一种用于检测冠状病毒的分子逻辑门智能化检测系统及其应用

1.本发明属于分析检测领域，具体涉及一种用于检测冠状病毒的分子逻辑门智能化检测系统及其应用。


背景技术：

2.冠状病毒属于套式病毒目，冠状病毒科，是目前自然界已知的最大rna病毒。冠状病毒亚科分为四个属，包括α冠状病毒、β冠状病毒、γ冠状病毒和δ冠状病毒。新型冠状病毒因其传播迅速、发病率高和死亡率显著而对人类健康具有极大的危害性。因此，快速准确地诊断冠状病毒对于控制当前的新冠病毒疫情至关重要。
3.目前主要用于诊断冠状病毒的方法为聚合酶链反应(pcr)，使用pcr检测covid-19通常需要3个多小时，而且，根据研究发现，使用pcr方法检测covid-19容易存在假阴性病例。尤其是新冠病毒的重组和突变更是增加了检测单个靶区的pcr假阴性结果的风险，使得患者无法及时隔离和治疗，导致更广泛的传播。而且，对于β冠状病毒，其可能存在多种混合感染的情况，需要有效的手段能够进行快速区分和筛查。
4.因此，迫切需要开发一种能够高选择性检测不同类型冠状病毒的多功能检测方法，以获得更加准确的检测结果，从而切实有效的控制新冠病毒的传播。


技术实现要素：

5.本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种用于检测冠状病毒的分子逻辑门检测系统及其应用，该分子逻辑门检测系统基于“and-or”、“inhibit-or”和“and-and-and”三重分子逻辑门以及核酸四面体实现多种冠状病毒的定性检测，检测效果稳定，检测精度高，检出限低，检测耗时短，具有极好的实际应用价值。
6.本发明的第一个方面，提供一种冠状病毒定性检测试剂，该冠状病毒定性检测试剂中包括发夹探针、核酸四面体、底物链和底物发夹。
7.根据本发明的第一个方面，在本发明的一些实施方式中，所述核酸四面体由4条cdn探针链杂交得到，每一条cdn探针链均含有mg
2+
依赖性dna酶的亚单位，其中一条cdn探针链可与另外三条cdn探针链中的任一条杂交获得完整的mg
2+
依赖性dna酶链，另外三条cdn探针链之间无法杂交获得完整的mg
2+
依赖性dna酶链。
8.所述cdn探针链包括：
9.cdn探针链a：5'-gatatcagcgatacgcctacagcacttctttttacattcctaagtctgaaacattacagcttgctacacgagaagagccgccatagta-3'(seq id no.1)；或，cdn探针链a1：5'-gatatcagcgatacgcgtagtatcatttttacattcctaagtctgaaacattacagcttgctacacgagaagagccgccatagta-3'(seq id no.2)中的任意一条；
10.以及
11.cdn探针链b：5'-ttcagacttaggaatgtgcttcccacgtagtgtcgtttgtattggaccctcgca
tttttactatggactctgcgtcacccatgttactct-3'(seq id no.3)；
12.以及
13.cdn探针链c：5'-tatcaccaggcagttgacagtgtagcaagctgtaatagatgcgagggtccaatactttttatcaccgtaccagcgtcacccatgttcgtca-3'(seq id no.4)；或，cdn探针链c1：5'-tatcaccaggcagttgacagtgtagcaagctgtaatagatgcgagggtccaatacttttttttattttctgcgtcacccatgttcgtca-3'(seq id no.5)中的任意一条；
14.以及
15.cdn探针链d：5'-tcaactgcctggtgataaaacgacactacgtgggaatctactatggcggctcttctttttttgattcagctcggcgtcacccatgttcctga-3'(seq id no.6)；或，cdn探针链d1：5'-tcaactgcctggtgataaaacgacactacgtgggaatctactatggcggctcttctttttttagtagtatcacgtcacccatgttcctga-3'(seq id no.7)；或，cdn探针链d2：5'-tcaactgcctggtgataaaacgacactacgtgggaatctactatggcggccttctttttttgattgctcagcgtcacccatgttcctga-3'(seq id no.8)中的任意一条。
16.其中，cdn探针链中加粗部分为mg
2+
依赖性dna酶的亚单位，cdn探针链a或a1中的任一条的mg
2+
依赖性dna酶亚单位序列分别与cdn探针链b、以及c或c1中的任一条、以及d、d1、d2中的任一条的mg
2+
依赖性dna酶亚单位序列在特定的底物链组的干预下会形成完整的mg
2+
依赖性dna酶链。cdn探针链b、c、c1、d、d1、d2的mg
2+
依赖性dna酶亚单位序列之间无法形成完整的mg
2+
依赖性dna酶链。
17.在本发明的一些优选实施方式中，核酸四面体(cdn)的构建方法为：取cdn探针链a、a1中的任意一条，cdn探针链b，cdn探针链c、c1中的任意一条，cdn探针链d、d1、d2中的任意一条混合(以hepes缓冲液为溶剂)，90～92℃退火10～11min，然后在1min内冷却到4℃，即可。
18.组成动态网络(cdn)在控制细胞内转化中起着重要作用。现有技术中尚无基于cdn的冠状病毒诊断传感系统，而且，本发明还同时基于分子逻辑门，使用dna作为构建块来执行二进制算术处理，从而实现cdn与dna生物计算系统的有机结合，使其能够执行基本、高级和复杂的逻辑功能，对冠状病毒诊断方法的开发起到了重要的推进作用。
19.根据本发明的第一个方面，在本发明的一些实施方式中，所述发夹探针靶向冠状病毒。
20.在本发明的一些优选实施方式中，所述发夹探针核苷酸序列包括：
21.发夹探针h1：5'-gaagtgctgtagagagtccatagtttttttactatggactctctacagcacttcaatagtagttgt-3'(seq id no.9)；
22.发夹探针h2：5'-gaagtgctgtagtggtacggtgatttttttatcaccgtaccactacagcacttccttcaactgcag-3'(seq id no.10)；
23.发夹探针h3：5'-gaagtgctgtagcgagctgaatcatttttttgattcagctcgctacagcacttcctcagtagtatc-3'(seq id no.11)；
24.发夹探针h4：5'-tgatactacagagtccatagtttttttactatggactctgtagtatcaaatagtagttgt-3'(seqid no.12)；
25.发夹探针h5：5'-tgatactactggtacggtgatttttttatcaccgtaccagtagtatcacttcaactgcag-3'(seq id no.13)中的至少一条。
26.其中，发夹探针h1、h4加粗部分靶向covid-19特异性序列，发夹探针h2、h5加粗部分靶向bat-sl-covzc45特异性序列，发夹探针h3加粗部分靶向sars-cov特异性序列。
27.发夹探针的发夹结构可通过：加热至95℃，持续5min，然后冷却至室温来获得。
28.根据本发明的第一个方面，在本发明的一些实施方式中，所述底物链的两端分别连接有荧光基团和淬灭基团，且所述底物链中含有mg
2+
依赖性dna酶的酶切位点。
29.底物链核苷酸序列为：sub-ad：5'-tcaggatraggatatc-3'(seq id no.14)。
30.其中，ra为dna酶的酶切位点。底物链的5’端和3’端均分别连接有荧光基团和淬灭基团。在本发明实施例中，sub-ad的5’端连接有cy5，3’端连接有bhq2。
31.根据本发明的第一个方面，在本发明的一些实施方式中，所述底物发夹中含有mg
2+
依赖性dna酶的酶切位点，且酶切后的片段与cdn探针链部分互补。
32.所述底物发夹核苷酸序列分别为：
33.hab：5'-tgatactacatgcaagcagagtatraggatatcaaaagcttgcta-3'(seq id no.15)；其中，hab加粗部分为hab片段z；hac：5'-atgcaagcaaaatgacgatraggatatcgcttgctatgagcaatca-3'(seq id no.16)；其中，hac加粗部分为hac片段s；hab片段z和hac片段s可以部分杂交形成部分双链体复合物sz。
34.had：5'-gaagtgctgtaggtagtatcaagagtatraggatatcaaaatgatactac-3'(seq id no.17)；其中，had加粗部分为had片段s；hae：5'-gtagtatcaaaaatgacgatraggatatctgatactacctacag-3'(seq id no.18)；其中，hae加粗部分为hae片段s*；had片段s可以与hae片段s*部分杂交。
35.haf：5'-gaagtgctgtagtcaactgcagagagtatraggatatcaaaactgcagttga-3'(seq id no.19)；其中，haf加粗部分为haf片段s；hag：5'-gaagtgctgtaggtagtatcatgacgatraggatatcaaaatgatactac-3'(seq id no.20)；其中，hag加粗部分为hag片段z。
36.其中，ra(腺嘌呤核糖核苷酸)为dna酶的酶切位点。
37.本发明的第二个方面，提供本发明第一个方面所述的冠状病毒定性检测试剂在制备冠状病毒定性检测产品中的应用。
38.根据本发明的第二个方面，在本发明的一些实施方式中，所述产品包括检测试剂盒和生物传感器。
39.根据本发明的第二个方面，在本发明的一些实施方式中，所述冠状病毒为β属冠状病毒；在本发明的一些优选实施方式中，所述冠状病毒包括covid-19、bat-sl-covzc45和sars-cov。
40.根据本发明的第二个方面，在本发明的一些实施方式中，所述冠状病毒定性检测产品基于三重逻辑门定性检测样品中的冠状病毒存在情况。在本发明的一些优选实施方式中所述三重逻辑门为“and-or”逻辑门、“inhibit-or”逻辑门和“and-and-and”逻辑门；所述三重逻辑门的定性检测方法为：分别将检测样品在“and-or”逻辑门、“inhibit-or”逻辑门和“and-and-and”逻辑门检测体系中进行定性，根据三重逻辑门的定性结果判断样品中是否含有covid-19、bat-sl-covzc45和sars-cov。“and-or”逻辑门、“inhibit-or”逻辑门和“and-and-and”逻辑门的检测原理图如说明书附图图1～3所示。
[0041]“and-or”逻辑门、“inhibit-or”逻辑门和“and-and-and”逻辑门的检测方法为：将发夹探针、检测样品、核酸外切酶在25
±
2℃条件下混合孵育10～30min，然后加热至70～75
℃，保持10～20min使混合体系中的核酸外切酶失活。然后再加入核酸四面体、sub-ad、镁离子溶液，底物发夹，室温(25
±
2℃)孵育40～45min，记录650～670nm波长下的荧光信号，定性检测样品中的冠状病毒。
[0042]
在本发明的一些优选实施方式中，所述“and-or”逻辑门的检测体系为：
[0043][0044]
在本发明的一些优选实施方式中，所述“inhibit-or”逻辑门的检测体系为：
[0045]
[0046][0047]
在本发明的一些优选实施方式中，所述“and-and-and”逻辑门检测体系为：
[0048]
组分终含量发夹探针h1250nmexo iii20u检测样品1μlcdn探针链a250nmcdn探针链b250nmcdn探针链c1250nmcdn探针链d2250nmsub-ad250nmhag250nmhaf250nm镁离子(氯化镁)2mmddh2o补至100μl。
[0049]
根据本发明的第二个方面，在本发明的一些实施方式中，所述冠状病毒定性检测产品的定性标准为：当“inhibit-or”逻辑门出现荧光：说明检测样品中仅存在covid-19和sars-cov；当“and-and-and”逻辑门出现荧光：说明检测样品中含有sars-cov、covid-19和bat-sl-covzc45；当“and-or”逻辑门出现荧光，但“inhibit-or”逻辑门和“and-and-and”逻辑门均无荧光：说明检测样品中仅含有sars-cov、或仅含有sars-cov和bat-sl-covzc45、或仅含有covid-19和bat-sl-covzc45；当“and-or”逻辑门无荧光：说明检测样品中仅含有covid-19、或仅含有bat-sl-covzc45、或不含sars-cov和covid-19和bat-sl-covzc45。
[0050]
其中，也可以使用上述任一种逻辑门检测体系单独进行检测。
[0051]
本发明的有益效果是：
[0052]
本发明提供了一种定性检测冠状病毒的检测方法，其可以检测的冠状病毒包括covid-19、bat-sl-covzc45和sars-cov。该检测方法基于核酸四面体和三重逻辑门，能够准确的定性待测样品中是否含有covid-19、bat-sl-covzc45和sars-cov，且特异性好，对于单碱基错配序列、双碱基错配序列、非互补序列等干扰序列均不会产生假阳性。
[0053]
本发明中的定性检测冠状病毒的检测方法，灵敏度高，其探针底物组合在基于核酸四面体和三重逻辑门的基础上能够有效提高检测的准确性，检出限可达10fm，最高可为2.5fm，相比于常规的检测技术更加精准灵敏。
附图说明
[0054]
图1为本发明实施例中的“and-or”逻辑门原理示意图；
[0055]
图2为本发明实施例中的“inhibit-or”逻辑门原理示意图；
[0056]
图3为本发明实施例中的“and-and-and”逻辑门原理示意图；
[0057]
图4为本发明实施例中的“and-or”逻辑门的实际检测结果；
[0058]
图5为本发明实施例中的“inhibit-or”逻辑门的实际检测结果；
[0059]
图6为本发明实施例中的“and-and-and”逻辑门的实际检测结果。
具体实施方式
[0060]
为了使本发明的发明目的、技术方案及其技术效果更加清晰，以下结合具体实施方式，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的具体实施方式仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明。
[0061]
所使用的实验材料和试剂，若无特别说明，均为常规可从商业途径所获得的耗材和试剂。
[0062]
在下述实施例中荧光光谱测量仪器均为spectramax i3x多功能酶标仪。
[0063]
一种用于检测冠状病毒的分子逻辑门检测系统
[0064]
本实施例中的用于检测冠状病毒的分子逻辑门检测系统，其主要基于核酸四面体的结构动态网络构建了“and-or”、“inhibit-or”和“and-and-and”分子逻辑门，从而实现三种冠状病毒的快速、高灵敏度检测。
[0065]
本实施例中的用于检测冠状病毒的分子逻辑门检测系统中包括核酸四面体(核酸四面体结构动态网络cdn)、发夹探针组、底物链组、核酸外切酶(exo iii，购自新英格兰生物实验室公司)和底物发夹组。
[0066]
核酸四面体由a、b、c和d共4类cdn探针链中的各一条组成。在下述实施例中，以a1-b-c-d2，a-b-c-d1和a-b-c1-d2三种组合为例进行说明。
[0067]
其中，各cdn探针链的核苷酸序列分别为：
[0068]
cdn探针链a：5'-gatatcagcgatacgcctacagcacttctttttacattcctaagtctgaaacattacagcttgctacacgagaagagccgccatagta-3'(seq id no.1)；
[0069]
cdn探针链a1：5'-gatatcagcgatacgcgtagtatcatttttacattcctaagtctgaaacattacagcttgctacacgagaagagccgccatagta-3'(seq id no.2)。
[0070]
cdn探针链b：5'-ttcagacttaggaatgtgcttcccacgtagtgtcgtttgtattggaccctcgcatttttactatggactctgcgtcacccatgttactct-3'(seq id no.3)。
[0071]
cdn探针链c：5'-tatcaccaggcagttgacagtgtagcaagctgtaatagatgcgagggtccaatactttttatcaccgtaccagcgtcacccatgttcgtca-3'(seq id no.4)；
[0072]
cdn探针链c1：5'-tatcaccaggcagttgacagtgtagcaagctgtaatagatgcgagggtccaatacttttttttattttctgcgtcacccatgttcgtca-3'(seq id no.5)。
[0073]
cdn探针链d：5'-tcaactgcctggtgataaaacgacactacgtgggaatctactatggcggctcttctttttttgattcagctcggcgtcacccatgttcctga-3'(seq id no.6)；
[0074]
cdn探针链d1：5'-tcaactgcctggtgataaaacgacactacgtgggaatctactatggcggctcttctttttttgattgctcagcgtcacccatgttcctga-3'(seq id no.7)；
[0075]
cdn探针链d2：5'-tcaactgcctggtgataaaacgacactacgtgggaatctactatggcggctcttctttttttgattgctcagcgtcacccatgttcctga-3'(seq id no.8)。
[0076]
其中cdn探针链中加粗部分为mg
2+
依赖性dna酶的亚单位，cdn探针链a或a1的mg
2+
依赖性dna酶亚单位序列分别与cdn探针链b，以及c或c1，以及d或d1或d2的mg
2+
依赖性dna酶亚单位序列在特定的底物链组的干预下会形成完整的mg
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依赖性dna酶链。cdn探针链b、c、c1、d、d1、d2的mg
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依赖性dna酶亚单位序列之间无法形成完整的mg
2+
依赖性dna酶链。
[0077]
发夹探针的核苷酸序列分别为：
[0078]
发夹探针h1：5'-gaagtgctgtagagagtccatagtttttttactatggactctctacagcacttcaatagtagttgt-3'(seq id no.9)；
[0079]
发夹探针h2：5'-gaagtgctgtagtggtacggtgatttttttatcaccgtaccactacagcacttccttcaactgcag-3'(seq id no.10)；
[0080]
发夹探针h3：5'-gaagtgctgtagcgagctgaatcatttttttgattcagctcgctacagcacttcctcagtagtatc-3'(seq id no.11)；
[0081]
发夹探针h4：5'-tgatactacagagtccatagtttttttactatggactctgtagtatcaaatagtagttgt-3'(seq id no.12)；
[0082]
发夹探针h5：5'-tgatactactggtacggtgatttttttatcaccgtaccagtagtatcacttcaactgcag-3'(seq id no.13)。
[0083]
其中，发夹探针h1、h4加粗部分靶向covid-19特异性序列，发夹探针h2、h5加粗部分靶向bat-sl-covzc45特异性序列，发夹探针h3加粗部分靶向sars-cov特异性序列。
[0084]
底物链组由3条底物链组成，其核苷酸序列为：
[0085]
sub-ad：5'-tcaggatraggatatc-3'(seq id no.14)。
[0086]
其中，ra为dna酶的酶切位点。底物链的5’端和3’端均分别连接有荧光基团和淬灭基团。在本发明实施例中，sub-ad的5’端连接有cy5，3’端连接有bhq2。
[0087]
底物发夹组中含有6条底物发夹链，其核苷酸序列分别为：
[0088]
hab：5'-tgatactacatgcaagcagagtatraggatatcaaaagcttgcta-3'(seq id no.15)；其中，hab加粗部分为hab片段z；
[0089]
hac：5'-atgcaagcaaaatgacgatraggatatcgcttgctatgagcaatca-3'(seq id no.16)；其中，hac加粗部分为hac片段s；
[0090]
hab片段z和hac片段s可以部分杂交形成部分双链体复合物sz。
[0091]
had：5'-gaagtgctgtaggtagtatcaagagtatraggatatcaaaatgatactac-3'(seq id no.17)；其中，had加粗部分为had片段s；
[0092]
hae：5'-gtagtatcaaaaatgacgatraggatatctgatactacctacag-3'(seq id no.18)；其中，hae加粗部分为hae片段s*；
[0093]
had片段可以与hae片段s*部分杂交。
[0094]
haf：5'-gaagtgctgtagtcaactgcagagagtatraggatatcaaaactgcagttga-3'(seq id no.19)；其中，haf加粗部分为haf片段s；
[0095]
hag：5'-gaagtgctgtaggtagtatcatgacgatraggatatcaaaatgatactac-3'(seq id no.20)；其中，hag加粗部分为hag片段z。
[0096]
其中，ra为dna酶的酶切位点。
[0097]
该分子逻辑门检测系统的检测方法为：
[0098]
(1)试验材料的准备与前处理：
[0099]
①
核酸四面体(cdn)的构建：
[0100]
将250nm的a、b、c和d四类cdn探针链的各一条(溶解于10mm hepes缓冲液(ph 7.2，20mm mgcl2)中)与10mm hepes缓冲液混合，在90℃退火10min，然后在1min内冷却到4℃，即可得到cdn。
[0101]
其中，cdn的纯化可采用qiaquick gel extraction kit(购自qiagen)进行，纯化步骤参考试剂盒说明书。
[0102]
②
发夹探针的发夹结构的获得：
[0103]
将发夹探针在hepes缓冲液(ph 7.2，20mm mgcl2)中加热至95℃，持续5min，然后冷却至室温，即可得到具有发夹结构的发夹探针。
[0104]
底物发夹的发夹结构的获得同步骤
②
。
[0105]
(2)冠状病毒的定性检测：
[0106]
在本实施例中，冠状病毒的定性是基于三种逻辑门(“and-or”、“inhibit-or”和“and-and-and”)的方式实现。
[0107]
各逻辑门的检测方法如下：
[0108]
执行“and-or”逻辑门对检测样品进行检测，具体检测方法为：
[0109]
将发夹探针组(具有发夹结构的发夹探针h4和h5)、检测样品、exo iii在25℃条件下混合孵育30min，然后加热至70℃，保持10～20min(本实施例为10min)使混合体系中的exo iii失活。然后再加入核酸四面体(cdn，由cdn探针链a1、b、c、d1组成)、sub-ad、镁离子溶液(在本发明实施例中，镁离子溶液为氯化镁)、hab、hac，室温(25
±
2℃)孵育45min(反应体系如表1所示)，记录670nm波长下的荧光信号，定性检测样品中的冠状病毒。
[0110]
表1
[0111][0112]“and-or”逻辑门的原理示意图如图1所示。
[0113]
当检测样品中含有covid-19时，其特异性序列会在eox iii酶与发夹探针h4的作用下产生序列a*b*，实现信号放大。eox iii酶灭活后，产生的序列a*b*会与cdn杂交，促使cdn探针链a1与cdn探针链b尾端的mg
2+
依赖性dna酶亚单位尾端结合形成完整的mg
2+
依赖性dna酶链，并在体系中的mg
2+
作用下酶切hab，得到hab片段z。
[0114]
当检测样品中含有bat-sl-covzc45时，其特异性序列会在eox iii酶与发夹探针h5的作用下产生序列a*c*，实现信号放大，eox iii酶灭活后，产生的序列a*c*会与cdn杂交，促使cdn探针链a1与cdn探针链c尾端的mg
2+
依赖性dna酶亚单位尾端结合形成完整的mg
2+
依赖性dna酶链，并在体系中的mg
2+
作用下酶切hac，得到hac片段s。
[0115]
当体系中同时存在hab片段z和hac片段s时，hab片段z和hac片段s会杂交得到部分双链体复合物sz，部分双链体复合物sz会促使cdn探针链a1与cdn探针链d1尾端的mg
2+
依赖性dna酶亚单位尾端结合形成完整的mg
2+
依赖性dna酶链，并在体系中的mg
2+
作用下酶切sub-ad，导致sub-ad两端的荧光基团与淬灭基团分离，产生强荧光。
[0116]
同时，由于hab片段z和hac片段s会杂交得到部分双链体复合物sz与sars-cov特异性序列具有相同的核酸片段，因此，当检测样品中含有sars-cov特异性序列时，sars-cov特异性序列也会促使cdn探针链a1与cdn探针链d1尾端的mg
2+
依赖性dna酶亚单位尾端结合形成完整的mg
2+
依赖性dna酶链，并在体系中的mg
2+
作用下酶切sub-ad，导致sub-ad两端的荧光基团与淬灭基团分离，产生强荧光。
[0117]
因此，“and-or”逻辑门的定性标准为：
[0118]
当检测到强荧光时，说明检测样品中的存在(a)～(e)中任一种情况：
[0119]
(a)检测样品中仅含有sars-cov；
[0120]
(b)检测样品中含有sars-cov和covid-19；
[0121]
(c)检测样品中含有sars-cov和bat-sl-covzc45；
[0122]
(d)检测样品中含有covid-19和bat-sl-covzc45；
[0123]
(e)检测样品中含有sars-cov、covid-19和bat-sl-covzc45。
[0124]
当未检测到强荧光时，说明检测样品中的存在(f)～(h)中任一种情况：
[0125]
(f)检测样品仅含有covid-19；
[0126]
(g)检测样品仅含有bat-sl-covzc45；
[0127]
(h)检测样品中不含sars-cov、covid-19和bat-sl-covzc45中的任意一种。
[0128]
执行“inhibit-or”逻辑门对检测样品进行检测，具体检测方法为：
[0129]
将发夹探针组(具有发夹结构的发夹探针h1和h2)、检测样品、exo iii在25℃条件下混合孵育30min，然后加热至70℃，保持10～20min(本实施例为10min)使混合体系中的exo iii失活。然后再加入核酸四面体(cdn，由cdn探针链a、b、c、d1组成)、底物链组、镁离子溶液、had、hae，室温(25
±
2℃)孵育45min(反应体系如表2所示)，记录670nm波长下的荧光信号，定性检测样品中的冠状病毒。
[0130]
表2
[0131][0132][0133]“inhibit-or”逻辑门的原理示意图如图2所示。
[0134]
当检测样品中含有covid-19时，其特异性序列会在eox iii酶与发夹探针h1的作用下产生序列a1*b1*，实现信号放大。eox iii酶灭活后，产生的序列a1*b1*会与cdn杂交，促使cdn探针链a与cdn探针链b尾端的mg
2+
依赖性dna酶亚单位尾端结合形成完整的mg
2+
依赖性dna酶链，并在体系中的mg
2+
作用下酶切had，得到had片段s。
[0135]
当检测样品中含有bat-sl-covzc45时，其特异性序列会在eox iii酶与发夹探针h2的作用下产生序列a1*c1*，实现信号放大，eox iii酶灭活后，产生的序列a1*c1*会与cdn杂交，促使cdn探针链a与cdn探针链c尾端的mg
2+
依赖性dna酶亚单位尾端结合形成完整的mg
2+
依赖性dna酶链，并在体系中的mg
2+
作用下酶切hae，得到hae片段s*。
[0136]
当体系中同时存在片段s*和片段s时，由于片段s和片段s*的互补碱基数量多于片
段s与sars-cov(对应于图2中的片段z)的互补碱基数量，因此，片段s*和片段s会优先结合，从而无法形成部分双链体复合物sz，从而无法进一步发生后续的反应，无荧光信号。
[0137]
当体系中无片段s*时，片段s会与sars-cov结合形成部分双链体复合物sz。体系中存在的部分双链体复合物sz，或存在sars-cov特异性序列中与部分双链体复合物sz序列相同的核酸片段会与cdn杂交，会促使cdn探针链a与cdn探针链d1尾端的mg
2+
依赖性dna酶亚单位尾端结合形成完整的mg
2+
依赖性dna酶链，并在体系中的mg
2+
作用下酶切sub-ad，导致sub-ad两端的荧光基团与淬灭基团分离，产生强荧光。
[0138]
因此，“inhibit-or”逻辑门的定性标准为：
[0139]
当检测到强荧光时，说明检测样品中仅存在covid-19和sars-cov。
[0140]
当未检测到荧光时，说明检测样品中存在(a)～(g)中任一种情况：
[0141]
(a)检测样品中不含sars-cov、covid-19和bat-sl-covzc45；
[0142]
(b)检测样品仅含有bat-sl-covzc45；
[0143]
(c)检测样品中仅含有sars-cov；
[0144]
(d)检测样品中含有sars-cov和bat-sl-covzc45；
[0145]
(e)检测样品仅含有covid-19；
[0146]
(f)检测样品中含有covid-19和bat-sl-covzc45；
[0147]
(g)检测样品中含有sars-cov、covid-19和bat-sl-covzc45。
[0148]
执行“and-and-and”逻辑门对检测样品进行检测，具体检测方法为：
[0149]
将发夹探针组(具有发夹结构的发夹探针h1)、检测样品、exo iii在25℃条件下混合孵育30min，然后加热至70℃，保持10～20min(本实施例为10min)使混合体系中的exo iii失活。然后再加入核酸四面体(cdn，由cdn探针链a、b、c1、d2组成)、sub-ad、镁离子溶液、hag、haf，室温(25
±
2℃)孵育45min(反应体系如表3所示)，记录670nm波长下的荧光信号，定性检测样品中的冠状病毒。
[0150]
表3
[0151]
组分终含量发夹探针h1250nmexo iii20u检测样品1μl核酸四面体(cdn)250nmsub-ad250nmhag250nmhaf250nm镁离子2mmddh2o补至100μl
[0152]“and-and-and”逻辑门的原理示意图如图3所示。
[0153]
当检测样品中含有covid-19时，其特异性序列会在eox iii酶与发夹探针h1的作用下产生序列a*b*，实现信号放大。eox iii酶灭活后，产生的序列a*b*会与cdn杂交，促使cdn探针链a与cdn探针链b尾端的mg
2+
依赖性dna酶亚单位尾端结合形成完整的mg
2+
依赖性dna酶链，并在体系中的mg
2+
作用下酶切haf，得到haf片段s。
[0154]
当体系中仅存在片段s时，haf片段s会与体系中的bat-sl-covzc45特异性序列中的片段c*杂交，得到部分双链体复合物sc*。部分双链体复合物sc*会与cdn杂交，促使cdn探针链a与cdn探针链c1尾端的mg
2+
依赖性dna酶亚单位尾端结合形成完整的mg
2+
依赖性dna酶链，并在体系中的mg
2+
作用下酶切hag，得到hag片段z。
[0155]
当体系中存在hag片段z时，hag片段z会与sars-cov中的片段d*结合形成部分双链体复合物zd*。体系中存在的部分双链体复合物zd*会与cdn杂交，会促使cdn探针链a与cdn探针链d2尾端的mg
2+
依赖性dna酶亚单位尾端结合形成完整的mg
2+
依赖性dna酶链，并在体系中的mg
2+
作用下酶切sub-ad，导致sub-ad两端的荧光基团与淬灭基团分离，产生强荧光。
[0156]
因此，“and-and-and”逻辑门的定性标准为：
[0157]
当检测到强荧光时，说明检测样品中同时含有sars-cov、covid-19和bat-sl-covzc45。
[0158]
当未检测到荧光时，说明检测样品中存在(a)～(g)中任一种情况：
[0159]
(a)检测样品中不含sars-cov、covid-19和bat-sl-covzc45；
[0160]
(b)检测样品仅含有bat-sl-covzc45；
[0161]
(c)检测样品中仅含有sars-cov；
[0162]
(d)检测样品中含有sars-cov和bat-sl-covzc45；
[0163]
(e)检测样品中仅含有covid-19；
[0164]
(f)检测样品中仅含有covid-19和bat-sl-covzc45；
[0165]
(g)检测样品中仅含有covid-19和sars-cov。
[0166]
结合“and-or”、“inhibit-or”和“and-and-and”三重逻辑门的检测结果，可以得到：
[0167]
(a)“inhibit-or”逻辑门出现荧光：说明检测样品中仅存在covid-19和sars-cov；
[0168]
(b)“and-and-and”逻辑门出现荧光：检测样品中含有sars-cov、covid-19和bat-sl-covzc45。
[0169]
(c)“and-or”逻辑门出现荧光，但“inhibit-or”逻辑门和“and-and-and”逻辑门均无荧光：说明检测样品中仅含有sars-cov、或仅含有sars-cov和bat-sl-covzc45、或仅含有covid-19和bat-sl-covzc45。
[0170]
(d)“and-or”逻辑门无荧光：说明检测样品中仅含有covid-19、或仅含有bat-sl-covzc45、或不含sars-cov和covid-19和bat-sl-covzc45。
[0171]
分子逻辑门检测系统的检测效果验证
[0172]
发明人分别采用不同的冠状样品组成来对上述分子逻辑门检测系统进行检测验证。
[0173]
其中，发明人分别以covid-19病毒片段(dna1)、bat-sl-covzc45病毒片段(dna2)、sars-cov病毒片段(dna3)(浓度均为1nm)作为检测样品进行测试。
[0174]
dna1～3均是基于gisaid和genbank中的covid-19、bat-sl-covzc45和sars-cov全基因组序列获得的对应的特异性序列，能够用于代表covid-19、bat-sl-covzc45和sars-cov。
[0175]
其中，covid-19病毒片段的核苷酸序列为：
[0176]
dna1：5'-agacaactactattcaaaca-3'(seq id no.21)。
[0177]
bat-sl-covzc45病毒片段的核苷酸序列为：
[0178]
dna2：5'-ctgcagttgaagaaaataaa-3'(seq id no.22)。
[0179]
sars-cov病毒片段的核苷酸序列为：
[0180]
dna3：5'-tgatactactgagcaatca-3'(seq id no.23)。
[0181]
(1)“and-or”逻辑门的检测效果：
[0182]
使用上述实施例中的“and-or”逻辑门检测体系对不同组成的新冠样品进行检测，检测波长设置为670nm。
[0183]
结果如图4和表4所示。
[0184]
表4 不同样品输入和荧光结果输出情况
[0185][0186][0187]
其中，上述0和1均为二进制表示法，1表示有(基于不同的情况，可以表示添加或有荧光)，0表示未无(基于不同的情况，可以表示未添加或无荧光)。
[0188]
根据结果可以发现，以特定检测波长为阈值(670nm)，仅(0,0,1)、(0,1,1)、(1,1,0)、(1,0,1)和(1,1,1)组能够显示出荧光信号，对应其结果，可以知晓检测样品中可能存在以下几种情况：(a)检测样品中仅含有sars-cov；(b)检测样品中含有sars-cov和covid-19；(c)检测样品中含有sars-cov和bat-sl-covzc45；(d)检测样品中含有covid-19和bat-sl-covzc45；(e)检测样品中含有sars-cov、covid-19和bat-sl-covzc45。
[0189]
(2)“inhibit-or”逻辑门的检测效果：
[0190]
使用上述实施例中的“and-or”逻辑门检测体系对不同组成的新冠样品进行检测，检测波长设置为670nm。
[0191]
结果如图5和表5所示。
[0192]
表5 不同样品输入和荧光结果输出情况
[0193][0194]
其中，上述0和1均为二进制表示法，1表示有(基于不同的情况，可以表示添加或有荧光)，0表示未无(基于不同的情况，可以表示未添加或无荧光)。
[0195]
根据结果可以发现，以特定检测波长为阈值(670nm)，仅(1,0,1)组能够显示出荧光信号，对应其结果，可以知晓检测样品中仅存在covid-19和sars-cov。
[0196]
(3)“and-and-and”逻辑门的检测效果：
[0197]
使用上述实施例中的“and-and-and”逻辑门检测体系对不同组成的新冠样品进行检测，检测波长设置为670nm。
[0198]
结果如图6和表6所示。
[0199]
表6 不同样品输入和荧光结果输出情况
[0200][0201]
其中，上述0和1均为二进制表示法，1表示有(基于不同的情况，可以表示添加或有荧光)，0表示未无(基于不同的情况，可以表示未添加或无荧光)。
[0202]
根据结果可以发现，以特定检测波长为阈值(670nm)，仅(1,1,1)组能够显示出荧光信号，对应其结果，可以知晓检测样品同时含有sars-cov、covid-19和bat-sl-covzc45。
[0203]
同时利用上述三种逻辑门，可以得到：
[0204]
(a)“inhibit-or”逻辑门出现荧光：说明检测样品中仅存在covid-19和sars-cov；
[0205]
(b)“and-and-and”逻辑门出现荧光：检测样品中含有sars-cov、covid-19和bat-sl-covzc45。
[0206]
(c)“and-or”逻辑门出现荧光，但“inhibit-or”逻辑门和“and-and-and”逻辑门均无荧光：说明检测样品中仅含有sars-cov、或仅含有sars-cov和bat-sl-covzc45、或仅含有covid-19和bat-sl-covzc45。
[0207]
(d)“and-or”逻辑门无荧光：说明检测样品中仅含有covid-19、或仅含有bat-sl-covzc45、或不含sars-cov和covid-19和bat-sl-covzc45。
[0208]
上述结果能够充分适用于冠状病毒样品的定性，能够准确定性出样品中的是否含有sars-cov、covid-19和bat-sl-covzc45。
[0209]
分子逻辑门检测系统的特异性评估
[0210]
采用上述分子逻辑门检测系统检测不同的干扰序列，检测步骤同上述实施例。
[0211]
干扰序列包括：
[0212]
①
dna1～3的单碱基错配序列(其中，下划线部分为对应的错配碱基)：
[0213]
dna1单碱基错配序列mc1：5'-agtcaactactattcaaaca-3'(seq id no.24)；
[0214]
dna2单碱基错配序列mb1：5'-cttcagttgaagaaaataaa-3'(seq id no.25)；
[0215]
dna3单碱基错配序列ms1：5'-tgttactactgagcaatca-3'(seq id no.26)。
[0216]
②
dna1～3的双碱基错配序列(其中，下划线部分为对应的错配碱基)：
[0217]
dna1双碱基错配序列mc2：5'-agtctactactattcaaaca-3'(seq id no.27)；
[0218]
dna2双碱基错配序列mb2：5'-cttctgttgaagaaaataaa-3'(seq id no.28)；
[0219]
dna3双碱基错配序列ms2：5'-tgtttctactgagcaatca-3'(seq id no.29)。
[0220]
③
dna1～3的三碱基错配序列(其中，下划线部分为对应的错配碱基)：
[0221]
dna1三碱基错配序列mc3：5'-agtctattactattcaaaca-3'(seq id no.30)；
[0222]
dna2三碱基错配序列mb3：5'-cttctgatgaagaaaataaa-3'(seq id no.31)；
[0223]
dna3三碱基错配序列ms3：5'-tgtttcaactgagcaatca-3'(seq id no.32)。
[0224]
④
dna1～3的非互补序列：
[0225]
dna1非互补序列mcnc：5'-tctgttgttgttttgtttgt-3'(seq id no.33)；
[0226]
dna2非互补序列mbnc：5'-tattttagttttttttgttt-3'(seq id no.34)；
[0227]
dna3非互补序列msnc：5'-gttgttattgttttttgtt-3'(seq id no.35)。
[0228]
结果发现，干扰序列在670nm下均无荧光信号，说明本发明实施例中的分子逻辑门检测系统能够很好的区分单个碱基错配的干扰序列，具有极好的选择性。
[0229]
分子逻辑门检测系统的灵敏度评估：
[0230]
为了检测上述实施例中的检测方法的灵敏度，发明人选择了不同浓度的dna1、dna2、dna3及其混合样品(当存在多种混合时，dna1、dna2、dna3在混合溶液中的终浓度均保持相同，分别均为0、10fm、100fm、1pm、10pm、100pm或1nm)进行检测。
[0231]
检测方法和检测体系同上述实施例。
[0232]
结果发现，终浓度为10fm或以上的检测样品均能被上述实施例中的检测方法检测出荧光反应，说明其有效检出限至少为10fm。而发明人进一步采用其体系构建定量检测方法后，发现其实际的检测限可以达到2.5fm(s/n＝3，含dna1)，3.1fm(s/n＝3，含dna2)，2.9fm(s/n＝3，含dna3)，说明本发明实施例中的分子逻辑门检测系统对于冠状病毒的检测具有极高的灵敏度。
[0233]
综上所述，本发明中的分子逻辑门检测系统主要用于对冠状病毒感染者体内的病毒存在情况进行分析，从而有效确定对于特定情况的准确用药，以避免因错误用药导致治疗延误。
[0234]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。