一种靶向溶酶体和脂滴亚细胞器的荧光聚丙烯酸酯及其在细胞成像中的应用

1.本发明涉及一种可同时用于对脂滴和溶酶体成像的荧光两亲性嵌段共聚物的制备方法，以及光谱测试、细胞成像应用与性能测试，属于有机-高分子成像领域。


背景技术：

2.脂滴（lds）和溶酶体（lysosomes）是重要的亚细胞器，几乎存在于所有生物体中，在各种生理活动中发挥重要作用，最近的研究表明，脂滴和溶酶体之间的相互作用与代谢疾病有关。因此，开发一种有效的策略来同时监测溶酶体和 lds 以了解它们之间的联系对于医学领域具有进步意义。然而，用于同时可视化 lds 和溶酶体的单一荧光工具鲜有报道，并且它们可能面临水溶性差的问题。
3.近年来，与荧光小分子相比，由于荧光聚合物具有良好的水溶性、优异的生物相容性和易于修饰分子的结构等诸多优点而受到越来越多的关注。此外，小分子荧光探针可能是不稳定的并且具有高的细胞毒性。迄今为止，许多荧光聚合物已被开发并广泛应用于传感领域，如金属离子检测、ros或 rss检测、co2和温度检测、lds 检测甚至药物输送领域。
4.通常，荧光聚合物是通过含荧光基团的单体或引发剂的直接聚合或通过荧光基团对非荧光的聚合物的聚合后改性将荧光基团掺入到大分子中来构建的。各种聚合策略包括乳液聚合、原子转移自由基聚合 (atrp)、可逆加成断裂链转移聚合 (raft)、铜 (0)介导的可逆失活自由基聚合 (cu(0)
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rdrps)已被广泛用于制备荧光聚合物。在这些聚合方法中，raft聚合由于具有聚合单体丰富、聚合物分布窄、过程控制容易等诸多优点而受到研究人员的青睐。
5.现有技术制备的荧光聚合物，光稳定性、抗离子干扰性、耐ph性较差，不具有脂滴效应，不能同时靶向活细胞中的 lds 和溶酶体。


技术实现要素：

6.针对现有技术存在的不足，本发明提供一种靶向溶酶体和脂滴亚细胞器的荧光聚丙烯酸酯，实现以下发明目的：（1）具有优异的光稳定性、强的抗离子干扰特性和对宽ph范围(1-14)的抵抗力；（2）具有脂滴效应；（3）可同时靶向活细胞中的 lds 和溶酶体。
7.为解决上述技术问题，本发明采取以下技术方案：一种靶向溶酶体和脂滴亚细胞器的荧光聚丙烯酸酯，所述荧光聚丙烯酸酯的结构式如式（i）所示：
[0008] 所述荧光两亲性嵌段共聚物poly (nap-lyso-mma-co-pegma
300
)的合成路线如下：。
[0009]
所述荧光聚丙烯酸酯的制备方法如下：将荧光单体4-吗啉萘酰亚胺甲基丙烯酸酯、pegma
300
、引发剂以及链转移剂在氮气氛围下混合，加入甲苯溶解，在真空条件下，于78-82℃反应34-38 h。
[0010]
所述4-吗啉萘酰亚胺甲基丙烯酸酯与pegma
300、
引发剂、链转移剂的摩尔比为（0.22-0.27）：（0.8-1.2）：（0.008-0.012）：（0.02-0.03）。
[0011]
所述引发剂为偶氮二异丁腈；所述链转移剂为3-(((十二烷基硫代)碳硫酰)硫代)丁酸。
[0012]
一种靶向溶酶体和脂滴亚细胞器的荧光聚丙烯酸酯在细胞成像中的应用，所述荧光聚丙烯酸酯用于细胞成像，同时靶向lds 和溶酶体。
[0013]
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：（1）本发明通过可逆加成-断裂链转移聚合（raft）合成了一种可同时靶向溶酶体和lds成像的荧光两亲性嵌段共聚物，荧光聚丙烯酸酯的合成只需要一步就可以完成，且后处理过程相对简单，反应历程可控，分子量分布较窄。
[0014]
（2）本发明制备的聚合物poly (nap-lyso-mma-co-pegma300)具有优异的水溶性、低的细胞毒性、大的斯托克斯位移（超过125 nm）、优异的光稳定性（超过2小时）、强的抗离子干扰特性和对宽ph范围(1-14)的抵抗力。
[0015]
（3）本发明制备的聚合物poly (nap-lyso-mma-co-pegma300)具有脂滴效应，在乙酸乙酯中的荧光强度比在甲醇中增加了5倍。
[0016]
（4）本发明制备的荧光聚合物具有显著的生物膜渗透性、溶酶体靶向性（皮尔逊系数为 0.832443），lds 特异性（皮尔逊系数为 0.908438）。
[0017]
（5）本发明制备的荧光聚合物可同时靶向双亚细胞器-溶酶体和lds。
附图说明
[0019]
图1是聚合单体和荧光聚丙烯酸酯poly (nap-lyso-mma-co-pegma
300
)的相关图谱；其中1（a）为聚合单体与荧光聚丙烯酸酯的1h nmr图谱；1（b）为聚合单体与荧光聚丙烯酸酯的ft-ir图谱；1（c）为聚合单体与荧光聚丙烯酸酯的紫外吸收图谱。
[0020]
图2是荧光聚丙烯酸酯poly (nap-lyso-mma-co-pegma
300
)的gpc测试结果。图3是荧光聚丙烯酸酯poly (nap-lyso-mma-co-pegma
300
)的dls和tem测试结果；其中3（a）为dls的测试结果；3（b）为tem的测试结果。
[0021]
图4是荧光聚丙烯酸酯poly (nap-lyso-mma-co-pegma
300
)在不同溶剂中的紫外和荧光测试谱图；其中4（a）为荧光聚丙烯酸酯在不同溶剂中的紫外测试谱图；4（b）为荧光聚丙烯酸酯在不同溶剂中的荧光测试谱图；4（c）为荧光聚丙烯酸酯在乙酸乙酯与甲醇的不同比例混合溶剂中的荧光测试谱图；4（d）为荧光聚丙烯酸酯在乙酸乙酯与甲醇混合溶剂中随着乙酸乙酯比例增加的荧光光谱。图5是荧光聚丙烯酸酯poly (nap-lyso-mma-co-pegma
300
)的稳定性试验的荧光测试谱图；其中5（a）为不同ph值的pbs中的荧光测试谱图；5 (b)为连续照射不同时间的荧光测试谱图；5 (c) 为加入不同离子后的荧光测试谱图。图6是荧光聚丙烯酸酯poly (nap-lyso-mma-co-pegma
300
)的mtt测试结果。图7是荧光聚丙烯酸酯poly (nap-lyso-mma-co-pegma
300
) (20
ꢀµ
g/ml)在hela细胞中的成像测试结果；其中7 (a)为明场图；7 (b) 为荧光成像图；7 (c)为 (a)和(b)的合并图像。
[0022]
图8是荧光聚合物poly (nap-lyso-mma-co-pegma
300
) 在hela细胞中的溶酶体和脂滴共定位成像测试结果；其中8(a) 为未进行染色的hela细胞的明场图像；8 (b)为用poly (nap-lyso-mma-co-pegma300) (20
ꢀµ
g/ml)和 cy5 (500.0 nm)共同染色hela细胞之后的荧光图像，通道为fitc通道，激发波长405nm，收集范围为410-460nm；8 (c) 为cy5 通道，激发波长647nm，收集范围为650-700nm；8 (d)为 8 (b)和8 (c) 两个通道的荧光成像图合并后的图像；8(e)为8(b)和8(c) 两个通道的荧光强度点线相关图；8(f) 为未进行染色的hela细胞的明场图像；8 (g)为用poly (nap-lyso-mma-co-pegma300) (20
ꢀµ
g/ml)和 bodipy(500.0 nm)共同染色hela细胞之后的荧光图像，通道为fitc通道，激发波长405nm，收集范围为410-460nm；8 (h) 为bodipy (500.0 nm)通道，激发波长561nm，收集范围为570-620nm；8 (i)为 8 (g)和8 (h) 两个通道的荧光成像图合并图像；8(j)为8(g)和8(h) 两个通道的荧光强度点线相关图。比例尺= 20
µ
m。
[0023]
图9是荧光聚合物poly (nap-lyso-mma-co-pegma
300
) 在hela细胞中的溶酶体和脂滴双亚细胞器定位成像测试结果；9(a) 为明场图像；9(b) 为 poly (nap-lyso-mma-co-pegma
300
) (20
ꢀµ
g/ml)染色；9(c) 为bodipy (500.0 nm)染色；9(d) 为cy5 (500.0 nm)染色；9(e) 为(b)、(c)和(d)的合并图像；9(f) 为(b)、(c)和(d)的强度相关图。fitc通道：λex = 405 nm，收集410-460 nm。cy5 通道：λex = 647 nm，收集650-700 nm。比例尺= 20
ꢀµ
m。
具体实施方式
[0025]
下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。
[0026]
实施例1:荧光聚合物poly (nap-lyso-mma-co-pegma
300
)的合成：将荧光单体nap-lyso-mma（0.25 mmol，98.7 mg）、pegma
300
（1.0 mmol，310.0 mg）、引发剂aibn (0.01 mmol，2.2 mg)以及链转移剂cta (0.025mmol，10.4 mg)在氮气氛围下加至schlenk反应瓶中，并加入3.0 ml甲苯溶解，然后在三个冷冻-泵-融化循环中对反应瓶进行脱气，在真空下密封（保证反应体系一直处于氮气环境，隔绝与外界的接触），然后将其置于80 ℃油浴锅中反应36 h。反应结束后，将混合物冷却至室温并用丙酮进行透析24 h，当所透析出的丙酮中没有单体时，透析操作可结束，将透析袋中的产物通过减压浓缩除去溶剂，然后在冷的石油醚中进行沉淀，重复两次，最后将得到的粗产物在真空下真空干燥，得到油状聚合物poly (nap-lyso-mma-co-pegma
300
)。为了验证是否成功接入，各种单体与荧光聚合物的1h nmr图谱对比图见图1(a)。
[0027]
上述nap-lyso-mma、pegma
300、
aibn、cta的中文名称如下：nap-lyso-mma：4-吗啉萘酰亚胺甲基丙烯酸酯；pegma
300
：平均分子量为300的聚乙二醇甲基丙烯酸酯；aibn:偶氮二异丁腈；cta：3-(((十二烷基硫代)碳硫酰)硫代)丁酸；实施例2：单体nap-lyso-mma和荧光聚合物poly (nap-lyso-mma-co-pegma
300
)的ft-ir图谱将实施例1中制备的荧光聚合物poly (nap-lyso-mma-co-pegma
300
)溶于四氢呋喃（thf）中，制成20μg/ml的储备液。从储备液中取出20μl 加入到玛瑙池中，并加入10mg kbr，
然后碾碎使其混合均匀，将其制备成透明的薄片放入模具中进行测试，红外光谱如图1（b）所示，紫外吸收光谱如图1（c）所示，由图1（b）和图1（c）可知，荧光单体nap-lyso-mma成功接入到了聚合物中。
[0028]
实施例3：荧光聚合物poly (nap-lyso-mma-co-pegma
300
)的分子量测试将实施例1中制备的荧光聚合物poly (nap-lyso-mma-co-pegma
300
)溶于色谱纯级的四氢呋喃（thf）中，制成7.8 mg/ml的储备液。通过gpc进行分子量测试，测试结果由图2 可知，荧光聚合物poly (nap-lyso-mma-co-pegma
300
) 的数均分子量为21270，且pdi为1.766。
[0029]
实施例4：荧光聚合物poly (nap-lyso-mma-co-pegma
300
)在水中自组装的粒径以及形貌测试将实施例1中制备的荧光聚合物poly (nap-lyso-mma-co-pegma
300
) 5mg溶于1.0ml四氢呋喃（thf）中，加入10.0ml蒸馏水并快速搅拌，使其在水中实现自组装。通过dls和tem进行粒径和形貌的测试，如图3所示，荧光聚合poly(nap-lyso-mma-co-pegma
300
)可以在水中自组装成粒径大约250 nm 左右的球形纳米颗粒，并且分布比较均匀。
[0030]
实施例5：荧光聚合物poly (nap-lyso-mma-co-pegma
300
)在不同溶剂中的紫外吸收与荧光发射图谱测试与荧光聚合物poly (nap-lyso-mma-co-pegma
300
)在乙酸乙酯和甲醇不同比例混合溶剂中的荧光光谱从实施例2 中荧光聚丙烯酸酯储备液中取出20μl 加入比色皿中，用溶剂/pbs(1:1, v/v)稀释至2ml，测量其紫外和荧光性质。紫外光谱如图4（a）所示；荧光光谱如图4（b）所示。由图4（a）可见，聚丙烯酸酯poly (nap-lyso-mma-co-pegma
300
)在各溶剂中，最大吸收峰位于405nm左右，与荧光单体nap-lyso-mma的吸收峰一致，再一次证明了荧光单体被成功接入到聚合物中。另外，从图4（b）中可以看出，聚丙烯酸酯poly (nap-lyso-mma-co-pegma
300
)在不同极性溶剂中的荧光强度有所不同。从实施例2 中荧光聚丙烯酸酯储备液中取出20μl 加入比色皿中，用不同比例的乙酸乙酯与甲醇溶液稀释至2ml，测量其荧光性质。由图4（c）和4（d）可以发现，随着乙酸乙酯比例的增加，聚丙烯酸酯poly (nap-lyso-mma-co-pegma
300
) 的荧光强度也随之增加，即聚丙烯酸酯poly (nap-lyso-mma-co-pegma
300
)具有脂滴效应。
[0032]
图4中所述0%、 20% 、40%、 60%、 80% 、100%，是指乙酸乙酯在乙酸乙酯与甲醇混合溶剂中的体积占比。
[0033]
实施例6：荧光聚合物poly (nap-lyso-mma-co-pegma
300
)在不同条件下的荧光光谱从实施例2 中荧光聚合物储备液中取出20μl 加入比色皿中，用thf和具有不同ph的pbs(1:1, v/v)稀释至2ml，测量其荧光性质。从图5(a)中可以看出，聚丙烯酸酯poly (nap-lyso-mma-co-pegma
300
)在不同ph中的荧光强度基本不变，说明聚丙烯酸酯poly (nap-lyso-mma-co-pegma
300
)耐环境ph稳定性较强。
[0034]
从实施例2 中荧光聚丙烯酸酯储备液中取出20μl 加入比色皿中，用thf/pbs(1:1, v/v)稀释至2ml，加入后不同时间测量其荧光性质。从图5(b)中可以看出，聚丙烯酸酯poly (nap-lyso-mma-co-pegma
300
)的荧光强度随时间变化不大，说明聚丙烯酸酯poly(nap-lyso-mma-co-pegma
300
)的稳定性较强，适合应用于细胞成像领域。
[0035]
从实施例2 中荧光聚丙烯酸酯储备液中取出20μl 加入比色皿中，用thf/pbs(1:1, v/v)稀释至2ml，然后加入不同离子并测量其荧光性质。从图5(c)中可以看出，聚丙烯酸酯poly (nap-lyso-mma-co-pegma
300
)的荧光强度即使加入不同的离子也基本不变，说明聚丙烯酸酯poly (nap-lyso-mma-co-pegma
300
)对离子没有响应并且抗干扰能力强。
[0036]
图5c中1-17代表的离子如下：1: blank; 2: gsh; 3: cys; 4: arg; 5: ser; 6: cl-; 7: i-; 8: so
32-; 9: hclo; 10: h2o2; 11: fe
3+
; 12: fe
2+
; 13: cu
2+
; 14: al
3+
; 15: mg
2+
; 16: zn
2+
; 17: k
+
。
[0037]
测试液中离子浓度为500
µ
m。
[0038]
实施例7：不同浓度荧光聚合物poly (nap-lyso-mma-co-pegma
300
)的细胞毒性测试从实施例2 中荧光聚丙烯酸酯储备液中取出不同量以配制不同浓度的poly(nap-lyso-mma-co-pegma
300
)，然后通过mtt实验进行细胞毒性测试，从图6中可以看出，即使聚丙烯酸酯poly (nap-lyso-mma-co-pegma
300
)的浓度高达40 μg/ml，细胞活力仍能保持80%以上，说明聚丙烯酸酯poly (nap-lyso-mma-co-pegma
300
)具有良好的生物相容性，对于生物成像是极其有利的。
[0039]
实施例8：荧光聚合物poly (nap-lyso-mma-co-pegma
300
)应用于细胞成像将本荧光聚丙烯酸酯应用于hela细胞中的显像剂进行荧光成像应用（图7，图8，图9）具体操作步骤如下：a）将20μg/ml的荧光聚丙烯酸酯thf溶液加入到育有hela细胞的培养液中在二氧化碳培养箱中培养0.5 h，明场成像，可以看到细胞大致的轮廓；所述育有hela细胞的培养液，细胞浓度为20μg/ml；所述荧光聚丙烯酸酯thf溶液与hela细胞的培养液的体积比是1:100；b）将a）用蓝光进行激发得到成像图；c）将a）和b）图成像叠加。说明此荧光聚合物poly (nap-lyso-mma-co-pegma
300
)可以作为细胞显像剂用于荧光成像。另外通过溶酶体与脂滴亚细胞器共定位成像实验表明，该荧光聚合物poly (nap-lyso-mma-co-pegma
300
)可以同时实现对溶酶体和脂滴双亚细胞器的标记，对于理解它们之间的相互作用具有重要的意义。
[0040]
图8中,8a)-e)是荧光聚丙烯酸酯poly (nap-lyso-mma-co-pegma
300
)与溶酶体染色剂cy5共定位染色实验，为了验证荧光聚丙烯酸酯poly (nap-lyso-mma-co-pegma
300
)能否靶向溶酶体亚细胞器；图8中,8f)-j)是荧光聚丙烯酸酯poly (nap-lyso-mma-co-pegma
300
)与脂滴染色剂bodipy共定位染色实验，为了验证荧光聚丙烯酸酯poly (nap-lyso-mma-co-pegma
300
)能否靶向脂滴亚细胞器。