宫颈癌原代细胞的培养基和培养方法与流程

本发明属于医药，具体而言，涉及用于在体外培养或扩增宫颈癌原代细胞的培养基及培养方法。

背景技术：

1、据世界卫生组织下属国际癌症研究机构(iarc)发布的2018年最新全球癌症统计数据《全球癌症报告》显示2018年全球新增1810万例癌症病例，死亡人数达960万，全球癌症负担进一步加重。2018年中国癌症发病率top10为乳腺癌、肺癌、结肠直肠癌、甲状腺癌、胃癌、宫颈癌、肝癌、食管癌、子宫癌、脑癌。其中，宫颈癌女性发病率第6位。每年全球死于宫颈癌的妇女有20万，中国占10％左右。由于宫颈癌发病的分子机制尚不明确，针对宫颈癌尤其是中晚期患者的治疗手段仍然有限，导致临床上患者五年生存率较低，缺乏个性化的精准用药指导。

2、功能性测试是指在体外对抗肿瘤药物在癌症患者细胞上的敏感性进行检测的方法。应用这一方法的关键在于开发生长周期短且能够代表宫颈癌患者自身生物学特性的肿瘤细胞模型。另外，所述细胞模型应操作便捷且能快速高效地预测临床用药的疗效，从而及时给予癌症患者精准用药指导。然而，取自癌症患者的原代肿瘤细胞在体外建立细胞模型成功率往往很低，生长周期长，并存在成纤维细胞等间质细胞过度增殖等问题，制约着这一领域的发展。目前有两种培养原代细胞/干细胞的技术在肿瘤细胞功能性测试应用领域发展得相对成熟，一种是使用经辐射的滋养细胞和rock激酶抑制剂来促进原代细胞的生长以考察个体患者的药物敏感性的技术，即细胞条件重编程技术(liu等，am.j.pathol.，180：599-607，2012)。另一种技术是体外3d培养成体干细胞从而获得类似于组织器官的类器官技术(hans clevers等，cell，11，172(1-2)：373-386，2018)。

3、然而，类器官技术是将患者自体原代细胞包埋在细胞外基质内进行体外三维立体培养的技术，但是该技术的培养基内需添加多种特定的生长因子(如wnt蛋白和r-spondin家族蛋白)，成本昂贵，不适于普及到临床进行大规模应用。另外，类器官在整个培养过程中均需将细胞包埋在细胞外基质胶中，其细胞接种、传代和药物敏感性测试的铺板步骤相较于2d培养操作繁琐费时，且该技术所形成的类器官大小尺寸不好控制，易出现部分类器官生长过大而导致内部发生坏死的情况。因此，类器官技术相较于2d培养技术可操作性和适用性不强，需要专业技术人员操作，不适合大规模广泛应用于临床体外药物敏感性检测(nick barker，nat.cell biol.，18(3)：246-54，2016)。

4、细胞重编程技术是一种将患者自体原代细胞与鼠源性饲养细胞共培养的技术，但是在文献中未见报道针对宫颈癌样本进行测试，故文献报道的培养基成分对宫颈癌原代肿瘤细胞是否能够快速的扩增还未可知。

5、鉴于以上技术的局限性，临床上需要开发一种宫颈癌原代细胞培养技术，其培养周期短，成本可控，操作便捷，在将该技术应用于构建原代宫颈癌肿瘤细胞模型时，所培养的宫颈癌肿瘤细胞能代表宫颈癌患者自身的生物学特性。通过体外评估抗肿瘤药物在不同癌症患者个体所衍生的细胞模型上的敏感性，来提高临床上抗肿瘤药物的响应率，减少不合适的药物给患者造成的痛苦及医疗资源的浪费。

技术实现思路

1、本发明旨在针对现有技术的不足，提供一种用于培养宫颈癌原代细胞的培养基以及使用该培养基培养宫颈癌原代细胞的方法。采用本发明的宫颈癌原代细胞培养基和培养方法，能够达到体外培养周期短、成本可控、操作便捷的目的。在该技术应用于构建原代宫颈癌肿瘤细胞模型时，能够获得具有宫颈癌患者自身生物学特性的原代宫颈癌肿瘤细胞，并能够应用于新药筛选和体外药物敏感性检测。

2、本发明的一个方面在于提供一种用于培养宫颈癌原代细胞的原代细胞培养基，其含有mst1/2激酶抑制剂；胰岛素样生长因子1；成纤维细胞生长因子7；胰岛素-转铁蛋白-硒复合物；肝细胞生长因子；选自y27632、法舒地尔、和h-1152中的至少一种的rock激酶抑制剂；和碘塞罗宁，所述mst1/2激酶抑制剂包括式(i)的化合物或其药学可接受的盐、或溶剂化物。

3、

4、其中，

5、r1选自c1-c6烷基、c3-c6环烷基、c4-c8环烷基烷基、c2-c6螺环烷基、以及任选地被1-2个独立地r6取代的芳基(例如苯基和萘基等)、芳基c1-c6烷基(例如苯甲基等)和杂芳基(例如噻吩基等)；

6、r2和r3各自独立地选自c1-c6烷基，优选c1-c3烷基，更优选甲基；

7、r4和r5各自独立地选自氢、c1-c6烷基、c3-c6环烷基、c4-c8环烷基烷基、c1-c6烷基羟基、c1-c6卤代烷基、c1-c6烷基氨基c1-c6烷基、c1-c6烷氧基c1-c6烷基、和c3-c6杂环基c1-c6烷基(所述杂环基选自例如哌啶基、四氢吡喃基等)；

8、r6选自卤素(优选氟和氯，更优选氟)、c1-c6烷基(优选甲基)、c1-c6烷氧基(优选甲氧基)、和c1-c6卤代烷基(优选三氟甲基)。

9、优选的实施方式中，mst1/2激酶抑制剂包括式(ia)的化合物或其药学可接受的盐、或溶剂化物，

10、

11、其中，

12、r1选自c1-c6烷基、任选地被1-2个独立地r6取代的苯基、任选地被1-2个独立地r6取代的噻吩基、和任选地被1-2个独立地r6取代的苯甲基，r1更优选为任选地被1-2个独立地r6取代的苯基；

13、r5选自氢、c1-c6烷基、和c3-c6环烷基，r5更优选为氢；

14、r6各自独立地选自卤素、c1-c6烷基、和c1-c6卤代烷基，r6更优选为氟、甲基或三氟甲基。

15、优选地，所述mst1/2抑制剂是选自以下化合物或其药学可接受的盐、或溶剂化物中的至少一种。

16、

17、

18、

19、

20、

21、最优选地，本发明的mst1/2激酶抑制剂为化合物1。

22、在本发明的实施方式中，mst1/2激酶抑制剂在培养基中的含量通常为2μm～20μm，优选为5μm～20μm，更优选为5μm。

23、本发明的原代细胞培养基优选还含有以下因子中的一种或多种：胰岛素样生长因子1(igf-1)；成纤维细胞生长因子7(fgf7)；胰岛素-转铁蛋白-硒复合物(its)；肝细胞生长因子(hgf)；碘塞罗宁；选自y27632、法舒地尔、和h-1152中的至少一种的rock激酶抑制剂。其中，在优选的实施方式中，所述成纤维细胞生长因子7在培养基中的含量优选为2～40ng/ml，更优选10～40ng/ml；胰岛素-转铁蛋白-硒复合物相对于培养基的体积比优选为1:100～1:25；所述胰岛素样生长因子1的含量优选为2～40ng/ml，更优选为10～40ng/ml；所述肝细胞生长因子的含量优选为2～40ng/ml，更优选为10～40ng/ml；所述碘塞罗宁的含量优选为2～50nm，更优选为2～10nm；所述rock激酶抑制剂优选为y27632，且rock激酶抑制剂的含量优选为2～20μm，更优选为2～10μm。

24、该培养基配方成分与细胞条件重编程培养基和类器官培养基成分相比，添加了mst1/2激酶抑制剂，但不包含血清、牛垂体提取物等不确定成分，也不包含wnt激动剂、r-spondin家族蛋白、bmp抑制剂等类器官培养所必须的龛因子，并且不包含烟酰胺和n-乙酰半胱氨酸，从而大大降低了培养基的成本，简化了配制培养基的操作流程，实现了成本可控和操作便捷的宫颈癌原代细胞的体外培养。

25、本发明中，宫颈癌原代细胞可以为宫颈癌肿瘤细胞、正常宫颈癌原代细胞、宫颈癌上皮干细胞。

26、本发明的一个方面在于提供一种宫颈癌原代细胞的培养方法，其包括以下步骤：

27、(1)按上述配方配制本发明的原代细胞培养基；

28、(2)使用辐照后的滋养细胞预铺培养容器。

29、具体地，所述的滋养细胞例如可以为辐照后的nih-3t3细胞，辐照源为x射线或者γ射线，优选为γ射线，辐照剂量为30～50gy，优选为35gy，辐照时间为5～20分钟。具体地，将辐照后的nih-3t3细胞按照2～5×104个/cm2接种在培养容器例如48孔板、24孔板、12孔板、6孔板或者t25细胞培养瓶中，待细胞贴壁后备用。

30、(3)从宫颈癌组织分离得到宫颈癌原代细胞。

31、宫颈癌原代细胞例如可以来源于宫颈癌组织样本和癌旁组织样本。宫颈癌组织样本例如来源于进行过说明并获得同意的宫颈癌肿瘤患者手术切除的癌组织样本，癌旁组织样本采集自离宫颈癌组织距离至少5cm以上的组织。在患者手术切除后的半小时内进行上述组织样本的收集。更具体而言，在无菌环境下，切取非坏死部位的组织样本，其体积在0.5cm3以上，将其置于预冷的3-5ml dmem/f12培养基中，培养基盛在塑料无菌带盖离心管内，冰上运输至实验室；其中，dmem/f12培养基中含有1-2体积％青霉素/链霉素、和/或0.2-0.4体积％primocin(以下简称组织运输液)。当使用链霉素/青霉素时，链霉素浓度范围为25～400μg/ml，优选为50～200μg/ml，更优选为200μg/ml，青霉素浓度范围为25～400u/ml，优选为50～200u/ml，更优选为200u/ml；当使用primocin时，浓度范围为25～400μg/ml，优选为50～200μg/ml，更优选为100μg/ml。

32、在生物安全柜内，将组织样本转移至细胞培养皿内，用运输液润洗组织样本，将组织样本表面的血细胞清洗掉。将润洗后的组织样本转移至另一个新的培养皿内，加入1-3ml运输液，用无菌手术刀片和手术镊将组织样本分割为体积小于3mm3的组织碎块。

33、将组织样本碎块转移至离心管内，用台式离心机(sigma公司3-18k)以1000～3000转/分钟离心3～5分钟；弃上清，按1:1比例加入组织运输液和组织消化液(使用量约为每10mg组织使用5ml组织消化液，其中组织消化液的配制方法为：将1～2mg/ml胶原酶ⅱ、1～2mg/ml胶原酶ⅳ、50～100u/ml脱氧核糖核酸ⅰ、0.5～1mg/ml透明质酸酶、0.1～0.5mg/ml氯化钙、5～10mg/ml牛血清白蛋白溶于体积比1:1的hbss和rpmi-1640中)，标记样本编号，封口膜密封，以37℃、200～300转恒温摇床(知楚仪器zqly-180n)消化，每间隔1小时观察消化是否完成；若未见明显组织块即可终止消化，否则继续消化，直至消化充分，消化时间范围为4～8小时。消化完成后，细胞滤网(细胞筛孔径为例如70μm)过滤掉未消化的组织团块，滤网上的组织团块用组织运输液冲洗，将残留细胞冲入离心管中，用台式离心机以1000～3000转/分钟离心3～5分钟。弃上清，观察剩余细胞团是否含有血细胞，若有血细胞，加1～5ml血细胞裂解液(购自sigma公司)，混匀，4℃裂解10～20分钟，5分钟摇晃混匀一次，裂解结束后取出，以1000～3000转/分钟离心3～5分钟。弃上清，加入本发明的原代细胞培养基重悬，使用流式图像计数仪(江苏卓微生物科技有限公司jimbio fil)进行计数，得到细胞总数。

34、(4)在预接种有滋养细胞的培养器皿内接种步骤(3)中分离得到的原代宫颈癌原代细胞，并采用步骤(1)中的原代细胞培养基进行培养。

35、更具体而言，待滋养细胞贴壁后，按2×104～8×104个/cm2(例如4×104个/cm2)的密度接种原代宫颈癌肿瘤细胞，每孔加入0.5～2ml原代细胞培养基，在例如37℃、5％co2的条件下于细胞培养箱中培养8-16天，期间每4天换成新鲜的原代细胞培养基，在宫颈癌原代细胞长至占多孔板底面积80％～90％左右的细胞密度时进行消化传代。

36、该步骤相比类器官技术，无需在冰上将原代细胞和基质胶混匀后形成胶滴，并等待胶滴凝固后加入培养基。此外，还节约了价格昂贵的细胞外基质胶的使用量，简化了操作步骤。

37、任选地，接种后的宫颈癌原代细胞在培养8～16天后，当培养容器内形成的细胞克隆汇合达到底面积80％，弃去上清，加入1～2ml0.25％胰酶(购自thermo fisher公司)消化1分钟，随后吸出0.25％胰酶，再加入1～2ml 0.05％胰酶进行细胞消化，室温下孵育5～20分钟；然后用含有例如5％(v/v)胎牛血清、100u/ml青霉素和100μg/ml链霉素的培养液2～4ml重悬消化处理后的细胞，以1000～3000转/分钟离心3～5分钟，使用本发明的原代细胞培养基将消化后的单细胞重悬，将所得到的细胞悬液置入预铺有滋养细胞的培养器皿中继续扩大培养。培养器皿的预处理操作同步骤(2)。

38、扩增的宫颈癌原代细胞呈2d生长，避免了类器官技术扩增出现的类器官大小不均一和生长过大的类器官出现内部坏死等情况。

39、本发明还提供一种用于评估或筛选治疗宫颈癌疾病的药物的方法，其包括以下步骤：

40、(1)使用本发明的宫颈癌原代细胞的培养方法培养宫颈癌原代细胞；

41、(2)选定需要检测的药物并按照所需浓度梯度进行稀释；

42、(3)对(1)中培养得到的宫颈癌原代细胞添加稀释后的所述药物；

43、(4)进行细胞活性测试。

44、本发明的有益效果还包括：

45、(1)提高宫颈癌原代细胞培养的成功率，成功率达到85％以上；

46、(2)保证体外培养的宫颈癌原代细胞能够保持原代细胞来源病人的病理表型和异质性；

47、(3)培养基成分不含血清，所以不受不同批次血清质量和数量的影响；

48、(4)扩增宫颈癌原代细胞效率高，只要有104级别的细胞数量就可在两周左右时间内成功扩增出106数量级的宫颈癌原代细胞，扩增出的宫颈癌原代细胞还可以连续传代；

49、(5)传代步骤无需冰上操作和解离基质胶，10-15分钟内即可完成细胞的消化传代；

50、(6)培养成本可控，宫颈癌原代细胞培养基无需加入价格昂贵的wnt激动剂、r-spondin家族蛋白、bmp抑制剂等因子，节约了细胞培养的成本；

51、(7)操作便捷，该技术相比类器官技术，无需像类器官技术一样将细胞包埋于基质胶内，所述技术操作步骤简便易行；

52、(9)所述技术培养获得的宫颈癌原代细胞数量大，均一化程度高，适合高通量筛选新候选化合物，并为病人提供高通量药物体外敏感性功能测试。

53、采用本实施方式的细胞培养基，可培养来源于包括人或其他哺乳动物的宫颈癌原代细胞，包括宫颈癌肿瘤细胞、正常宫颈癌原代细胞、宫颈癌上皮干细胞、或者包含这些细胞中的至少任一种的组织。同时，本发明技术的培养基还可以用于开发体外宫颈癌原代细胞扩增培养的试剂盒。

54、另外，通过本实施方式的培养方法获得的细胞可应用于再生医疗、宫颈癌原代细胞的基础医学研究、药物应答的筛选、以及来源于宫颈癌疾病的新药研发等。