一种与顺-冷衫醇基因qAbl紧密连锁的共显性SSR分子标记及其应用的制作方法

一种与顺-冷衫醇基因qabl紧密连锁的共显性ssr分子标记及其应用
技术领域
1.本发明涉及分子遗传育种技术领域，具体涉及一种与顺-冷衫醇基因qabl紧密连锁的共显性ssr分子标记及其应用。


背景技术：

2.冷衫醇(abienol)是植物体表尤其是叶表面分泌的一种具有香气的萜类化合物。迄今，存在于自然界中的冷衫醇均为顺-冷衫醇(cis-abienol)，尚未有反式-冷衫醇的相关报道。烟草中的顺-冷衫醇主要为赖百当类萜醇，其既是烟草叶片表面腺毛分泌物的主成分，也是重要的烟草香气前体物。早期针对烟草中顺-冷衫醇的遗传研究表明，顺-冷衫醇属于质量性状且受显性单基因(abl)控制(tomitah,satom,kawashima n.inheritance of labdanoid producing ability in nicotiana tabacum.agric biol chem,1980,44:2517-2518；kubot,satom,tomitah.identificationofthechromosomecarryingthegenefor cis-abienolproductionbythe useofmonosomicsinnicotianatabacuml.tobint.,1982,184(23):57-59.)。基于此，利用烟草加倍单倍体(dh)群体，vontimitta等将雪茄烟品种beinhart1000中控制香气品质的蔗糖酯基因(bmvse)和顺-冷衫醇基因(abl)定位在第15号连锁群上，且控制上述两个性状的基因间遗传距离约为9cm，针对顺-冷衫醇基因(abl)则被定位于ssr标记pt61373和pt55091之间约2.6cm，而标记pt10324则定位在顺-冷衫醇基因(abl)上，即，与abl呈共分离(vontimitta v,danehower d a,steede t,moon h s,lewis r s,analysis of a nicotiana tabacum l.genomic region controlling two leaf surface chemistry traits.journal of agricultural and food chemistry,2010,58:294-300.)。随着对顺-冷衫醇合成途径的不断深入研究，sallaud等在2012年从香料烟基因组中成功克隆了2个控制烟草顺-冷衫醇合同途径中的关键基因(ntabs和ntcps2)，并通过互补实验进一步证实了ntabs基因和ntcps2基因共同编码了烟草中顺-冷衫醇的合成，但作者也阐明了除上述2个基因外，仍存在其他基因对合成烟草中顺-冷衫醇起作用(sallaud c,giacalone c,topfer r,goepfert s,bakaher n,rosti s and tissier a.characterization of two genes for the biosynthesis of thelabdane diterpene z-abienol in tobacco(nicotiana tabacum)glandular trichomes.the plant journal,2012,72:1
–
17.)。由此可知，烟草中的顺-冷衫醇性状是由显性多基因控制，并非早期研究报道的由单基因控制(tomitah,satom,kawashima n.inheritance of labdanoid producing ability in nicotiana tabacum.agric biol chem,1980,44:2517-2518；kubot,satom,tomitah.identificationofthechromosomecarryingthegenefor cis-abienolproductionbytheuseofmonosomicsinnicotianatabacuml.tobint.,1982,184(23):57-59；vontimitta v,danehower d a,steede t,moon h s,lewis r s,analysis of a nicotiana tabacum l.genomic region controlling two leaf surface chemistry traits.journal of agricultural and food chemistry,2010,58:294-300.)。另一方面，
单纯利用顺-冷衫醇合成途径中的ntabs基因或/和ntcps2基因进行顺-冷衫醇的检测均是不严谨的，因其存在漏检的巨大风险(sallaud c,giacalone c,topfer r,goepfert s,bakaher n,rosti s and tissier a.characterization of two genes for the biosynthesis of thelabdane diterpene z-abienol in tobacco(nicotiana tabacum)glandular trichomes.the plant journal,2012,72:1
–
17；王国平.烟草冷衫醇合成基因功能分析及功能标记开发.中国农业科学院烟草研究院,2016,pp4-5.)。此外，为了实现利用分子标记辅助选择(mas)培育具含顺-冷衫醇而具有高香气品质的烟草新品系，常爱霞等基于顺-冷衫醇合成途径中关键基因ntcps2序列，开发了检测烟草中是否存在顺-冷衫醇的snp标记，并获得授权专利(常爱霞,王元英,王国平,刘旦,杨爱国,孙惠青,曹建敏,李义强,罗成刚,冯全福,刘贯山.检测烟草冷衫醇合成关键基因ntcps2单核苷酸突变的特异引物及检测方法.授权公告号cn105177162b.)。显而易见，利用该专利提供的snp标记只能对烟草中是否含有ntcps2基因进行检测，而不能用于检测待测烟草植株中是否存在顺-冷衫醇，因控制烟草中顺-冷衫醇合成的基因并非只有ntcps2一个，故此存在极高的检测假阴性(即，待测烟株中即使无ntcps2检出，仍有极大概率含顺-冷衫醇)。上述缺陷或错误，严重地制约了利用与顺-冷衫醇基因qabl紧密连锁标记开展高香气烟草新品种的选育进程。
3.鉴于上述情况，有必要研究一种与顺-冷衫醇基因qabl紧密连锁的共显性ssr分子标记及其应用以解决上述技术问题。


技术实现要素：

4.本发明的第一个目的在于提供一种与顺-冷衫醇基因qabl紧密连锁的共显性ssr分子标记，本发明的第二个目的在于提供与顺-冷衫醇基因qabl紧密连锁的共显性ssr分子标记的应用。本发明旨在利用与顺-冷衫醇基因qabl紧密连锁标记加速选育高香气品质烟草新品种进程。
5.为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
6.本发明的第一个目的是这样实现的，一种与顺-冷衫醇基因qabl紧密连锁的共显性ssr分子标记，所述与顺-冷衫醇基因qabl紧密连锁的共显性ssr分子标记的编号为tmc43307和tmc43341，其pcr扩增产物核苷酸序列分别由seq id no.1和seq id no.2、seq id no.3和seq id no.4所示。
7.优选地，所述tmc43307和tmc43341对应的引物序列分别为：
8.tmc43307引物序列为：
9.tmc43307f：5
’‑
atggcgtacaaccctatcca-3’，
10.tmc43307r：5
’‑
ctgcacgtcacatcgagttt-3’；
11.tmc43341引物序列为：
12.tmc43341f：5
’‑
atggaaaacctcgtgcactt-3’，
13.tmc43341r：5
’‑
gacggatcttccgttgacat-3’。
14.本发明的第二个目的是这样实现的，与顺-冷衫醇基因qabl紧密连锁的共显性ssr分子标记的应用，所述与顺-冷衫醇基因qabl紧密连锁的共显性ssr标记在检测烟草基因组dna中是否存在顺-冷衫醇基因qabl中的应用。
15.优选地，以所述tmc43307序列的引物tmc43307f、tmc43307r和所述tmc43341序列
的引物tmc43341f、tmc43341r分别扩增待检测烟草基因组dna，检测pcr扩增产物；
16.如果pcr扩增产物中同时含有如seq id no.1和seq id no.3所示序列则表明该待测烟草植株含有高香气品质的顺-冷衫醇的纯合等位基因，基因型记为aa；
17.如果pcr扩增产物中同时含有如seq id no.2和seq id no.4所示序列则为待测烟草植株不含顺-冷衫醇的纯合等位基因，基因型记为aa；
18.如果pcr扩增产物中含有如seq id no.1和seq id no.2所示序列，或含有如seq id no.3和seq id no.4所示序列，或含有如seq id no.1、seq id no.3和seq id no.4所示序列，或含有如seq id no.3、seq id no.1和seq id no.2所示序列即为含有顺-冷衫醇的杂合等位基因，基因型记为aa。
19.综上所述，相比于现有技术，本发明的有益效果在于：
20.1、本发明为了简捷、高效选择具有高香气品质潜力的含顺-冷衫醇烟草品种，有针对性和特异性的选择含顺-冷衫醇基因qabl的后代材料，本发明提供一种用于检测顺-冷衫醇基因qabl的分子标记tmc43307和tmc43341，该分子标记采用数量性状连锁分析(qtl)法和超高液相色谱-紫外(uplc-uv)法，在烟草全基因组范围内筛选获得与顺-冷衫醇基因qabl基因连锁的共显性ssr标记，可用于顺-冷衫醇基因qabl的辅助选择，以提高分子标记辅助选择的效率及具有高香气品质烟草品种选育的效率。
21.2、本发明以高顺-冷衫醇含量的雪茄烟品种beinhart1000-1与不含顺-冷衫醇的烤烟品种红花大金元(综合性状优良)为亲本，通过杂交、连续套袋自交，构建的烟草重组自交系(rils_f
7:8
)为作图群体，采用数量性状连锁分析(qtl)法和超高液相色谱-紫外(uplc-uv)法，在烟草全基因组范围内筛选获得与顺-冷衫醇基因qabl紧密连锁的共显性ssr标记，以加速分子标记辅助选择(mas)在烟草高香气品种选育中的精准、高效利用。
22.3、本发明提供了的一种用于检测顺-冷衫醇基因qabl的分子标记，与文献报道的标记检测烟草顺-冷衫醇含量相比，本发明所述分子标记可准确的鉴别待测烟草中是否含有顺-冷衫醇，且相较于文献报道的标记具有更高的检测准确度，其有效纠正并弥补了文献中利用基因ntcps2检测烟草顺-冷衫醇的错误与不足；与现有的采用低通量、高成本、耗时费力的uplc-uv法检测烟草顺-冷衫醇含量相比，本发明所述的共显性ssr标记具有高效、稳定、可靠、简捷和低成本的特点，且可在烟草生长的任何时期进行检测，极大的缩短了实验周期，进而加速了选育高香气品质烟草新品种进程。
23.4、本发明通过采用共显性ssr标记，具有精准、高效、稳定、便捷和低成本的特点，因此该分子标记可以作为烟草高香气品质育种中qabl基因分子标记辅助选择的应用。
附图说明
24.图1是本发明基于烟草重组自交系群体(rils_f
7:8
；红花大金元
×
beinhart1000-1)的第15号连锁群上顺-冷衫醇qtl分析曲线图。
具体实施方式
25.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。以下对至少一个示例性实施例的描述实际上仅仅是说明性的，决不作为对本发明及其应用或使
用的任何限制。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有开展创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
26.本发明提供一种与顺-冷衫醇基因qabl紧密连锁的共显性ssr分子标记，所述与顺-冷衫醇基因qabl紧密连锁的共显性ssr分子标记的编号为tmc43307和tmc43341，其pcr扩增产物核苷酸序列分别由seq id no.1和seq id no.2、seq id no.3和seq id no.4所示。
27.所述tmc43307和tmc43341对应的引物序列分别为：
28.tmc43307引物序列为：
29.tmc43307f：5
’‑
atggcgtacaaccctatcca-3’(seq id no.5)，
30.tmc43307r：5
’‑
ctgcacgtcacatcgagttt-3’(seq id no.6)；
31.tmc43341引物序列为：
32.tmc43341f：5
’‑
atggaaaacctcgtgcactt-3’(seq id no.7)，
33.tmc43341r：5
’‑
gacggatcttccgttgacat-3’(seq id no.8)。
34.本发明还提供与顺-冷衫醇基因qabl紧密连锁的共显性ssr分子标记的应用，所述与顺-冷衫醇基因qabl紧密连锁的共显性ssr标记在检测烟草基因组dna中是否存在顺-冷衫醇基因qabl中的应用。
35.以所述tmc43307序列的引物tmc43307f、tmc43307r和所述tmc43341序列的引物tmc43341f、tmc43341r分别扩增待检测烟草基因组dna，检测pcr扩增产物。
36.如果pcr扩增产物中同时含有如seq id no.1和seq id no.3所示序列则表明该待测烟草植株含有高香气品质的顺-冷衫醇的纯合等位基因，基因型记为aa。
37.如果pcr扩增产物中同时含有如seq id no.2和seq id no.4所示序列则为待测烟草植株不含顺-冷衫醇的纯合等位基因，基因型记为aa。
38.如果pcr扩增产物中含有如seq id no.1和seq id no.2所示序列，或含有如seq id no.3和seq id no.4所示序列，或含有如seq id no.1、seq id no.3和seq id no.4所示序列，或含有如seq id no.3、seq id no.1和seq id no.2所示序列即为含有顺-冷衫醇的杂合等位基因，基因型记为aa。
39.下面以具体实施例对本发明做进一步说明。
40.实施例1：
41.本实施例1采用数量性状连锁分析(qtl)法并结合超高液相色谱-紫外(uplc-uv)法，在烟草全基因组范围内筛选与顺-冷衫醇基因qabl连锁的共显性ssr标记。
42.1.1实验材料
43.以综合性状优良且不含顺-冷衫醇的烤烟品种红花大金元为母本，以含顺-冷衫醇的雪茄烟品种beinhart1000-1为父本，经杂交、连续自交，获得341份株系的重组自交系(rils_f
7:8
)作为遗传作图群体。
44.1.2亲本及rils_f
7:8
群体顺-冷衫醇含量数据获得
45.试验材料成苗后移栽至大田，待大田烟叶成熟并采摘、烘烤后，按照文献报道的uplc-uv法(付秋娟,杜咏梅,王爱华,刘艳华,韩晓,张晓敬.超高液相色谱法测定烟草中顺-冷衫醇.烟草科技,2020,53(11):64-68.)进行烟草顺-冷衫醇含量检测。经uplc-uv法检测获得的341份rils_f
7:8
顺-冷衫醇含量作为rils_f
7:8
群体的表型值，用于下一步的qtl连锁
分析。
46.1.3ssr标记分析
47.烟草基因组dna提取：采用常规ctab法或植物组织dna提取试剂盒均可，方法可参考已有的文献或试剂盒中的说明书。
48.pcr扩增及电泳检测：pcr扩增体系为20μl，其中包含2.0μl的10
×
buffer(10mmol/l tris-cl,ph＝8.4,50mmol/l kcl,1.5mmol/l mgcl2)，200μmol/l的dntps(takara biotechnology co.ltd.,dalian,china)，0.5μmol/l的上下游引物(takara)，0.75u的rtaq聚合酶(takara)，30～50ng模板dna，最后用ddh2o补齐20μl。pcr反应程序为：95℃预变性5min，30个循环(95℃变性30s，60℃复性30s，72℃延伸30s)，72℃延伸5min，4℃保存。pcr扩增产物检测：pcr扩增产物加1/6体积的6
×
loading buffer，取2.5μl利用6％的非变性聚丙烯酰胺凝胶(non-denaturing page，550v，2.5h)在dyy-6c型电泳仪(北京六一厂)上电泳分离，然后将电泳后的凝胶参照童治军等(童治军.烟草微卫星标记的开发与应用.杭州:浙江大学,2012,pp:35,87-88.)的方法进行固定、银染、漂洗、显色、漂洗等银染检测步骤，最后拍照及胶片数据处理。
49.利用本实验室分别基于烤烟红花大金元和雪茄烟beinhart1000-1基因组信息开发的约50000个ssr标记，对rils_f
7:8
群体的双亲(红花大金元和beinhart1000-1)和子一代(f1)进行多态性筛选，最终，筛选获得2001个多态性ssr标记。再利用筛选获得2001个多态ssr标记，对341份rils_f
7:8
样品进行基因型分析。其次，利用遗传连锁作图软件joinmapv4.0对341份rils_f
7:8
样品的基因型数据进行连锁分析，绘制一张含有24条连锁群且均匀分布1974个ssr标记，覆盖烟草基因组长度为3213.138cm的高质量雪茄烟遗传连锁图谱，作为rils_f
7:8
群体的基因型值，用于下一步的qtl连锁分析。
50.1.4顺-冷衫醇(qabl)的全基因组qtl定位分析
51.利用qtl定位分析软件qtl icimapping v4.2对rils_f
7:8
群体的基因型数据(构建获得雪茄烟遗传连锁群图谱)和表型数据(341份rils_f
7:8
群体的顺-冷衫醇含量)，对顺-冷衫醇基因qabl进行全基因组qtl扫描。其中，相关参数设置为：定位方法选icim-add：inclusive composite interval mapping of additive(and dominant)qtl，迭代次数为1000(permutation times＝1000)，显著性为0.01(significance＝0.01)，步长为0.5cm(walk speed＝0.5cm)。横坐标为遗传距离(单位：厘摩cm)；纵坐标为lod值。图中的横向虚线是在0.01显著性阈值下的lod值＝3.3733；lod曲线最高点为主效基因(qabl_15)。最后，在全基因组范围内的lod＝3.3733条件下，位于第15号连锁群的83.00cm处定位获得顺-冷衫醇性状的1个主效qtl(暂命名为qabl_15)。该主效qtl可解释约39.15％的表型变异率，且此时的lod值约为9.48。基于烟草重组自交系群体(rils_f
7:8
；红花大金元
×
beinhart1000-1)的第15号连锁群上顺-冷衫醇qtl分析曲线图如图1所示，和顺-冷衫醇基因qabl(qabl_15)信息统计如表1所示。
52.表1
53.qtlchromosomeposition/cmleftmarkerrightmarkerlodpve(％)addqabl_151583.00tmc43307tmc433419.479639.14780.3501
54.注：pve为qtl的效应值，即，该qtl可解释表型变异百分比；add为加性效应。
55.实施例2
56.本实施方式提供了共显性连锁标记在rils_f
8:9
群体单株中的验证。
57.利用获得的与顺-冷衫醇基因qabl两侧紧密连锁的共显性ssr标记tmc43307和tmc43341，对苗期的rils_f
8:9
群体(红花大金元
×
beinhart1000-1)单株进行基因型分析，获得rils_f
8:9
群体各单株的基因型数据；另一方面，待rils_f
8:9
群体的烟叶生长成熟并采烤后，采用uplc-uv法检测个株系叶片中的顺-冷衫醇含量，即，获取rils_f
8:9
群体各株系的表型值。最后，分析341份rils_f
8:9
群体的基因型数据与顺-冷衫醇含量表型值，发现本发明公布的两个共显性ssr标记tmc43307和tmc43341的基因型值与表型值完全吻合，即，一致率达100％。
58.具体的分析方法为：通过uplc-uv检测获得的各株系顺-冷衫醇含量高于或等于亲本beinhart1000-1含量时，该株系的基因型中也是同时呈现如seq id no.1(216bp)和seq id no.3(239bp)所示序列即为纯合基因型aa；检测获得的各株系顺-冷衫醇含量等于或低于亲本红花大金元含量时，该株系的基因型中也是同时呈现如id no.2(212bp)和seq id no.4(305bp)所示序列即为纯合基因型aa；而当检测获得的各株系顺-冷衫醇含量介于亲本红花大金元与beinhart1000-1之间，也即与子一代(f1)含量相近时，该株系的基因型中也是同时呈现如seq id no.1和seq id no.2所示序列，或含有seq id no.3和seq id no.4所示序列，或含有seq id no.1、seq id no.3和seq id no.4所示序列，或含有seq id no.3、seq id no.1和seq id no.2所示序列即为杂合基因型aa。
59.以上结果表明，共显性标记tmc43307和tmc43341分别与顺-冷衫醇基因qabl紧密连锁，且该两个标记位于目的基因(qabl_15)两侧。利用上述两个共显性紧密连锁ssr标记，不仅可以精准、高效、便捷且低成本的实现烟草任何生育期的顺-冷衫醇含量的检测，而且也可清晰鉴别待测植株中顺-冷衫醇的基因型状态(即，具有最高含量值且稳定遗传的纯合基因型aa、具有中等含量值且遗传不稳定的杂合基因型aa、不含或含痕量值且稳定遗传的纯合基因型aa)，进而既提高了具有高香气品质烟草新品种选育的科学性、可预测性，又加速了育种进程。
60.对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。