一组银杏性别关联的SNP位点及其引物和应用的制作方法

一组银杏性别关联的snp位点及其引物和应用
技术领域
1.本发明属于植物性别鉴定技术领域，具体涉及一组银杏性别关联的snp位点、引物以及其在银杏种水平的早期雌雄性别鉴定中的应用。


背景技术：

2.银杏(ginkgo biloba l.)是我国特有的孑遗植物，被称为植物界的“活化石”。作为典型的雌雄异株植物，其雌株和雄株在形态特征、生长习性和应用价值等方面存在明显差异。银杏雄株生长速度快、树形美观、抗性强，常常用作园林绿化之用[唐海霞，杜淑辉，邢世岩，桑亚林，李际红，刘晓静，孙立民.银杏性别决定相关基因的筛选[j].林业科学，2017，53(2)：76-82.]。银杏种子有重要的食用价值和药用价值，故常将雌株用作果用栽培。然而，银杏种子成熟之后，其外种皮会散发出阵阵恶臭，掉落后污染环境，严重影响银杏的观赏价值。因此，在园林绿化中，如何对银杏性别进行准确早期鉴定一直是关注热点，这不仅具有理论意义，更有着重要的实用价值。
[0003]
最为直观准确的银杏性别鉴定方法是直接观察植株花序。然而，一般来说银杏实生苗需20-30年才可开花，届时再对其性别进行直接鉴定，缺乏时效性，在推广应用和科研实践中均是极大限制。虽已有学者从形态学[黄凤丽.银杏树雌雄株形态识别法[j].山西果树，2009，(3)：56.]、生理生化[yamasaki m.identification of the sexes in dioecious plants by testing the resistance to the toxic action of chlorate[j].journal of japanese botany，1933，6：459-466.；蔡汝，陶俊，陈鹏.银杏雌雄株叶片光合特性、蒸腾速率及产量的比较研究[j].落叶果树，2000，(1)：14-15.]和细胞学水平[张扬，朱胜男，金晓芬，洪义欢，陈建民.45srdna-fish鉴定银杏雌雄性别[j].园艺学报，2007，(6)：1520-1524.]等对银杏性别早期鉴定方法进行了探究，但其依然受环境、树龄、产地等因素的影响，一直未能从根本上解决这一问题。因此，现急需一种操作简便、准确性高、不受外界因素影响的银杏性别鉴定技术。


技术实现要素：

[0004]
针对现有技术存在的上述问题，本发明所要解决的第一技术问题在于提供一组银杏性别关联的snp位点；本发明所要解决的第二技术问题在于提供用于检测银杏性别关联的snp位点的引物；本发明所要解决的第三技术问题在于提供该银杏性别关联的snp位点及其引物在银杏种水平的早期雌雄性别鉴定中的应用。
[0005]
为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：
[0006]
本技术通过简化基因组技术对来自11个银杏古树群体的160份样品进行snp位点挖掘和基因分型，通过gq、mq、最小等位基因频率、miss率、reads数参数以及hardy-weinberg遗传平衡情况对snp位点进行过滤，并采用混合线性模型对银杏性别进行全基因组关联分析，然后再根据snp位点位置、基因分型信息进行筛选，筛选到6个银杏性别关联的snp位点，分别为gb_snp 1、gb_snp 2、gb_snp 3、gb_snp 4、gb_snp 5和gb_snp 6；
[0007]
其中，gb_snp 1位于银杏基因组2色染色体第380508442位；该位点的碱基为c/a；
[0008]
gb_snp 2位于银杏基因组2号染色体第380508656位，该位点的碱基为t/c；
[0009]
gb_snp 3位于银杏基因组2号染色体第380774056位，该位点的碱基为t/g；
[0010]
gb_snp 4位于银杏基因组2号染色体第380864285位，该位点的碱基为c/g；
[0011]
gb_snp 5位于银杏基因组2号染色体第380864406位，该位点的碱基为t/g；
[0012]
gb_snp 6位于银杏基因组2号染色体第381007805位，该位点的碱基为a/g。
[0013]
用于检测上述银杏性别关联的snp位点的引物，为5对特异性引物，引物核苷酸序列如下：
[0014]
gb_snp 1、gb_snp 2的上游引物如seq id no.1所示；gb_snp 1、gb_snp 2的下游引物如seq id no.2所示；
[0015]
gb_snp 3的上游引物如seq id no.3所示；gb_snp 3的下游引物如seq id no.4所示；
[0016]
gb snp 4的上游引物如seq id no.5所示；gb_snp 4的下游引物如seq id no.6所示；
[0017]
gb_snp 5的上游引物如seq id no.7所示；gb_snp 5的下游引物如seq id no.8所示；
[0018]
gb_snp 6的上游引物如seq id no.9所示；gb_snp 6的下游引物如seq id no.10所示。
[0019]
含有所述引物的用于检测银杏性别的试剂或试剂盒。
[0020]
将所述snp位点或所述引物或所述试剂或试剂盒用于银杏种水平的早期雌雄性别鉴定，具体包括以下步骤：
[0021]
1)提取待测银杏的基因组dna；
[0022]
2)用上述任一对特异性引物或多对特异性引物对步骤1)提取的基因组dna进行pcr扩增，得到扩增产物；
[0023]
3)对pcr产物进行测序，依据snp位点基因分型情况对照不同雌雄性别，完成鉴定。
[0024]
步骤2)中，pcr扩增的体系为：待测银杏样品的基因组dna 1μl 40ng、1
×
buffer 1μl、10mm dntps 0.2μl、25mm mgcl
2 1μl、f-primer 0.2μl、r-primer 0.2μl、taq酶0.2μl、ddh2o 6.2μl；总反应体系为10μl。
[0025]
步骤2)中，pcr扩增的程序为：预变性94℃5min；94℃30s，72℃40s，30个循环；72℃延伸1min。
[0026]
步骤3)中，依据snp位点基因分型情况对照不同雌雄性别具体为：
[0027]
待测银杏基因组基于gb_snp 1位点的基因型为cc基因型，则待测银杏为雌株；为ac基因型，则待测银杏为雄株；
[0028]
待测银杏基因组基于gb_snp 2位点的基因型为tt基因型，则待测银杏为雌株；为tc基因型，则待测银杏为雄株；
[0029]
待测银杏基因组基于gb_snp 3位点的基因型为tt基因型，则待测银杏为雌株；为tc基因型，则待测银杏为雄株；
[0030]
待测银杏基因组基于gb_snp 4位点的基因型为cc基因型，则待测银杏为雌株；为cg基因型，则待测银杏为雄株；
[0031]
待测银杏基因组基于gb_snp 5位点的基因型为tt基因型，则待测银杏为雌株；为tg基因型，则待测银杏为雄株；
[0032]
待测银杏基因组基于gb_snp 6位点的基因型为aa基因型，则待测银杏为雌株；为ag基因型，则待测银杏为雄株。
[0033]
所述snp位点或所述引物或所述试剂或试剂盒在银杏基因分型中的应用。
[0034]
所述snp位点或所述引物或所述试剂或试剂盒在银杏分子标记辅助育种中的应用。
[0035]
相比于现有技术，本发明的有益效果为：
[0036]
1)本发明基于160份古树群体样本进行的性别全基因组关联分析，选取到的银杏性别关联的snp位点，将其应用于鉴定鉴定银杏雌雄性别中，结果高度准确、可靠。
[0037]
2)本发明操作简便快速，检测结果灵敏度高，对待检测样品仅需提供模板dna 40ng即可准确鉴定其性别。
[0038]
3)本发明取材方便、经济效益明显：叶片、冬芽、花等组织或器官均可为取样材料，苗期、幼林期、成年大树均可取样，不受季节、地点限制。
附图说明
[0039]
图1为10个待测样本在gb_snp 4位点碱基类型测序结果图。
具体实施方式
[0040]
下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。
[0041]
实施例1
[0042]
采集中国主要银杏集中分布区内的11个古树群体，西部主要包括贵州省、重庆市、陕西省内的6个古树群体，中部为湖北省、广西省内的3个古树群体，而东部则为浙江省内的2个古树群体，每个古树群体采集样本13-15份，共计160份。利用简化基因组技术对来自11个银杏古树群体的160份样品进行snp位点挖掘和基因分型，共获得14238535个snp位点和基因分型信息。通过gq(genotype quality)、mq(mapping quality)、最小等位基因频率(maf)、miss率、reads数(dp)参数以及hardy-weinberg遗传平衡情况对snp位点进行过滤，最终获得176182个高质量snp位点。基于所获snp位点采用混合线性模型对银杏性别进行全基因组关联分析，共获得显著关联位点22个。根据snp位点位置、基因分型信息进行筛选，最终选择6个银杏性别关联snp位点，并利用primer 5.0软件对6个snp位点进行引物设计。
[0043]
表1银杏性别分子检测引物
[0044][0045]
实施例2
[0046]
在江苏省南京市南京林业大学校园内银杏行道树中随机选取10株(5雌5雄)已知性别的银杏个体的叶片，打乱顺序后应用实施例1中的6个snp位点进行性别鉴定，包括以下步骤：
[0047]
1)dna提取利用天跟生化科技有限公司的植物基因组dna提取试剂盒(dp305)完成。
[0048]
2)按照如下的pcr反应体系和反应程序据表1的引物进行pcr扩增。
[0049]
pcr的反应体系10μl，包括模板dna 1μl(40ng)、1
×
buffer 1μl、10mm dntps 0.2μl(thermo scientific公司)、25mm mgcl
2 1μl、f-primer 0.2μl(上海捷瑞生物有限公司)、r-primer 0.2μl(上海捷瑞生物有限公司)、taq酶0.2μl(thermo scientific公司)、ddh2o 6.2μl；
[0050]
pcr反应程序为：预变性94℃5min；30循环的94℃30s，最佳tm30s，72℃40s；延伸72℃1m，最终10℃保存；所用pcr仪applied biosystems geneamp pcr system 9700。
[0051]
3)将pcr产物进行测序，并利用snapgene 4.1.0软件进行相应snp位点基因分型结果进行判读，以获取该位点的碱基类型。
[0052]
5)依据snp位点基因分型情况对照不同性别，即可完成鉴定。
[0053]
结果显示，仅用6个snp位点中的任意一个即可完成10份样本的性别鉴定，具体鉴定结果如表2所示。
[0054]
表2 10个银杏样本性别鉴定结果
[0055][0056]
实施例3
[0057]
与实施例1基本相同，不同的是改变取样材料，将叶片替换为冬芽或花，均能获得与实施例1相同的结果。
[0058]
本发明取材方便，叶片、冬芽、花等组织或器官均可为取样材料，苗期、幼林期、成年大树均可取样，不受季节、地点限制。