基于距离信号输出的靶核酸即时检测方法与流程

1.本发明属于生物和化学领域，涉及一种基于距离信号输出的靶核酸即时检测方法。


背景技术：

2.核酸检测是用分子生物学和生物化学的理论和技术，直接或间接探查核酸的存在状态或完整性，并从核酸的结构、复制、转录或翻译水平分析核酸的结构与功能，因而核酸检测在生命遗传研究、传染病检测、遗传病诊断、肿瘤研究等多领域具有重要的应用价值。(sci.china chem.,2021,64,171
–
203.)
3.crispr技术，即规律成簇的间隔短回文重复序列，连同其相关cas核酸酶形成了crispr cas系统，它是细菌、古菌抵抗噬菌体侵染的一种获得性免疫机制。以cas12为例，它在未激活时呈自抑制状态，当其与特定的crrna结合后，构象将发生改变，从而形成cas12-crrna二元复合物。该复合物能特异性地识别并结合靶标dna的pam位点，使其rec域构象发生变化，进一步暴露出核酸酶活性位点ruvc域，从而激活其核酸内切酶活性。当cas12核酸酶对靶标dna进行cis切割后，该活性位点将持续暴露，并展现出trans切割活性，对周围的ssdna进行非特异性切割。利用cas12蛋白的特性，doudna等科学家设计了荧光探针作为trans切割底物，从而设计出一套针对人乳头瘤病毒(hpv)高灵敏度核酸检测新平台。除此之外，多种基于crispr cas12系统的核酸检测平台应运而生，此类核酸检测技术正在日益发挥重要作用。(mol.cell,2019,73,589
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600.cell,2016,165,949
–
962.science,2017,356,438-442.science,2018,360,436-439.)
4.但现有的crispr cas12核酸检测技术有明显的不足，例如依赖于高质量的核酸分子探针与高灵敏度的荧光检测仪器，需要专业人员进行复杂的操作等。这些缺陷使得上述方法的检测场所仅局限于中心实验室。如何在保持现有crispr体系高灵敏度、高特异性等优点的基础上，开发更加便携、廉价的核酸检测新方法，实现应用场景的广谱化，将会是该领域亟待解决的问题。(acs synth.biol.,2020,9,3114-3123.biotechnol.bioeng.,2021,118,1587-1596.)


技术实现要素：

5.本发明的目的在于克服针对现有核酸检测技术的缺陷，借助crispr cas系统、dna智能水凝胶以及纸基微流控芯片，构建一种操作便携，无需大型仪器辅助，成本低廉，且选择性好、灵敏度高的核酸检测新平台。为此，本发明采用的技术方案如下：
6.一种基于距离信号输出的靶核酸即时检测方法，其特征在于包括如下步骤：
7.步骤一：对待测样品中的总核酸进行提取；
8.步骤二：借助核酸扩增技术对待测样品中的靶核酸片段进行扩增；
9.步骤三：在crrna的介导下，cas12a核酸酶特异性识别扩增产物中的靶核酸片段，利用其核酸酶活性对预先制备的dna智能水凝胶进行切割，释放其中包埋的信号分子，并与
34.进一步地，针对念珠菌、曲霉菌、隐球菌属上述扩增产物，步骤三中所用的crrna序列分别为：
35.can crrna，即序列表seq id no.9序列：
[0036]5’‑
uaauuucuacuaaguguagaucuaaauagugcugcuagcau-3’[0037]
asp crrna，即序列表seq id no.10序列：
[0038]5’‑
uaauuucuacuaaguguagauccgcgaguacugguccggcu-3’[0039]
cry crrna，即序列表seq id no.11序列：
[0040]5’‑
uaauuucuacuaaguguagauugcugaaaagccccgacuuc-3’[0041]
利用上述检测方法，可分别实现10cfu/ml念珠菌、曲霉菌、隐球菌属内真菌的特异性裸眼检测，利用纸基微流控芯片中色柱的距离，即可实现上述真菌在10-104cfu/ml浓度范围内的定量检测。
附图说明
[0042]
图1：本发明的工作原理图。(a)在crrna的介导下，cas12核酸酶能特异性地识别并结合扩增产物中的待测片段，并激活其trans切割活性。活化的cas12可对dna智能水凝胶l型交联剂附带的单链dna位点进行切割，从而使得水凝胶的交联度降低，进而引发水凝胶的瓦解，并释放其中所包埋的信号分子。以淀粉酶为例，释放的淀粉酶将胶外溶液中的淀粉水解，并产生大量的葡萄糖。(b)将包含葡萄糖的胶外溶液滴加至纸基微流控芯片的上样区，借助葡萄糖氧化酶-辣根过氧化物酶-二氨基联苯胺生成棕色的色柱，借助色柱的距离即可实现对待测核酸片段的定量检测。
[0043]
图2：纸基微流控芯片的设计图与实物图。(a)石蜡打印制备纸基微流控芯片的原理图。(b)纸基微流控芯片实物图。(c)纸基微流控芯片设计图。
[0044]
图3：dna智能水凝胶y型骨架dna和l型交联剂page表征图。line1:y1；line2:y2；line3:y3；line4:y1+y2；line5:y1+y3；line6:y2+y3；line7:y1+y2+y3；line8:l1；line9:l2；line10:l1+l2。
[0045]
图4：本发明对白色念珠菌和烟曲霉菌的检测灵敏度。(a)本发明对0,10,50,100,500,103,104,105cfu/ml白色念珠菌的检测实物图。(b)纸基微流控芯片棕色色柱的距离与0,10,50,100,500,103,104,105cfu/ml白色念珠菌的对应关系。(c)本发明对0,10,50,100,500,103,104,105cfu/ml烟曲霉菌的检测实物图。(d)纸基微流控芯片棕色色柱的距离与0,10,50,100,500,103,104,105cfu/ml烟曲霉菌的对应关系。
[0046]
图5：本发明对念珠菌属与曲霉菌属的检测特异性。(a)本发明对200cfu/ml白色念珠菌(candida albicans)、光滑念珠菌(candida glabrata)、克柔念珠菌(candida krusei)、热带念珠菌(candida tropicalis)、烟曲霉菌(aspergillus fumigatus)、黑曲霉菌(aspergillus niger)、黄曲霉菌(aspergillus flavus)、土曲霉菌(aspergillus terreus)、新型隐球菌(cryptococcus neoformans)、串珠镰刀菌(fusarium moniliforme)、展青霉菌(penicillium patulum)等真菌，200cfu/ml大肠杆菌(escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)、单增李斯特菌(listeria monocytogenes)、铜绿假单胞菌(pseudomonas aernginosa)等细菌的检测实物图。(b)图5a检测结果的统计热图。
[0047]
图6：本发明对混合真菌样品的检测性能。(a)8类混合真菌样品的组成。(b)纸基微流控芯片对8类混合真菌样品的检测实物图。(c)图6b检测结果的统计热图。
具体实施方式
[0048]
以下通过具体实施方式结合附图对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述：
[0049]
一、智能dna水凝胶的制备
[0050]
1.1预包埋淀粉酶的智能dna水凝胶的制备
[0051]
以预包埋淀粉酶的智能dna水凝胶为例，在制备y型骨架dna和l型交联剂dna时，y1、y2、y3单链dna部件和l1，l2单链dna部件分别溶于水凝胶自组装buffer(20mm tris-hcl,50mm nacl,5mm kcl,10mm mgcl2,ph 7.5)。于95℃孵育10min后，以0.1min/s的速率降至室温。利用非变性12％page胶对上述杂交情况进行表征(如图3)。将0.5mm y型骨架、0.75mml型交联剂、5.0-20.0mg/ml淀粉酶充分混匀，并于37℃静止3h即可获得以预包埋淀粉酶的智能dna水凝胶。
[0052]
1.2预包埋转化酶的智能dna水凝胶的制备
[0053]
基本制备工艺如1.1，其中仅用2.0-10.0mg/ml转化酶代替5.0-20.0mg/ml淀粉酶。
[0054]
1.3预包埋半乳糖苷酶的智能dna水凝胶的制备
[0055]
基本制备工艺如1.1，其中仅用5.0-15.0mg/ml半乳糖苷酶水溶液液代替5.0-20.0mg/ml淀粉酶。
[0056]
1.4预包埋葡聚糖酶的智能dna水凝胶的制备
[0057]
基本制备工艺如1.1，其中仅用8.0-30.0mg/ml葡聚糖酶水溶液液5.0-20.0mg/ml淀粉酶。
[0058]
二、纸基微流控芯片的设计与制备
[0059]
利用adobe illustrator对纸芯片图案进行设计。如图2所示，图案由一个圆形上样区(直径5.0-6.0mm)和一个矩形通道(长35.0-40.0mm，宽1.5-2.5mm)组成。利用石蜡打印机将上述图案喷印至whatman no.1滤纸上，并于120℃烘箱中烘烤90s，直至喷印图案渗透至滤纸背面。待滤纸冷却至室温，葡萄糖氧化酶用量为0.5-5u，辣根过氧化物酶用量为0.5-5u被吸附于圆形上样区，10mg/ml二氨基联苯胺被均匀得喷涂于矩形通道。将其于阴暗处自然干燥即获得制备完全的纸基微流控芯片。
[0060]
三、白色念珠菌检测灵敏度表征
[0061]
利用rna提取试剂盒对0,10,50,100,500,103,104,105cfu/ml白色念珠菌培养液中的18s rrna进行提取，并利用rt-raa技术对18s rrna中待测片段进行反转录和扩增。将2μl扩增产物与200nm cas12a，400nm crrna(seq id no.9)，8mg/ml淀粉，1*nebuffer2.1，rnase-free h2o进行混合(共计30μl)，并加至10μl预包埋淀粉酶的智能dna水凝胶上，于37℃反应1.5h。将20μl上清液加至纸基微流控芯片的上样区，于室温反应30min，即可在矩形通道上观察到棕色色柱。如图4a所示，不同浓度的白色念珠菌培养液可在矩形通道上产生不同长度的棕色色柱，检测灵敏度达10cfu/ml。利用色柱的距离即可实现对10-104cfu/ml浓度范围内的白色念珠菌的定量检测。
[0062]
四、烟曲霉菌检测灵敏度表征
[0063]
利用rna提取试剂盒对0,10,50,100,500,103,104,105cfu/ml烟曲菌霉培养液中的
18s rrna进行提取，并利用rt-raa技术对18s rrna中待测片段进行反转录和扩增。将2μl扩增产物与200nm cas12a，400nm crrna(seq id no.10)，8mg/ml淀粉，1*nebuffer2.1，rnase-free h2o进行混合(共计30μl)，并加至10μl预包埋淀粉酶的智能dna水凝胶上，于37℃反应1.5h。将20μl上清液加至纸基微流控芯片的上样区，于室温反应30min，即可在矩形通道上观察到棕色色柱。如图4c所示，不同浓度的白色念珠菌培养液可在矩形通道上产生不同长度的棕色色柱，检测灵敏度达10cfu/ml。利用色柱的距离即可实现对10-104cfu/ml浓度范围内的烟曲霉菌的定量检测。
[0064]
四、念珠菌属、曲霉菌属检测特异性表征
[0065]
利用念珠菌属和曲霉菌属检测体系分别对200cfu/ml白色念珠菌(candida albicans)、光滑念珠菌(candida glabrata)、克柔念珠菌(candida krusei)、热带念珠菌(candida tropicalis)、烟曲霉菌(aspergillus fumigatus)、黑曲霉菌(aspergillus niger)、黄曲霉菌(aspergillus flavus)、土曲霉菌(aspergillus terreus)、新型隐球菌(cryptococcus neoformans)、串珠镰刀菌(fusarium moniliforme)、展青霉菌(penicillium patulum)等真菌，200cfu/ml大肠杆菌(escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)、单增李斯特菌(listeria monocytogenes)、铜绿假单胞菌(pseudomonas aernginosa)等细菌进行检测。利用rna提取试剂盒对上述菌液中的全rna进行提取，并利用rt-raa技术对上述18s rrna中待测片段进行反转录和扩增。将2μl扩增产物与200nm cas12a，400nm crrna(seq id no.9或seq id no.10)，8mg/ml淀粉，1*nebuffer2.1，rnase-free h2o进行混合(共计30μl)，并加至10μl预包埋淀粉酶的智能dna水凝胶上，于37℃反应1.5h。将20μl上清液加至纸基微流控芯片的上样区，于室温反应30min。如图5a所示，念珠菌属和曲霉菌属检测体系仅对其各自属内的各种真菌具有明显的响应，而对于非本属真菌以及细菌则没有明显的信号。现了本发明所述方法良好的检测特异性。
[0066]
五、混合真菌的检测
[0067]
将200cfu/ml白色念珠菌、烟曲霉菌、新型隐球菌按图6a所示的配方进行混合，并利用念珠菌属、曲霉菌属和隐球菌属的检测体系对上述混合真菌样品分别进行检测。利用rna提取试剂盒对上述菌液中的全rna进行提取，并利用rt-raa技术对上述18s rrna中待测片段进行反转录和扩增。将2μl扩增产物与200nm cas12a，400nm crrna(seq id no.9，seq id no.10或seq id no.11)，8mg/ml淀粉，1*nebuffer2.1，rnase-free h2o进行混合(共计30μl)，并加至10μl预包埋淀粉酶的智能dna水凝胶上，于37℃反应1.5h。将20μl上清液加至纸基微流控芯片的上样区，于室温反应30min。如图6b所示，念珠菌属、曲霉菌属、隐球菌属检测体系仅对混合真菌样品中其各自属内的真菌具有明显的响应，而对于非本属真菌没有明显的信号，该结果体现了本发明所述方法良好的特异性与抗干扰能力。