一种促糖尿病创伤修复多功能复合水凝胶合成方法与流程

本发明涉及生物医用材料和糖尿病并发症治疗领域，具体是一种促糖尿病创伤修复多功能复合水凝胶合成方法。

背景技术：

0、技术背景

1、糖尿病是以持续的高血糖为主要特征的慢性代谢性疾病。国际糖尿病联盟公布的数据显示，到2030年全世界的糖尿病患者将高达4.39亿。糖尿病对患者最大的威胁来自于并发症，如神经病变、糖尿病性肾病、视网膜病变和创伤难愈等。其中，糖尿病创伤治疗一直是医学界面临的重大难题。尽管糖尿病创伤难愈的机制尚不清楚，但已有研究表明糖尿病高水平血糖所致的氧化应激损伤在糖尿病创伤发展与愈合中发挥着重要的作用。高血糖通过多种机制(如抑制抗氧化酶的活性)促进活性氧(ros)的产生，损伤正常组织细胞线粒体，导致细胞色素c释放，激活凋亡蛋白酶caspase-3等物质，从而诱导细胞凋亡。对于糖尿病皮肤创伤修复材料的研发而言，必须考虑到如何及时清除创伤部位的ros以维持氧化-抗氧化能力的动态平衡。因此，研发一种具有调控创伤部位血糖浓度并降低ros水平能力的智能水凝胶，已成为糖尿病皮肤创伤修复研究的重要方向。

2、合适的敷料除了具有良好的吸收伤口渗出液能力外，还需有优良的生物相容性、保持伤口适宜的微环境、抗感染、促凝血等能力以及促进伤口快速愈合的性能。经典的纱布敷料在临床应用中的局限性显著。随着湿性伤口愈合理论的提出，各种新型敷料的应用逐年增加。例如上世纪八十年代初期上市的封闭性及半封闭性敷料，九十年代出现的藻酸类敷料、吸水性胶状敷料、糊膏型敷料、珠粒状敷料和粉状敷料，以及本世纪出现的新型抗菌敷料和高吸收泡沫敷料。据不完全统计，目前市面上在售伤口敷料已达2400余种。

3、选择适合于糖尿病皮肤创面愈合的敷料至关重要。一方面，要能维持创伤部位潮湿的微环境，诱导成纤维细胞、角质形成细胞的增殖和分化，增加胶原蛋白合成。另一方面，要具有良好的物化特性，保持创伤部位气体交换顺畅、防止感染、隔热等。水凝胶型伤口敷料是共价或者非共价的化合物与水形成的含水约20％的混合物，可维持伤口高度的湿润性，促进坏死组织和细胞消融，吸收组织渗出液。临床实践表明，这种敷料不会干扰伤口床组织，具有高度的灵活性，没有抗原性，对水、氧气和代谢物也有很好的渗透性，在糖尿病皮肤创面修复的临床应用中具有广阔前景。

4、海藻酸是存在海带、巨藻等褐藻细胞壁中的一种天然多糖醛酸。透明质酸，又称玻尿酸，是d-葡萄糖醛酸及n-乙酰葡糖胺组成的双糖单位糖胺聚糖，是构成人体细胞间质、眼玻璃体、关节滑液等结缔组织的主要成分，在体内发挥保水、维持细胞外空间、调节渗透压、润滑、促进细胞修复的重要生理功能。因此，海藻酸和透明质酸是自然界中具有良好生物相容性和生物降解性的天然高分子，是优良的皮肤创伤修复基材。目前，海藻酸或者透明质酸基水凝胶在糖尿病创伤修复的应用还处于动物实验阶段。有研究将2-(3,4-二羟基苯基)乙胺改性的透明质酸与氧化石墨烯复合构建了多功能的皮肤创伤修复敷料。该敷料具有良好的光热抗菌效果，通过调控创伤部位炎症和血管生成，加速了创口新组织的产生，这说明透明质酸基水凝胶材料具有显著的促皮肤创伤伤口愈合的，提示了透明质酸复合物在皮肤伤口的愈合中发挥重要的作用。另有研究通过富血小板血浆(prp)与海藻酸钠复合构建的水凝胶，显示出良好的皮肤创伤修复能力，创口血管生成、促上皮细胞增殖和分化能力显著增强，体现出海藻酸基水凝胶的皮肤伤口修复过程中具有良好的促血管生成等特性。然而，临床上现有敷料在调控创伤部位血糖浓度并降低ros水平上的能力有限，不能有效维持适合细胞正常生命活动的微环境。

5、创面愈合是一个长期而复杂的过程，主要包括四个阶段：止血、炎症、再上皮化和组织重塑。生长因子、细胞因子和趋化因子都参与介导该过程。例如角化细胞释放白介素-1(il-1)向周围细胞传递皮肤受损信号；巨噬细胞释放的血小板衍生生长因子(pdgf)、转化生长因子-β(tgf-β)、血管内皮生长因子(vegf)、成纤维细胞生长因子(fgf)、表皮生长因子(egf)、肿瘤坏死因子(tnf)等参与调控炎症响应、促进成纤维细胞和角化细胞增殖与分化。研究表明，难愈合的糖尿病皮肤创面中生长因子(egf、kgf、pdgf、igf等)显著减少，成纤维细胞和角质形成细胞迁移减少，ros增加。由此可见，糖尿病皮肤创伤修复研究需高度重视创面各种因子减少的情况。血小板中含有大量的生长因子，如tgf-β、pdgf、vegf、类胰岛素生长因子(igf)、表皮生长因子(egf)等。prp是将动物或人的全血经过离心后得到的富含高浓度血小板的血浆，已在口腔及骨科临床领域得到广泛应用。prp可取自患者自体血液，不仅生物相容性好，而且不存在排异反应。因此，本研究拟将富含多种生长因子和蛋白质的prp与海藻酸和透明质酸混合制备出alg-prp-ha复合水凝胶，通过该水凝胶的降解释放出prp中的生长因子，补充创面部位缺少的生长因子，促进新生成纤维细胞和角质形成细胞的增殖和分化，进而加速糖尿病皮肤创面的愈合。

6、因此，现有技术中需要一种促糖尿病创伤修复多功能复合水凝胶合成方法。通过此方法，将海藻酸、prp和透明质酸的诸多优点加以合理利用，满足临床对多功能、个性化糖尿病皮肤创面治疗敷料的需要。

技术实现思路

1、本发明的目的是解决现有技术中存在的问题，提供一种促糖尿病创伤修复多功能复合水凝胶合成方法。

2、为实现本发明目的而采用的技术方案是这样的：

3、1.一种促糖尿病创伤修复多功能复合水凝胶合成方法，包括以下步骤：

4、1)利用酰胺反应合成2-(3,4-二羟基苯基)乙胺(da)改性的海藻酸(alg-da)；

5、1.1)配制一定体积一定浓度的海藻酸钠(alg)水溶液；

6、所述溶液体积为>0ml；

7、所述溶液浓度为0～10％(w/v)。

8、1.2)在步骤1.1)所述溶液中加入一定质量的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)和n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)，充分搅拌溶解并调节ph后获得反应前驱溶液；

9、所述edc质量为>0g；

10、所述nhs质量为>0g；

11、所述ph值为4.0～7.0。

12、1.3)将步骤1.2)中反应前驱溶液在一定温度下搅拌一定时间；

13、所述温度为0～40℃；

14、所述搅拌时间为6～48h。

15、1.4)将步骤1.3)中反应后溶液转移至一定分子量的透析袋中，在透析液中透析一定时间；

16、所述透析袋分子量为>1000da；

17、所述透析液为一定浓度的氯化钠水溶液；

18、所述透析时间为>6h；

19、1.5)将步骤1.4)中得到的溶液冷冻干燥一定时间，而后储存备用；

20、所述时间为>6h。

21、2)利用酰胺反应合成6-氨基苯并[c][1,2]氧杂硼杂环戊-1(3h)-醇盐酸盐(abo)改性的透明质酸(ha-abo)；

22、2.1)配制一定体积一定浓度的透明质酸(ha)水溶液；

23、所述溶液体积为>0ml；

24、所述溶液浓度为0～10％(w/v)。

25、2.2)在步骤2.1)所述溶液中加入一定质量的abo和4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐(dmtmm)，充分搅拌溶解并调节ph后获得反应前驱溶液；

26、所述abo质量为>0g；

27、所述dmtmm质量为>0g；

28、所述ph为4.0～7.0。

29、2.3)将步骤2.2)中反应前驱溶液在一定温度下搅拌一定时间；

30、所述温度为0～40℃；

31、所述搅拌时间为6～96h。

32、2.4)将步骤2.3)中反应后溶液转移至一定分子量的透析袋中，在透析液中透析一定时间。

33、所述透析袋分子量为>1000da；

34、所述透析液为一定浓度的氯化钠水溶液；

35、所述透析时间为>6h；

36、2.5)将步骤2.4)中得到的溶液冷冻干燥一定时间，而后储存备用；

37、所述时间为>6h。

38、3)利用离心法提取富血小板血浆(prp)；

39、3.1)采集一定体积的大鼠新鲜血液，并静置一定时间；

40、所述血液体积为>0ml；

41、所述静置时间为0～60min。

42、3.2)将步骤3.1)中血液在一定温度一定转速下离心一定时间；

43、所述温度为0～30℃；

44、所述离心转速为0～10000rpm；

45、所述离心时间为0～30min。

46、3.3)取步骤3.2)中离心后分层交界线以上一定体积溶液即为prp；

47、所述体积为>0ml。

48、4)配制血小板激活剂；

49、4.1)配制一定浓度的氯化钙水溶液即为血小板激活剂；

50、所述溶液浓度为0～50mm。

51、5)合成促糖尿病创伤修复多功能复合水凝胶；

52、5.1)配制一定浓度的alg-da/pbs溶液备用；

53、所述溶液浓度为0～10％(w/v)。

54、5.2)配制一定浓度的ha-abo/pbs溶液，调节ph后备用；

55、所述溶液浓度为0～10％(w/v)；

56、所述ph值为4.0～10.0。

57、5.3)取一定体积的alg-da/pbs溶液、prp、ha-abo/pbs溶液和血小板激活剂于离心管中，快速搅拌使溶液混合均匀，复合水凝胶随即形成；

58、所述alg-da/pbs溶液体积为>0ml；

59、所述ha-abo/pbs溶液体积为>0ml；

60、所述prp体积为>0ml；

61、所述血小板激活剂体积为所加入prp体积的0～1倍；

62、2.一种促糖尿病创伤修复多功能复合水凝胶合成方法，步骤1.4)中氯化钠水溶液浓度为0～6.16mol/l。

63、3.一种促糖尿病创伤修复多功能复合水凝胶合成方法，步骤2.4)中氯化钠水溶液浓度为0～6.16mol/l。

64、4.一种通过上述的制备方法所获得的促糖尿病创伤修复多功能复合水凝胶。

65、本发明的技术效果是毋庸置疑的，本发明具有以下优点：

66、1)本发明将海藻酸、prp和透明质酸的诸多优点加以合理利用，该水凝胶将使快速修复糖尿病创伤成为可能；

67、2)本发明中的制备方法重复性好、操作简便、可控性强；

68、3)本发明所获得的糖尿病创伤修复水凝胶具备优越的综合性能，具有良好的临床应用前景，在糖尿病创伤修复技术领域中有重要的研究价值和临床意义。