一种氨基比林半抗原、人工抗原、抗体及其制备方法与应用

1.本发明涉及抗原抗体检测技术领域，更具体地，涉及氨基比林半抗原、人工抗原、抗体及其制备方法与应用。


背景技术：

2.氨基比林(aminophenazone)，学名4-二甲氨基-1,5-二甲基-2-苯基-3-吡唑啉 酮，为吡唑酮类解热镇痛抗炎药，可用于缓解感冒、上呼吸道感染引起的发热、 头痛等症状，亦可用于治疗缓解神经痛、风湿痛，牙痛。长期服用可导致粒细胞 减少，再生障碍性贫血及肝肾损害等严重中毒反应。
[0003][0004]
现如今，对于氨基比林的检测方法主要有薄层层析法(张赫名.抗风湿类中成药中非法添加氨基比林的快速检测，健康之路,2018年第17卷第5期)、高效液相色谱法(郑举等，梯度洗脱hplc法同时测定4种解热镇痛类药物的含量，中兽医医药杂志,2020年第39卷第5期)、高效液相色谱质谱联用法等仪器法(丁建兰等，超高压液相色谱-串联质谱法测定茶及茶饮品中解热镇痛药物，食品与药品，2019年第21卷第6期)，他们具有虽然准确性高、灵敏度强但是仪器设备昂贵，检测成本高，步骤繁琐，需专业人员操作，不适合大批量样品的现场筛查。由于凉茶产业的特殊性，市场对于凉茶中非法添加物质的检测需要的是即时、快速、大批量检测，才能对整个凉茶市场起到积极有效的监督管理作用。免疫检测方法相较于仪器法具有特异性高、快速、操作简便等优势，能够有效减轻市场监管人员的压力，降低操作成本，而灵敏度高、特异性强的抗体对于免疫检测是至关重要的，但是目前还缺少特异性检测氨基比林的抗体。因此迫切需要提供一能够产生针对氨基比林特异性抗体的半抗原和抗原，同时建立一种高效、快速、灵敏度高、特异性强的氨基比林的免疫检测方法。


技术实现要素：

[0005]
本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供一种氨基比林半抗原。
[0006]
本发明的第二个目的在于提供所述氨基比林人工抗原的制备方法。
[0007]
本发明的第三个目的在于提供一种氨基比林人工抗原。
[0008]
本发明的第四个目的在于提供一种氨基比林抗体。
[0009]
本发明的第五个目的在于提供所述氨基比林半抗原、人工抗原、抗体的应用。
[0010]
本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：
[0011]
一种氨基比林半抗原，所述氨基比林半抗原的结构式如式(i)或式(ii)所示：
[0012][0013][0014]
本发明式(i)所示的氨基比林半抗原采用系统命名法命名为： 4-((1,5-dimethyl-3-oxo-2-phenyl-2,3-dihydro-1h-pyrazol-4-yl)(methyl)amino)butano ic acid即4-((1,5-二甲基-3-氧代-2-苯基-2,3-二氢-1h-吡唑-4-基)(甲基)氨基)丁酸。
[0015]
式(ii)所示的氨基比林半抗原采用系统命名法为： n-(1,5-dimethyl-3-oxo-2-phenyl-2,3-dihydro-1h-pyrazol-4-yl)-n-methylglycine(即) n-(1,5-二甲基-3-氧代-2-苯基-2,3-二氢-1h-吡唑-4-基)-n-甲基甘氨酸。
[0016]
本发明还提供上述氨基比林半抗原的制备方法：将1,5-二甲基-4-(甲基氨基)-2-苯基-1,2-二氢-3h-吡唑-3-酮充分溶解于有机溶剂中，在碱性和催化剂环境中与4-溴丁酸乙酯或溴乙酸乙酯冷凝回流反应后，萃取有机相，得到的有机相蒸干收集后，以醇溶剂溶解，加入水与氢氧化钠水溶液在室温下搅拌水解，结束后将ph调节至酸性，即得到式(i)或式(ii)所示半抗原。
[0017]
具体地，式(i)所示氨基比林半抗原的步骤包括如下：以1,5-二甲基-4-(甲基氨基)-2-苯基-1,2-二氢-3h-吡唑-3-酮为原料充分溶解于乙腈中，加入无水碳酸钾为整个反应体系维持提供一个碱性环境，加入碘化钠作为催化剂，再加入4
‑ꢀ
溴丁酸乙酯，整个体系于50～60℃冷凝回流反应12h后，以超纯水与乙酸乙酯 1:1进行萃取，得到的有机相以旋转蒸发仪蒸干收集后，以硅胶柱层析进行分离纯化。分离后的产物以甲醇溶解，再加入与甲醇比为1:2的超纯水，与1mol/l 的氢氧化钠水溶液在室温下搅拌反应3～5h，反应结束后以浓度为1mol/l的盐酸调节ph至6～7，即得到式(i)所示半抗原。
[0018]
式(ii)所示氨基比林半抗原的步骤包括如下：以1,5-二甲基-4-(甲基氨基)-2
‑ꢀ
苯基-1,2-二氢-3h-吡唑-3-酮为原料充分溶解于乙腈中，加入无水碳酸钾为整个反应体系维持提供一个碱性环境，加入碘化钠作为催化剂，再加入溴乙酸乙酯，整个体系于50～60℃冷凝回流反应12h后，以超纯水与乙酸乙酯1:1进行萃取，得到的有机相以旋转蒸发仪蒸干收集后，以硅胶柱层析进行分离纯化。分离后的产物以甲醇溶解，再加入与甲醇比为1:2的超纯水，与1mol/l的氢氧化钠水溶液在室温下搅拌反应3～5h，反应结束后以浓度为1mol/l的盐酸调节ph至6～7，即得到式(ii)所示半抗原。
[0019]
本发明在制备半抗原时，使用乙腈作为溶剂，乙腈易除去，提高了处理反应的简便性，使用溴代酯进行一步反应，大大降低了时间成本，温度适中避免了副产物的生成，大大提高了产率。
[0020]
本发明还提供所述氨基比林半抗原在制备氨基比林人工抗原中的应用。
[0021]
本发明还提供一种氨基比林人工抗原，由上述半抗原和载体蛋白偶联得到，具体地，是在氨基比林半抗原的羧基上偶联载体蛋白得到，所述载体蛋白为牛血清蛋白(bovine serum albumin，bsa)，或者鸡卵清白蛋白(ovalbumin，ova)。
[0022]
所述氨基比林半抗原4-((1,5-二甲基-3-氧代-2-苯基-2,3-二氢-1h-吡唑-4
‑ꢀ
基)(甲基)氨基)丁酸与载体蛋白偶联时，氨基比林半抗原4-((1,5-二甲基-3-氧代-2
‑ꢀ
苯基-2,3-二氢-1h-吡唑-4-基)(甲基)氨基)丁酸的特异性结构突出于载体蛋白的表面，作为载体的一个抗原表位暴露给动物免疫系统，为得到特异性强，质量高的抗体奠定了基础。
[0023]
优选地，所述偶联为通过活泼酯法进行。具体包括以下步骤：
[0024]
s1.将式(i)、(ii)所示半抗原分别溶于无水dmf中，先后加入edc和nhs，室温下搅拌4～6h，记为a液；
[0025]
s2.将载体蛋白溶于磷酸盐缓冲溶液，记为b液，将a液逐滴加入b液中， 4℃下反应6～12h；4℃下用磷酸盐缓冲溶液透析三天，每天更换三次透析液，透析完成后，即得氨基比林人工抗原。
[0026]
进一步优选地，s1所述氨基比林人工抗原、nhs、edc的投料比为1:1～2:1～2，所述载体蛋白和半抗原的摩尔比为1:60～80。
[0027]
更优选地，s1所述氨基比林人工抗原、nhs、edc的投料比为1:1.5:1.5。
[0028]
本发明还提供上述氨基比林人工抗原的应用，以氨基比林人工抗原作为免疫原制备氨基比林抗体，或者以氨基比林人工抗原作为包被原；所述抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体，或者基因工程抗体。
[0029]
本发明还提供一种氨基比林抗体，将上述氨基比林人工抗原与免疫佐剂混匀后免疫动物，采血、分离上清，纯化得到氨基比林抗体。
[0030]
具体地，所述氨基比林抗体的制备方法如下：用氨基比林半抗原4-((1,5-二甲基-3-氧代-2-苯基-2,3-二氢-1h-吡唑-4-基)(甲基)氨基)丁酸偶联载体蛋白bsa 的人工抗原免疫新西兰大白兔，分别将1mg/ml的人工抗原溶液与等量佐剂溶液混合乳化，初次免疫与弗氏完全佐剂混合乳化后免疫，之后的加强免疫使用免疫原与弗氏不完全佐剂乳化后免疫，共免疫五次，每次间隔3周，每次免疫剂量为0.5mg/只；第五次免疫后第十天采血，采用辛酸-硫酸铵法纯化抗体。
[0031]
本发明还提供上述氨基比林人工抗原或上述氨基比林抗体在检测氨基比林或在制备检测氨基比林的试剂盒中的应用。
[0032]
一种检测氨基比林的免疫分析方法，以式(ii)所示氨基比林半抗原与鸡卵清白蛋白偶联得到的人工抗原作为包被原，以式(i)所示氨基比林半抗原与牛血清蛋白偶联得到的人工抗原作为免疫原免疫动物制备得到的抗体为检测抗体进行检测。
[0033]
本发明还提供一种用于检测氨基比林的试剂盒，包括所述氨基比林半抗原、所述氨基比林人工抗原或所述氨基比林抗体。
[0034]
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0035]
本发明的氨基比林半抗原，与待测物氨基比林的骨架结构重叠度高，有效的提高了氨基比林半抗原-载体蛋白偶联物的免疫原性，与半抗原结构差异较大，形成了较大空间位阻，进一步提高抗体亲和力，利用该氨基比林半抗原得到的人工抗原作为免疫原免疫新西兰大白兔，采用辛酸-硫酸铵法纯化后为抗体。所得到的抗体效价高、特异性强、亲和力高，利用其所建立的对氨基比林的lod为 0.53ng/ml，ic50为7.32ng/ml，定量检测范围为1.40～38.36ng/ml，检测灵敏度高，线性范围广；本发明的抗体及检测方法具有简便快速、特异性强、线性范围广，灵敏度高的特点，在氨基比林的快速有效检测中具有良好的应用前景和广阔的发展空间。
附图说明
[0036]
图1为氨基比林半抗原合成路径图。
[0037]
图2为人工抗原4-((1,5-二甲基-3-氧代-2-苯基-2,3-二氢-1h-吡唑-4-基)(甲基) 氨基)丁酸-bsa的紫外扫描图。
[0038]
图3为人工抗原n-(1,5-二甲基-3-氧代-2-苯基-2,3-二氢-1h-吡唑-4-基)-n-甲基甘氨酸-ova的紫外扫描图。
[0039]
图4为氨基比林elisa标准曲线图。
具体实施方式
[0040]
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
[0041]
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
[0042]
1,5-二甲基-4-(甲基氨基)-2-苯基-1,2-二氢-3h-吡唑-3-酮购自毕得医药，cas 号为519-98-2。
[0043]
实施例1氨基比林半抗原的合成与鉴定
[0044]
一、氨基比林半抗原4-((1,5-二甲基-3-氧代-2-苯基-2,3-二氢-1h-吡唑-4
‑ꢀ
基)(甲基)氨基)丁酸的合成与鉴定
[0045]
1、4-((1,5-二甲基-3-氧代-2-苯基-2,3-二氢-1h-吡唑-4-基)(甲基)氨基)丁酸的合成，其合成路径如图1所示，具体合成步骤包括如下：
[0046]
以1mmol的1,5-二甲基-4-(甲基氨基)-2-苯基-1,2-二氢-3h-吡唑-3-酮为原料充分溶解于乙腈中，加入无水碳酸钾为整个反应体系维持提供一个碱性环境，加入碘化钠作为催化剂。再加入与原料摩尔比为1:1的4-溴丁酸乙酯，整个体系于 50～60℃冷凝回流。以tlc检测反应，展开剂为石油醚-乙酸乙酯(2:1，v/v)。反应12h后，以冰水猝灭反应。减压蒸馏去除溶剂。以超纯水与乙酸乙酯1:1 进行萃取，得到的有机相进行收集，水相再用乙酸乙酯反复萃取，收集有机相。合并有机相后通过无水na2so4除水干燥过滤，减压蒸馏除去溶剂，残留物经硅胶柱层析纯化，以石油醚-乙酸乙酯(3:1，v/v)作为流动相梯度洗脱，减压浓缩滤液后得到黄色油状物质。以甲醇溶解，再加入与甲醇比为1:2的超纯水，与1 mol/l的氢氧化钠水溶液在室温下搅拌反应3～5h，反应结束后以浓度为1mol/l 的盐酸调节ph至6～7，即得所述半抗原4-((1,5-二甲基-3-氧代-2-苯基-2,3-二氢
ꢀ‑
1h-吡唑-4-基)(甲基)氨基)
丁酸。结构图如下式(i)所示：
[0047][0048]
2、氨基比林半抗原4-((1,5-二甲基-3-氧代-2-苯基-2,3-二氢-1h-吡唑-4-基)(甲基)氨基)丁酸的鉴定
[0049]
氢谱核磁结果如下：1h nmr(600mhz,chloroform-d)δ7.54
–
7.42(m,4h), 7.37
–
7.27(m,5h),3.79
–
3.47(m,2h),3.10
–
3.02(m,3h),2.82(s,3h),2.27
–ꢀ
2.19(m,4h).
[0050]
质谱结果如下：ms：c
16h21
n3o3：303.2，esi-[m-h]-：302.3。
[0051]
由质谱核磁结果可以看出，302.2为半抗原4-((1,5-二甲基-3-氧代-2-苯基-2,3
‑ꢀ
二氢-1h-吡唑-4-基)(甲基)氨基)丁酸的负离子分子峰，计算得其相对分子质量为 303.2，与实际的相对分子质量相符，说明成功制备得到了氨基比林半抗原4-((1,5
‑ꢀ
二甲基-3-氧代-2-苯基-2,3-二氢-1h-吡唑-4-基)(甲基)氨基)丁酸。
[0052]
二、氨基比林半抗原n-(1,5-二甲基-3-氧代-2-苯基-2,3-二氢-1h-吡唑-4
‑ꢀ
基)-n-甲基甘氨酸的合成与鉴定
[0053]
1、n-(1,5-二甲基-3-氧代-2-苯基-2,3-二氢-1h-吡唑-4-基)-n-甲基甘氨酸的合成，其合成步骤包括如下：
[0054]
以1mmol的1,5-二甲基-4-(甲基氨基)-2-苯基-1,2-二氢-3h-吡唑-3-酮为原料充分溶解于乙腈中，加入无水碳酸钾为整个反应体系维持提供一个碱性环境，加入碘化钠作为催化剂。再加入与原料摩尔比为1:1的溴乙酸乙酯，整个体系于 50～60℃冷凝回流。以tlc监测反应，展开剂为石油醚-乙酸乙酯(2:1，v/v)。反应12h后，以冰水猝灭反应。减压蒸馏去除溶剂。以超纯水与乙酸乙酯1:1 进行萃取，得到的有机相进行收集，水相再用乙酸乙酯反复萃取，收集有机相。合并有机相后通过无水na2so4除水干燥过滤，减压蒸馏除去溶剂，残留物经硅胶柱层析纯化，以石油醚-乙酸乙酯(3:1，v/v)作为流动相梯度洗脱，减压浓缩滤液后得到黄色油状物质。以甲醇溶解，再加入与甲醇比为1:2的超纯水，与1 mol/l的氢氧化钠水溶液在室温下搅拌反应3～5h，反应结束后以浓度为1mol/l 的盐酸调节ph至6～7，萃取浓缩后即得所述半抗原n-(1,5-二甲基-3-氧代-2-苯基-2,3-二氢-1h-吡唑-4-基)-n-甲基甘氨酸。结构如下所示：
[0055]
[0056]
2、氨基比林半抗原n-(1,5-二甲基-3-氧代-2-苯基-2,3-二氢-1h-吡唑-4-基)-n
‑ꢀ
甲基甘氨酸的鉴定
[0057]
氢谱核磁结果如下：1h nmr(600mhz,chloroform-d)δ7.53(d,j＝8.6hz, 2h),7.37
–
7.33(m,3h),3.07(t,j＝2.8hz,3h),2.94(d,j＝1.6hz,3h).
[0058]
质谱结果如下：ms：c
14h17
n3o3：275.1，esi-[m-h]-：274.1
[0059]
由质谱核磁结果可以看出274.1为半抗原n-(1,5-二甲基-3-氧代-2-苯基-2,3
‑ꢀ
二氢-1h-吡唑-4-基)-n-甲基甘氨酸的负离子分子峰，计算得其相对分子质量为275.1，与实际的相对分子质量相符，说明成功制备得到了氨基比林半抗原n-(1,5
‑ꢀ
二甲基-3-氧代-2-苯基-2,3-二氢-1h-吡唑-4-基)-n-甲基甘氨酸。
[0060]
实施例2氨基比林人工抗原的制备
[0061]
1、人工抗原的合成
[0062]
将实施例1制备得到的氨基比林半抗原4-((1,5-二甲基-3-氧代-2-苯基-2,3-二氢-1h-吡唑-4-基)(甲基)氨基)丁酸，n-(1,5-二甲基-3-氧代-2-苯基-2,3-二氢-1h-吡唑-4-基)-n-甲基甘氨酸通过活泼酯法分别偶联牛血清蛋白bsa牛血清蛋白 (bovine serum albumin)和鸡卵清白蛋白ova(ovalbumin)：将半抗原分别溶于200μl dmf中，先后分别添加1.5eq edc和1.5eq nhs于溶液中，4℃下反应4h，记为a液；将载体蛋白溶于pbs缓冲溶液中完全溶解，记为b液。磁力搅拌下将a液逐滴缓慢加入到b液中，于4℃反应12h；将反应液装入透析袋中于4℃下，磷酸盐缓冲溶液中透析3天，一天更换三次透析液，收集透析袋中的溶液，即得到氨基比林人工抗原4-((1,5-二甲基-3-氧代-2-苯基-2,3-二氢-1h
‑ꢀ
吡唑-4-基)(甲基)氨基)丁酸-bsa，n-(1,5-二甲基-3-氧代-2-苯基-2,3-二氢-1h-吡唑
ꢀ‑
4-基)-n-甲基甘氨酸-ova，分装于-20℃保存。
[0063]
2、人工抗原的鉴定
[0064]
取实例1制备的半抗原4-((1,5-二甲基-3-氧代-2-苯基-2,3-二氢-1h-吡唑-4
‑ꢀ
基)(甲基)氨基)丁酸，n-(1,5-二甲基-3-氧代-2-苯基-2,3-二氢-1h-吡唑-4-基)-n-甲基甘氨酸和实例2步骤1制备的人工抗原分别进行紫外波长扫描(150～400nm) 进行鉴定。
[0065]
紫外全波长扫描结果鉴定结果如图2、图3所示，比较偶连前后的bsa、 ova、氨基比林半抗原aa、aa-bsa、aa-ova的最高吸光值可知，aa-bsa、 aa-ova的吸收曲线与bsa、ova的吸收曲线明显不同，aa-bsa、aa-ova 的吸收曲线在280nm处出现了与bsa、ova吸收曲线不同的偏移；因此，aa-bsa、 aa-ova的吸收曲线是bsa、ova分别与氨基比林半抗原aa的累加吸收峰；由此可见，氨基比林半抗原aa分别与bsa、ova成功偶联，本发明成功制备得到了aa-bsa人工抗原、aa-ova人工抗原。
[0066]
实施例3氨基比林抗体的制备
[0067]
一、动物免疫
[0068]
用健康的体重为1.5～2.0kg的新西兰大白兔作为实验动物，以氨基比林人工抗原4-((1,5-二甲基-3-氧代-2-苯基-2,3-二氢-1h-吡唑-4-基)(甲基)氨基)丁酸
ꢀ‑
bsa作为免疫原，在大白兔的颈背部进行皮下注射，将人工抗原溶液与等量佐剂混合乳化，初次免疫与弗氏完全佐剂混合乳化后免疫，之后的加强免疫使用免疫原与弗氏不完全佐剂乳化后免疫，共免疫五次，每次间隔3周，每次免疫剂量为0.5mg/只；期间耳缘静脉取少量血进行抗体质量鉴定，第五次免疫后第十天采血，将所得兔血在37℃温育2h后，在4℃条件下放置过夜
(12h)，第二天将水层清液取出，然后在4℃条件下，3000r/min离心10min，去除沉淀，获得上清液，分装，标记，-20℃保存，即得用于检测氨基比林的抗体。
[0069]
实施例4氨基比林的间接竞争elisa检测方法的建立
[0070]
1、实验方法
[0071]
一种检测氨基比林的间接竞争elisa方法，包括以下步骤：
[0072]
(1)将人工抗原n-(1,5-二甲基-3-氧代-2-苯基-2,3-二氢-1h-吡唑-4-基)-n-甲基甘氨酸-ova作为包被原，用包被液稀释至62.5ng/ml，包被96孔酶标板，每孔加入100μl,37℃孵育过夜(12h)；
[0073]
(2)弃去包被液，洗涤两次，拍干；
[0074]
(3)每孔加入120μl封闭液(即1％鱼皮胶原蛋白)，37℃封闭3h；
[0075]
(4)弃去封闭液，拍板，37℃烘干30min后取出，用自封袋装好备用；
[0076]
(5)用pbst 1：4000倍稀释氨基比林抗体，并将氨基比林稀释至1000ng/ml、 250ng/ml、62.5ng/ml、15.63ng/ml、3.9ng/ml、0.98ng/ml、0.244ng/ml、0.06 ng/ml、0.015ng/ml；
[0077]
(6)每行加入50μl氨基比林稀释液(三组平行)，再加入50μl/孔兔血清稀释液，37℃孵育40min，洗涤五次，拍干；
[0078]
(7)加入羊抗兔二抗-hrp(5000倍稀释)100μl/孔，37℃孵育30min，洗涤五次，拍干；
[0079]
(8)加入显色液，每孔100μl，显色10min；
[0080]
(9)加入50μl 10％的h2so4溶液终止反应，并在450nm处读取od值
[0081]
2、实验结果
[0082]
用于检测氨基比林的抗体间接竞争elisa标准曲线如图4所示，可知用于检测氨基比林的抗体半抑制浓度(ic
50
)为7.32ng/ml，定量检测范围为1.40 ～38.36ng/ml，最低检测限为0.53ng/ml；说明本发明制备得到的用于检测氨基比林的抗体可以满足检测要求，且对氨基比林的识别能力高、特异性强、检测灵敏度高。
[0083]
实施例5氨基比林抗体的特异性评价
[0084]
1、试验方法
[0085]
通过氨基比林和其类似物进行交叉反应实验来确定用于检测氨基比林的特异性，其抗体的特异性用交叉反应率(cr)表示，交叉反应率越小，特异性越强。将氨基比林及其类似物(安替比林、安乃近、异丙安替比林、布洛芬、水杨酸、对乙酰氨基酚)，分别作倍比稀释，采用间接竞争elisa法进行测定，步骤同实施例4，得到各类似物的ic
50
值，按照以下公式计算氨基比林交叉反应率 (cr)：
[0086]
cr(％)＝ic
50
(氨基比林)/ic
50
(类似物)
×
100％。
[0087]
2、实验结果
[0088]
氨基比林与其类似物的交叉反应结果如表1所示，可知用于检测氨基比林的抗体对氨基比林的交叉反应率为100％，ic
50
为7.32ng/ml，对安替比林、安乃近、布洛芬、水杨酸、对乙酰氨基酚的交叉反应率均小于1％；对异丙安替比林的交叉反应率为4％，ic
50
为218.17ng/ml，说明用于检测氨基比林的抗体的特异性强，可以有效的排除其类似物(安替比林、安乃近、异丙安替比林、布洛芬、水杨酸，对乙酰氨基酚)对氨基比林检测的干扰，能够
专门用于对氨基比林的检测。
[0089]
表1氨基比林与其类似物的交叉反应结果
[0090][0091]
注：nr表示无反应。