下调的circrnas含有chi-mir-26b-3p的种子靶点，同时预测chi-mir-26b-3p与mctp1、mef2c、gpc6和fzd5等多个靶基因结合，circrna3236被预测有两个靶基因(mir-16b-3p和mir-27b-3p)。[0069]实施例2circrna3236靶向结合chi-mir-27b-3p和chi-mir-16b-3p[0070]d75vsd45中circrna3236下调，targetscan和miranda软件预测circrna3236靶向chi-mir-27b-3p和chi-mir-16b-3p，分别有两个结合位点。因此，因此，构建了两个突变载体来验证特定的结合位点(图7a和图7b)。结果表明，在本实验中，二者之间存在一种结合效应。mu1突变后，chi-mir-27b-3p未能下调circrna3236-mut1中荧光素酶的表达(p》0.05)，说明突变成功。mu1是chi-mir-27b-3p与circrna3236的结合位点，突变后chi-mir-16b-3p未能下调circrna236-mut4中荧光素酶的表达(p》0.05)，说明突变成功。mu4是chi-mir-16b-3p和circrna3236的结合位点(图7c和图7d)。[0071]双荧光素酶报告基因检测的具体步骤：由中国上海汉生物科技有限公司合成了chi-mir-27b-3p模拟物和chi-mir-27b-3p模拟物。将mirna模拟物转染hek293t细胞。根据制造商的说明书，使用lipofiter转染试剂将质粒转染到hek293t细胞中。psicheck2-circrna3236-wt结构是通过将含有mirna结合序列的circrna3236片段插入到renilla荧光素酶基因3′末端的psicheck-2载体(promega)中而产生的。通过重叠延伸pcr将mirna结合序列突变为互补序列，得到突变体psicheck2-circrna3236-mut结构。对于circrna3236荧光素酶检测，将mirna模拟物和psicheck2-circrna3236-wt或突变的psicheck2-circrna3236-mut报告质粒转染hek293t细胞。在转染后48小时，根据制造商的说明，使用双荧光素酶报告检测系统(promega)测量荧光素酶活性。通过比较萤火虫/肾虫荧光素酶的活性比，计算了荧光素酶的相对活性。[0072]实施例3[0073]为进一步探究circrna在绒山羊毛囊发育过程中的功能机制，预测了d75vsd45差异表达的circrna靶向的mirna以及靶向mirna的靶基因，从而构建了cerna网络。其中上调-下调-上调模式中共有16个circrna靶向6个mirna，6个mirna靶向23个靶基因，下调-上调-下调模式中共有14个circrna靶向16个mirna，16个mirna靶向26靶基因。构建了circrna9127-chi-mir-1-wnt3，circrna2046-chi-mir-93-3p-flrt1，[0074]circrna2962-chi-mir-20b-smad6，circrna3236-chi-mir-27b-3p-sfrp1，circrna3236-chi-mir-16b-3p-slitrk3,circrna1476-chi-mir-10b-3p-wnt2等信号通路。其中sfrp1、wnt3、smad6、等基因均来之与之前研究中毛囊发育相关的重要通路，包括wnt、tgf-β、tnf等信号通路。因此，进一步推测circrna作为cerna可能是通过wnt、tgf-β、tnf等通路中的相关基因在绒山羊胎儿期皮肤毛囊中发挥调控作用。[0075]综上所述，本发明构建了内蒙古绒山羊不同胚胎时期(45天、55天、65天、75天)皮肤毛囊中circrna表达谱，共鉴定出21784个circrna。筛选了6个比对组中差异表达的circrna。随机选取了6个差异表达的circrna进行rt-qpcr实验，表明测序结果可靠。亲本基因的go和kegg分析结果表明circrna与其亲本基因可能存在一定联系，且circrna可能通过notchsignalingpathway和nf-kappabsignalingpathway信号通路在绒山羊毛囊生长发育的生物学过程中发挥作用。同时构建了circrna-mirna-mrna的共表达网络，共形成了102对circrna-mirna和126对mirna-mrna互作关系。双荧光素酶验证结果显示circrna3236-chi-mir-27b-3p，circrna3236-chi-mir-16b-3p具有靶向结合关系，为今后探究circrna作为cerna在毛囊的发生发育中的分子机制提供了重要依据，也为研究circrna在人类毛囊机制方面提供了重要信息。[0076]以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页12当前第1页12