一种油基岩屑降解菌和复合菌剂及其培养方法和应用与流程

本发明涉及环境微生物，具体来讲，涉及一种油基岩屑降解菌、一种油基岩屑降解菌的筛分培养方法、一种油基岩屑降解菌的应用、一种包含油基岩屑降解菌的生物制剂、一种包含油基岩屑降解菌的生物制剂的应用、一种复合菌剂、一种复合菌剂的制备方法、一种复合菌剂的应用方法、一种包含复合菌剂的生物制剂、以及一种包含复合菌剂的生物制剂的应用。

背景技术：

1、页岩气开采过程中水平井必须使用稳定的流变性能、水损性能和润滑特性的油基钻井液，因此会产生油基钻井液和破碎地层岩屑组成的混合物—油基岩屑。随着近年的页岩气大开发，油基岩屑产量急剧增加，且油基岩屑的体系十分稳定，含油量高和污染物种类复杂等特点愈发引起国家关注，被列入《国家危险废物名录》。若油基岩屑混入土壤，将会导致土壤的组分和结构改变，土壤中的微生物和动植物急性或慢性中毒，更甚会影响地下水资源。并且，不断堆积的有毒有害物质最终会危害人类自身健康，因此，开展油基岩屑无害化处理研究意义重大。

2、目前国内油基岩屑处理主要依靠物理方法与化学方法，具体包括热处理法、溶剂萃取法、热蒸馏法、坑内密封掩埋法、汽提法等。但物理、化学的处理技术处理方法存在处理成本高、存在二次污染的风险。随着环保标准的不断提高及执法力度不断加强，急需低能耗、清洁、安全的低成本油基岩屑处理技术。油基岩屑的微生物处理将石油烃等复杂有机物转化为简单有机物，已成为现场油基钻屑安全处理和处置的重要手段，与物理与化学处理技术相比显出较大的优越性。

3、目前，微生物处理油基岩屑主要依赖于高效降解菌株的筛选，现有的菌株筛选主要集中为中温菌25～35℃，而高温降解菌的筛选有助于拓展不同温段的油基岩屑降解菌株库，适应不同处理环境需求。

4、例如，于2019年2月1日公开的名称为一种微生物降解总石油烃的方法、公开号为cn 109293001 a的专利文献记载了一种微生物降解总石油烃的方法，该方法包括如下步骤：首先将废弃油基钻井液底部沉积物经鼓风机风干，然后调节ph值到6～8，含水量不超过10％；在每千克固相沉积物中分别加入sq-1工程菌0.2～0.5g、sq-2工程菌0.1～0.4g、sq-3工程菌1～5ml，再加水使湿度达到20％；最后加入0.1～0.4g nhno和0.1～0.3g khpo，之后在24℃～31℃的温暖环境下处理50～60天，期间通过加水使固相沉积物的湿度维持在30％～40％。于2020年2月4日公开的名称为一种油基钻屑降解菌株及其应用、公开号为cn110747141 a的专利文献记载了一种油基钻屑降解菌株和它的应用，该菌株为芽孢杆菌(bacillus sp.)wj2019，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址：中国.武汉.武汉大学，保藏日期为2019年7月19日，保藏编号为cctcc no：m2019574。该菌株可以在常规条件下以油基钻屑作为唯一碳源进行生长，无需人为添加能源和碳源。因此该菌可以用于油基钻屑中的石油组分降解，在45天内对反排油含量为1200mg/kg的油基钻屑降解率可达到48.8％以上，具有除油效率高、处理周期短的显著优势。这些菌株虽然都对油基钻屑有一定的降解效果，但都只能适应中温环境，并不能在高温钻井液中存活。

5、因此，可进一步丰富油基岩屑高温降解菌株资源，提高油基岩屑微生物处理效率。

技术实现思路

1、本发明的目的在于解决现有技术存在的上述不足中的至少一项。例如，本发明的目的之一在于提供一种能够适应高温处理环境的油基岩屑高温降解菌株及其培养方法和应用。

2、为了实现上述目的，本发明一方面提供了一种油基岩屑降解菌，所述油基岩屑降解菌包括食螯合物菌、彼得里鲍特氏菌和嗜异生质菌中的至少一种，其中，所述食螯合物菌的分类名为食螯合物菌chelativorans sp.sh6-2，其保藏编号为cctcc no：m 2021290；所述彼得里鲍特氏菌的分类名为彼得里鲍特氏菌bordetella petrii wocb-20，其保藏编号为cctcc no：m 20211089；所述嗜异生质菌的分类名为嗜异生质菌xenophilus aerolatuswocb-11，其保藏编号为cctcc no：m 20211088。

3、在本发明的油基岩屑降解菌的一个示例性实施例中，所述食螯合物菌可为革兰氏阴性菌，无芽孢，菌体为杆状，有运动性，专性需氧；

4、所述彼得里鲍特氏菌可为革兰氏阴性菌，有运动性，菌体呈杆状，不产孢子；

5、所述嗜异生质菌可为革兰氏阴性菌，有运动性，菌体呈杆状，不产孢子。

6、在本发明的油基岩屑降解菌的一个示例性实施例中，所述食螯合物菌在胰蛋白胨大豆琼脂培养基上培养24h后形成的菌落可为圆形，48h后菌落为圆形，无色，直径为0.5～1mm，边缘整齐，扁平湿润；

7、所述彼得里鲍特氏菌在牛肉膏蛋白胨培养基上培养24h后形成的菌落可为圆形，48h后菌落为圆形，白色，直径为0.5～1mm，边缘整齐，扁平湿润；

8、所述嗜异生质菌在牛肉膏蛋白胨培养基上培养24h后形成的菌落可为圆形，48h后菌落为圆形，淡黄色，直径为1～2mm，边缘整齐，扁平湿润。

9、在本发明的油基岩屑降解菌的一个示例性实施例中，所述食螯合物菌的16s rdna序列可如seq id no.1所示；

10、所述彼得里鲍特氏菌的16s rdna序列可如seq id no.2所示；

11、所述嗜异生质菌的16s rdna序列可如seq id no.3所示。

12、在本发明的油基岩屑降解菌的一个示例性实施例中，所述食螯合物菌的生长温度范围可为30～65℃，所述彼得里鲍特氏菌的生长温度范围可为4～45℃，所述嗜异生质菌的生长温度范围可为4～45℃。

13、本发明另一方面提供了一种油基岩屑降解菌的筛分培养方法，所述筛分培养方法包括以下步骤：

14、s1、向一份油基岩屑样品中加入菌源样品，并放置在25～60℃和/或50～60℃条件下恒温培养15d～30d后，获得第一代富集菌源，所述菌源样品包括自然土、淤泥和石油污染的土壤；

15、s2、向另一份油基岩屑样品加入第一代富集菌源，并放置在25～60℃和/或50～60℃的条件下恒温培养7d～14d，获得第一培养液；

16、s3、将第一培养液放置在25～60℃和/或50～60℃的条件下恒温培养7d～14d，获得第二培养液；

17、s4、重复步骤s2至少两次，获得经多次转样培养后的富集菌样品；

18、s5、将富集菌样品的稀释液涂布在胰蛋白胨大豆琼脂培养基上，50～60℃恒温培养，经重复划线培养后获得纯化后的食螯合物菌株；和/或，

19、将富集菌样品的稀释液涂布在牛肉膏蛋白胨培养基上，25～30℃恒温培养，经重复划线培养后获得纯化后的彼得里鲍特氏菌株和嗜异生质菌株。

20、本发明再一方面提供了一种如上所述的油基岩屑降解菌或其菌悬液或其培养液或其发酵产物在降解石油污染物或者钻井泥浆中油基岩屑的应用。

21、本发明再一方面提供了一种含油基岩屑降解菌的生物制剂，所述含油基岩屑降解菌的生物制剂包括如上所述的油基岩屑降解菌或其菌悬液或其培养液或其发酵产物。

22、本发明再一方面提供了一种如上所述的含油基岩屑降解菌的生物制剂在降解石油污染物或者钻井泥浆中油基岩屑的应用。

23、本发明再一方面提供了一种复合菌剂的制备方法，所述制备方法包括：将食螯合物菌与彼得里鲍特氏菌和/或嗜异生质菌混合，获得复合菌剂；

24、其中，所述食螯合物菌的活菌数为总活菌数的10％～90％；

25、所述彼得里鲍特氏菌的活菌数为总活菌数的0％～90％；

26、所述嗜异生质菌的活菌数为总活菌数的0％～90％。

27、在本发明的复合菌剂的制备方法的一个示例性实施例中，所述食螯合物菌的活菌数可为总活菌数的40％～60％；

28、所述彼得里鲍特氏菌的活菌数可为总活菌数的20％～30％；

29、所述嗜异生质菌的活菌数可为余量。

30、本发明再一方面提供了一种复合菌剂，所述复合菌剂采用如上所述的制备方法制备获得，所述复合菌剂能够在10～65℃的温度环境下对油基岩屑进行降解。

31、本发明再一方面提供了一种如上所述的复合菌剂在降解油基岩屑和/或油基岩屑污染的土壤或水中的应用方法。

32、在本发明的复合菌剂的应用方法的一个示例性实施例中，所述应用方法包括：将上述的复合菌剂按质量浓度0.3％～3％接种到油基岩屑和/或油基岩屑污染的土壤或水中。

33、本发明再一方面提供了一种含复合菌剂的生物制剂，所述含复合菌剂的生物制剂包括如上所述的复合菌剂或其菌悬液或其培养液或其发酵产物。

34、本发明再一方面提供了一种如上所述的含复合菌剂的生物制剂在降解石油污染物或者钻井泥浆中油基岩屑的应用。

35、与现有技术相比，本发明的有益效果包括以下内容中的至少一项：

36、(1)本发明提供的食螯合物菌chelativorans sp.sh6-2、彼得里鲍特氏菌bordetella petrii wocb-20和嗜异生质菌xenophilus aerolatus wocb-11能够有效甚至高效地降解石蜡油、油基岩屑(泥浆)；也能够有效甚至高效地修复油基岩屑(泥浆)造成的污染，例如，被油基岩屑(泥浆)所污染的土壤或水；

37、(2)纯培养条件下，接菌培养14d后，食螯合物菌chelativorans sp.sh6-2、彼得里鲍特氏菌bordetella petrii wocb-20和嗜异生质菌xenophilus aerolatus wocb-11对石蜡油中的石油烃的降解率达46.55％、40.77％和45.33％以上；

38、(3)食螯合物菌chelativorans sp.sh6-2具有较强耐温性，彼得里鲍特氏菌bordetella petrii wocb-20和嗜异生质菌xenophilus aerolatus wocb-11生长温度范围广，可作为优良降解菌用于宽温(温度范围为10～65℃)的油基岩屑(泥浆)的生物处理，应用前景良好；

39、(4)将食螯合物菌chelativorans sp.sh6-2、彼得里鲍特氏菌bordetella petriiwocb-20和嗜异生质菌xenophilus aerolatus wocb-11按预定比例混合制得的复合菌剂能够高效快速的降解去除环境中的石油烃；

40、(5)纯培养条件下，将复合菌剂按质量浓度0.3～3％的量接种到油基岩屑中60d后，对石油烃的降解率可达80％以上。