人白血病BCR-ABL融合突变一步法检测试剂盒的制作方法

人白血病bcr
‑
abl融合突变一步法检测试剂盒
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，尤指一种基于数字pcr技术一步法检测的人白血病bcr
‑
abl融合突变一步法检测试剂盒。


背景技术：

2.费城染色体(ph)是1960年首次发现的人第9号染色体与22号染色体之间的平衡易位产生的微小染色体。该易位导致位于人类9号染色体中长臂abl基因(位置q34)与22号染色体上长臂bcr基因(位置q11)发生并列性易位而产生新的融合基因bcr
‑
abl；bcr
‑
abl融合基因有三种变异体：p190型、 p210型、p230型, 其中p210「又称b3a2/b2a2」（或称「e14a2/e13a2」）型最多见， 占90%慢粒白血病患者(chronic myelogenous leukemia，cml) 以上以及1/3的ph阳性的成人前体b细胞急性淋巴细胞白血病(precursor b
‑
acute lymphoblastic leukemia，ball)患者。该基因可转录出一个8.5kb的异常mrna，最终翻译成210kd大小的蛋白质—p210，p210具有较强的酪氨酸蛋白激酶活性，可通过多种信号转导途径来活化原癌基因和某些细胞因子，导致细胞的恶性转化。
3.bcr
‑
abl 融合基因表达水平可作为白血病患者分型诊断依据、靶向用药指导以及微小残留病的检测和预后评估的可靠指标；监测患者血液中bcr
‑
abl %突变水平已成为患者管理的国际标准。
4.目前，bcr
‑
abl融合基因常用的检测包括细胞常规染色体检测、荧光原位杂交技术 (fish)、免疫分型、聚合酶链式反应等检测方法。常规染色体检测是基础的临床辅助诊断cml 方法，而fish是常规染色体检测的进步，采集骨髓或外周血作为研究对象，对分裂中期和间期核细胞均能检测，对隐匿型和变异性也可同步检测分析。灵敏度较高，特异性较好，但常见的双色单融合探针检测bcr/abl融合基因时，会因为bcr和abl基因信号随机分布或光学重叠，导致4％
‑
10％的假阳性率。过高的假阳性率不仅影响到灵敏度与特异性，还可一定程度上影响患者检测结果的解释。采用流式细胞术(fcm)可对大量细胞进行快速分析，准确方便。但fcm法需要特殊仪器，操作技术要求较高，价格昂贵，且结果重复性不好。而聚合酶链式反应检测方法主要包括逆转录后直接测序法、逆转录后普通pcr、荧光定量pcr等。 逆转录后普通pcr或直接测序法是最直接的bcr
‑
abl融合基因检测方法，但检测灵敏度低，常用于初诊患者。qpcr技术检测成本较低，但其在定量检测中依赖标准参考品，且易受到引物扩增效率影响导致检测灵敏度与准确性不够高，无法实现对微小残留病有效监测。综上所述，现有的bcr
‑
abl融合基因或ph阳性染色体检测方法的检测准确性与灵敏度不高。
5.检测报告结果的准确性直接影响临床疾病的诊断和治疗效果的判断，因此亟需研制更加敏感和精确的血液中bcr
‑
abl融合基因 mrna表达水平定量方法和试剂，制定标准化的检测和结果判定方法，以提高检测临床应用的可靠性。数字pcr (digital pcr)是近年来新出现的技术，它的原理是将一个标准pcr反应分配到大量微小的反应器中，在每个反应器中包含或不包含一个或多个拷贝的目标分子（dna模板），实现“单分子模板pcr扩增”，pcr扩增后，经生物芯片分析仪进行荧光强度检测。与阴性微滴相比，包含核酸分子的阳性微滴的
荧光信号强度增加，根据泊松分布的原理，通过阳性微滴比例计算目标核酸分子的绝对拷贝数。整个过程不依赖于标准曲线和参照样本，直接检测样本获得目标序列的拷贝数。数字pcr特别适用于依靠ct值不能很好分辨的应用领域：拷贝数变异、突变检测、基因相对表达研究、二代测序结果验证、mirna表达分析、单细胞基因表达分析等。因此，也适合用于检测bcr
‑
abl 融合突变微小残留病的有效监测。


技术实现要素：

6.本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种基于数字pcr技术一步法检测的人白血病bcr
‑
abl融合突变的检测试剂盒，旨在提高对bcr
‑
abl融合基因检测的准确性与灵敏度。
7.为实现上述目的，本发明的目的通过下述技术方案实现：本发明提供一种人白血病bcr
‑
abl融合突变一步法检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括：微滴式数字pcr用预混液；bcr
‑
abl p210 突变检测混合液，包括bcr
‑
abl p210 mrna引物与探针组合，以及内标基因gusb mrna的引物和探针组合；阳性对照、阴性对照与空白对照。
8.优选地，所述的bcr
‑
abl p210 mrna引物与探针组合的序列如下：bcr
‑
abl
‑
p210 f1a: 5'
ꢀ‑
ccgctgaccatcaayaag
‑3’
；bcr
‑
abl
‑
p210 r5: 5'
ꢀ‑
ccaacgagcggcttca
‑3’
；bcr
‑
abl
‑
p210 p5:5'
ꢀ‑
fam
‑
ccagtagcatctgactttgag
‑
mgb
‑
3'。
9.优选地，所述的内标基因gusb mrna的引物和探针组合的序列如下：gusb
‑
f1：5'
‑
acgcagaaaatacgtggt
‑
3'gusb
‑
r1:5'
‑
ccgagtgaagatccccttttta
‑
3'gusb
‑
p1：5'
‑
vic
‑
gatttcatgactgaacagtca
‑
mgb
‑
3'。
10.优选地，所述bcr
‑
abl
‑
p210的mrna引物与探针组合中，引物的工作浓度为500
‑
1000nm，其中优选浓度为900nm，探针的工作浓度为100
‑
300nm，其中优选浓度为250nm。
11.优选地，所述内标基因gusb mrna的引物和探针组合中，引物的工作浓度为500
‑
1000nm，其中优选浓度为900nm，探针的工作浓度为100
‑
300nm，其中优选浓度为250nm。
12.优选地，所述的微滴式数字pcr用预混液包括缓冲液、dntps、taq 酶、逆转录酶。
13.优选地，所述bcr
‑
abl p210 mrna引物与探针组合、内标基因gusb mrna的引物和探针组合配制成10
×
的bcr
‑
abl p210 突变检测混合液。
14.优选地，所述的阳性对照为bcr
‑
abl融合基因突变的 k562细胞系提取的rna配制而成。
15.优选地，所述的阴性对照为突变阴性 hl60细胞系提取的rna配制而成。
16.优选地，所述的空白对照为无核酶水分装获得，用于监控检测试剂是否被污染。
17.本发明的一种使用人白血病bcr
‑
abl融合突变一步法检测试剂盒进行检测的应用方法，包括以下步骤：（1）首先，提取样本rna，准备提取试剂盒；
（2）配制pcr反应体系： 每个样本检测取微滴式数字pcr用预混液、 bcr
‑
abl p210 突变检测混合液、rna样本，无核酶水；同时配制阳性对照、阴性对照和空白对照检测：分别替换所述pcr反应体系中的rna样本以获得；每管pcr反应体系配制完成后旋震荡数秒离心混合均匀；（3）微滴制备、pcr扩增：将步骤（2）所述pcr反应体系采用microdrop
‑
100数字pcr平台的样本制备仪芯片进行微滴制备，将得到的微滴使用pcr扩增仪进行扩增；（4）微滴荧光检测：采用microdrop
‑
100数字pcr平台的生物芯片分析仪对步骤（3）pcr扩增结束后的微滴进行荧光检测，根据荧光信号类型判断样品中是否含有融合基因，分析获得拷贝数突变比。
18.优选地，所述的应用方法中，所述步骤（1）的提取试剂盒中，其rna提取后通过nanodrop 微量分光光度计检测浓度，rna浓度不低于100ng/μl；所述步骤（2）的样本为全血或骨髓液中提取的rna；所述步骤（2）的pcr反应体系中rna样本的加入量不低于500ng；所述步骤（2）的pcr反应体系为20μl：其中微滴式数字pcr用预混液5μl、bcr
‑
abl p210 突变检测混合液 2μl、rna样本12.5μl、补无核酸酶水至总体积20μl；所述步骤（3）的pcr扩增的程序为：50℃反应30min；95℃反应10min；95℃反应30sec，62℃反应40sec，45个循环；98℃反应10min；16℃终止；每步设置1℃/sec的升降温速度；所述步骤（4）中， 微滴荧光检测的通道1荧光微滴是bcr
‑
abl p210信号微滴，通道2荧光微滴是内参基因gusb信号微滴，通过检测两个通道信号微滴获得的拷贝数即可计算bcr
‑
abl p210/gusb%突变比水平。
19.优选地，所述与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：相比于现有的其他检测技术，本发明技术具有检测过程更简便高效、结果准确性高、灵敏度高等优点，具体如下：（1）检测过程更简便高效：本发明具有不同于传统的两步检测方法，而是直接用提取后的rna 样本加入到pcr检测体系，逆转录和基因扩增在一个体系一次实验操作完成，而不需要预先将rna逆转录成cdna的实验，简化了操作步骤；（2）检测结果准确性高：本发明基于以永诺医疗microdrop
‑
100微滴式数字pcr技术平台，绝对定量的方式，不依赖于标准曲线和参照样本，直接检测目标序列的拷贝数，准确度高。它的原理是将一个标准pcr反应分配到大量微小的反应器中，在每个反应器中包含或不包含一个或多个拷贝的目标分子( rna模板) ，实现“单分子模板pcr扩增”，经pcr扩增后，生物芯片阅读仪对微液滴逐个进行荧光强度检测。与阴性微液滴相比，包含核酸分子的阳性微液滴的荧光信号强度增加。最后根据泊松分布的原理，通过阳性微液滴的比例计算出目标核酸分子的绝对拷贝数。另外选用了gusb基因作为内参基因可有效避免pcr扩增过程假阳性的产生，检测结果特异性强的特点；（3）灵敏度高：本发明以永诺医疗microdrop
‑
100微滴式数字pcr技术平台为依托，使用永诺医疗生产的一步法超敏微滴式数字pcr用预混液，只需受检者1
‑
1.5ml的外周血进行rna的提取，无需额外对提取的rna样本进行浓缩操作，直接检测可获得30万以上的内参
基因拷贝数，达到0.001%突变比的检出水平，实现mr 5.0的监测，具有灵敏度超高的优点。
附图说明
20.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例。
21.图1是本发明的检测bcr
‑
abl p210阴性细胞系hl60 的rna结果二维图；图2是本发明检测临床阴性血液样本的rna结果二维图；图3是本发明检测bcr
‑
abl p210突变细胞系k562的 rna结果二维图；图4是本发明检测bcr
‑
abl融合突变国际标准品erm
‑
ad623d的结果二维图；图5是本发明以5管bcr
‑
abl p210/gusb% 突变比线性样本混合液各4μl做样本进行检测的结果一维图；图6是本发明以5管bcr
‑
abl p210/gusb% 突变比线性样本混合液进行检测的线性结果图；图7是本发明以4管rna bcr
‑
abl p210/gusb% 突变比混合液各4μl做样本进行检测的结果一维图。
具体实施方式
22.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
23.实施例 1一、一种人白血病bcr
‑
abl融合突变一步法检测试剂盒，该试剂盒含有：（1） 微滴式数字pcr用预混液，为一步法超敏微滴式数字pcr用预混液：包括缓冲液、dntps、taq 酶、逆转录酶等（是广东永诺医疗科技有限公司产品，货号s0200020401，与microdrop
‑
100微滴式数字pcr系统配套使用）；（2）bcr
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abl p210 突变检测混合液，包括bcr
‑
abl p210 mrna引物与探针组合，以及内标基因gusb mrna的引物和探针组合：所述的bcr
‑
abl p210 mrna引物与探针组合的序列如下：bcr
‑
abl
‑
p210 f1a: 5'
ꢀ‑
ccgctgaccatcaayaag
‑3’
；bcr
‑
abl
‑
p210 r5: 5'
ꢀ‑
ccaacgagcggcttca
‑3’
；bcr
‑
abl
‑
p210 p5:5'
ꢀ‑
fam
‑
ccagtagcatctgactttgag
‑
mgb
‑
3'；所述bcr
‑
abl
‑
p210的mrna引物与探针组合中，引物的工作浓度为500
‑
1000nm，优选浓度为900nm，探针的工作浓度为100
‑
300nm，优选浓度为250nm；所述的内标基因gusb mrna的引物和探针组合的序列如下：gusb
‑
f1：5'
‑
acgcagaaaatacgtggt
‑
3'gusb
‑
r1:5'
‑
ccgagtgaagatccccttttta
‑
3'gusb
‑
p1：5'
‑
vic
‑
gatttcatgactgaacagtca
‑
mgb
‑
3'；
所述gusb mrna引物与探针组合中，引物的工作浓度为500
‑
1000nm，优选浓度为900nm，探针的工作浓度为100
‑
300nm，优选浓度为250nm；所述bcr
‑
abl p210 mrna引物与探针组合、内标基因gusb mrna的引物和探针组合配制成10
×
的bcr
‑
abl p210 突变检测混合液；（3）阳性对照：所述的阳性对照为bcr
‑
abl融合基因突变的 k562细胞系提取的rna配制而成；（4）阴性对照：所述的阴性对照为bcr
‑
abl融合基因突变阴性 hl60细胞系提取的rna配制而成；（5）空白对照：所述的空白对照为用商业化的无核酶水分装获得，用于监测环境或监测试剂是否被阳性样本污染。
24.二、提供一种人白血病bcr
‑
abl融合突变一步法微滴式数字pcr检测方法，包括以下步骤：（1）样本：适用样本类型为全血或骨髓；（2）样本处理和核酸提取（样本处理区）购买商业化的核酸提取试剂盒，按核酸提取试剂盒说明书对样本进行rna提取，将提取的rna溶液用nano
‑
drop进行核酸浓度测定,rna浓度不低于100ng/μl；（3）试剂配制（试剂准备区）a. 将试剂盒所有组分解冻至室温，各组分充分溶解后振荡混合均匀，短暂离心；b.确定反应数n,n=待检样本数（n）+对照样品数（3）+1，样本反应体系总体积为20μl。取相应样本数无核酶离心管，根据下表，在室温下为所需的反应量配制反应混合物，移液枪吸打5
‑
10次充分混匀，短暂离心后将上述混合液按 7μl/管进行分装到独立无核酶污染的离心管，如下表1：表1c.加样（样本制备区）将提取的rna直接作为模板进行检测，在上述步骤分装反应混合液管中加入rna量不低于500ng，加入rna样本体积至反应总体积20μl, 如果加入样本总反应体积不足20μl,则补无核酶水至总反应体积20μl; 另外对照品样本检测管中加入对照样本体积1μl,补水至总反应体积20μl；盖紧管盖，震荡数秒混合均匀，短暂离心将管壁上的液体全部甩至管底（避免产生气泡），然后进行制备微液滴。
25.（4）制备微液滴d. 取上述反应管中的 20 μl 反应混合液，进行微滴的生成，具体操作步骤按照永诺医疗microdrop
ꢀ‑
100样本制备仪说明书指引进行。
26.(5)pcr扩增（扩增检测区）将已封膜的96孔pcr反应板进行pcr反应扩增，扩增程序为：50℃反应30min；95℃
反应10min；95℃反应30sec，62℃反应40sec，45个循环；98℃反应10min； 16℃终止；每步都设置1℃/sec的升降温速度。
27.(6)微液滴检测和结果分析g.pcr扩增完后，将96孔pcr反应板置永诺医疗microdrop
‑
100数字pcr平台的生物芯片分析仪中根据说明书指引进行检测获得基因拷贝数结果；(7)检测结果判定，具体包括步骤：h.微滴生成有效性判断：每个反应管的总微滴数≥50000，若总微滴数＜50000，该反应孔的微滴生成不理想，需重新进行微滴生成；i.落在通道 1和双阳区的阳性微滴数之和≥3 个，判定为阳性样本，按融合基因比例计算公式：通道1/(通道1+通道2) 进行计算，获得融合基因突变比例；j.落在通道1和双阳区的阳性微滴数之和<3 个，且内标基因拷贝数<3000，建议重新提取核酸，以免由于核酸加入量不够，而产生漏检；k.落在通道1和双阳区的阳性微滴数之和<3 个，且内标基因拷贝数≥3000，判定为低于检测限。
28.l.试剂盒的检测限与加入检测体系的rna样本中总拷贝数相关。当进入检测体系内参基因和突变基因的总拷贝数在≥500000 copies时，本试剂盒能检出 0.001%的 bcr
‑
abl p210 融合基因突变水平。
29.实施例2：用质粒样本在microdrop
‑
100数字pcr平台开发的试剂盒进行灵敏度及最低突变比检出限测试实验，具体步骤是：（1）将商业人工合成的bcr
‑
abl p210阳性质粒（浓度x105cp/μl）用内标gusb质粒（浓度x105cp/μl）做母液，按理论突变比例梯度稀释配制，配制得bcr
‑
abl p210/gusb%突变比10%、1％、0.1％、0.01％、0.001％的混合液5管；（2）取上述5管bcr
‑
abl p210/gusb% 突变比混合液各4μl做样本，按照试剂盒的检测步骤方法进行检测；（3）检测得到结果如图5的一维图和表2所示：表2
样本名称总微滴数通道1p210拷贝数通道2内参基因拷贝数总拷贝数通道1/通道2实测比例%实测log10理论log10bcr
‑
ablp210/gusb
‑
0.001%700412.1293432.0293433.90.0007%
‑
5.2
‑
5.0bcr
‑
ablp210/gusb
‑
0.01%7432416.9309447.8309464.60.005%
‑
4.3
‑
4.0bcr
‑
ablp210/gusb
‑
0.1%72550178.5297905.6298084.10.060%
‑
3.2
‑
3.0bcr
‑
ablp210/gusb
‑
1%709072184.0286452.6288636.70.762%
‑
2.1
‑
2.0bbcr
‑
ablp210/gusb
‑
10%7417130039.8322743.2352783.09.308%
‑1‑
1.0
（4）将最低突变比样本bcr
‑
abl p210/gusb
‑
0.001%, 重复20次检测得到结果如下表3所示，都是在0.001%突变比水平，阳性检测率100%：表3
（5）根据实施例2所述结果，本发明试剂盒检测结果与理论值相符，说明本发明试剂盒具有高的灵敏度和准确性。本发明的可检出0.001%的突变水平。
30.实施例3：用欧洲标准局bcr
‑
abl pdna校准物erm
‑
ad623质粒样本对在microdrop
‑
100数字pcr平台开发的试剂盒进行准确性测试实验（1）检测样本是欧洲标准局bcr
‑
abl pdna校准物erm
‑
ad623，操作步骤根据试剂盒方法进行检测，获得的结果如下表4所示：表4
（2）根据上表所述结果，本发明试剂盒检测国际标准品，结果显示与理论值一致r2>0.99，检测结果准确度高，拷贝数都在理论值范围之内。
31.实施例4：用细胞系rna样本对在microdrop
‑
100数字pcr平台开发的试剂盒进行线性测试，具体步骤是：（1）分别将bcr
‑
abl p210突变型阳性k562细胞和 阴性hl60样本提取的rna用nano
‑
drop检测浓度后，都分别用无核酶水稀释约为125ng/μl浓度，再用hl60 rna(125ng/μl)做配制突变比稀释母液，按体积比例梯度稀释k562 rna(125ng/μl)，配制获得约1%、0.1%、0.01%、0.001%的混合rna样本：（2）取上述4管rna bcr
‑
abl p210/gusb% 突变比混合液各4μl ，按照试剂盒的检测步骤方法检测；（3）检测得到结果如下表5和图7的一维图所示：表5（4）根据实施例4所述结果，本发明试剂盒检测结果符合理论值，说明本发明具有高的灵敏度和准确性，本发明的可检出0.001%的突变水平。
32.实施例5：用临床阴性全血rna样本对在microdrop
‑
100数字pcr平台开发的试剂盒进行特异性测试，具体步骤是：（1）取16例临床阴性外周全血样本提取rna： 根据购买商业化的总rna提取试剂盒说明书，其中8例分别取250μl全血样本进行rna提取，8例取1.2ml全血样本进行rna提取，提取洗脱rna体积都为30μl;（2）对步骤（1）提取的rna溶液用nano
‑
drop进行核酸浓度测定，浓度结果见下表6；
（3）取步骤（1）250μl 全血提取的rna样本 2μl，按照本发明试剂盒的检测步骤方法检测；（4）取步骤（1）1.2ml全血提取的rna样本 12.5μl，按照本发明试剂盒的检测步骤方法检测；（5）检测得到结果如下表6和表7所示：表6表7（6）根据实施例5所述结果，本发明试剂盒检测临床阴性外周血样本rna结果比值都小于0.001%，都是阴性；另外本发明只需要小于1.5ml外周血样本，即可检测到总拷贝数30万以上的背景，达到了m5.0的监测水平。
33.实施例6：用临床阳性样对在microdrop
‑
100数字pcr平台开发的试剂盒进行验证
测试（1）在去医院血液科实验室检测剩余的3个阳性突变rna样本：1/3/8号样本已知突变比；（2）使用本发明试剂盒进行每个样本复孔检测，结果见下表8；（3）根据实施例6所述结果，本发明试剂盒检测临床阳性突变 rna 样本与临床该样本已知的比值接近。
34.表8以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明的技术范围作任何限制，本行业的技术人员，在本技术方案的启迪下，可以做出一些变形与修改，凡是依据本发明的技术实质对以上的实施例所作的任何修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。