一种鉴别RV感染以及鉴定病毒基因型的方法及其应用

一种鉴别rv感染以及鉴定病毒基因型的方法及其应用
技术领域
1.本发明涉及生物技术技术领域，具体涉及一种鉴别rv感染以及鉴定病毒基因型的方法及其应用。


背景技术：

2.轮状病毒(rotavirus，rv)属呼肠孤病毒科(reoviridae)，轮状病毒属，该病毒于1973年被发现并分离，是引起婴幼儿和多种幼龄动物病毒性腹泻的重要病原之一。目前尚无理想的治疗rv感染的特效药物，世界卫生组织对疫苗开发给予了高度重视，许多国际组织都将开发和使用安全有效的疫苗作为当务之急的全球目标。在动物中首次被发现的是牛的轮状病毒，能引起犊牛的腹泻，随后报道了绵羊、山羊、鹿、兔、幼驹、小鼠等动物因轮状病毒感染引起腹泻。
3.轮状病毒分为a～j十个群，其中a～c群既能感染动物，也可感染人且产生严重的肠道症状。感染后的主要症状为高热、频繁呕吐、脱水，可持续1～9天。犊牛和鹿轮状病毒能感染仔猪，而仔猪、猴、羔羊可被人轮状病毒感染并发病。轮状病毒中有4群(a、b、c、e)可感染猪，其中a群是主要的研究对象。轮状病毒感染可引起严重经济损失，4周龄以内的仔猪群发病率超过80％，死亡率为7％～20％。仔猪感染轮状病毒后，经过12～24h潜伏期，出现厌食、不安。严重的在1～4h后还发生大容量腹泻，排水样粪便，颜色为黄色到白色，导致仔猪生长缓慢，给养猪业带来巨大经济损失。
4.轮状病毒具有明显的季节性，晚秋、冬季为其高发期，但该病毒污染性极强，加之存活能力强，常导致地区常年流行，季节性不明显。猪群一旦曾发生本病，随后将会长期发生，隐性感染的动物会长期向体外排毒。目前养猪场轮状病毒感染率在20～30％，仅次于猪流行性腹泻病毒感染。
5.一旦猪群或人群中发生rv感染，病毒快速诊断是首要环节。胶体金试纸条快速，但特异性及敏感性较差，容易产生假阳性和假阴性；荧光定量pcr敏感，但该方法目前不能准确的鉴定基因型且需要的设备较为昂贵；其次加样环节不能污染否则结果易产生假阳性。
6.目前急需开发一种快速、准确能够鉴别rv感染以及分析病毒基因型的方法，为病毒的防控提供参考。


技术实现要素：

7.本发明的目的在于提供一种操作简单、检测周期短、费用低且检测敏感性高的鉴别rv感染以及鉴定病毒基因型的方法。
8.为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
9.一种鉴别rv感染以及鉴定病毒基因型的方法，包括：
10.s101引物设计：
11.基于轮状病毒vp4基因保守motif和锚定引物设计反转录引物conrev r；
12.s102病毒核酸提取：
13.取200μl肛拭子pbs上清液，4℃、2000r/min离心10min后取上清，用病毒基因组dna/rna提取试剂盒提取病毒rna；
14.s103病毒核酸反转录：
15.s301，取提取得到的rna 4.5μl、conrev r 0.5μl混匀后65℃保温5min后，立即冰浴5min；
16.s302，10μl反应体系中，依次加入10mm的dntp 0.5μl、5
×
m-mlv buffer 2μl、m-mlv 0.5μl、rri 0.25μl、h2o 1.75μl，混匀后42℃保温1h；
17.s104 pcr扩增：
18.s401，第一轮pcr扩增，pcr反应体系50μl：2
×
premix 25μl、con f 1μl、anchor r 1μl、cdna 1μl、ddh2o 22μl；pcr反应30～55个循环；72℃，10min；
19.s402，第二轮pcr产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测后，将目的基因片段回收后进行第二轮pcr；
20.s105测序分析：
21.将目的基因片段回收后进行测序分析，确定毒株基因型。
22.进一步的，所述的vp4基因保守motif为nt802-806：atgca。
23.进一步的，所述的锚定引物设计反转录引物conrev r如下表；
[0024][0025]
进一步的，所述的肛拭子pbs为肛拭子置于500μl pbs所得。
[0026]
进一步的，所述的conrev r浓度为50μm；
[0027]
进一步的，所述的第一轮pcr扩增反应条件为：94℃，5min；94℃，30s、50℃，30s、72℃，45s；30～55个循环；72℃，10min；
[0028]
进一步的，所述的第二轮pcr扩增反应条件为：94℃，5min；94℃，30s、55℃，30s、72℃，45s；30～55个循环；72℃，10min。
[0029]
进一步的，所述的测序分析为blast基因型比对分析。
[0030]
本发明还提供一种鉴别rv感染以及鉴定病毒基因型方法的应用。
[0031]
一种鉴别rv感染以及鉴定病毒基因型方法的应用，所述的方法用于鉴定轮状病毒vp4基因型。
[0032]
本发明还提供另外一种鉴别rv感染以及鉴定病毒基因型方法的应用。
[0033]
一种鉴别rv感染以及鉴定病毒基因型方法的应用，所述的方法用于rv流行病学监测及防控。
[0034]
轮状病毒是引起婴幼儿和多种幼龄动物病毒性腹泻的重要病原之一。而人源轮状病毒和猪源轮状病毒分离株可以发生交叉感染，有研究指出猪可能是部分人群中流行毒株的储存宿主，因此猪群轮状病毒的防控具有重要的公共卫生意义。同时近年发现轮状病毒感染仔猪的致病性和感染率以及感染日龄有明显变化，需要加强对猪轮状病毒的流行病学
监测。本发明提供的一种鉴别rv感染以及鉴定病毒基因型的方法可以有效鉴别轮状病毒的同时可以鉴定rv病毒基因型。
[0035]
本发明提供的一种鉴别rv感染以及鉴定病毒基因型的方法，基于内部保守motif，搭配锚定引物，设计了一条特异性兼并通用性反转录引物，通过巢式pcr能够快速获得vp4基因序列，通过blast可以准确判断rv基因型，为rv流行病学监测及防控提供有效的技术支撑。
[0036]
本发明提供的方法操作简单、检测周期短、费用低且检测敏感性高，适于判断猪群和人群中是否发生轮状病毒感染以及哪种病毒基因型。
[0037]
应用本发明提供的方法对临床样品进行分析，证实了p[23]和p[7]是我国猪群中可能流行的主要基因型，该方法可以为我国猪轮状病毒疫苗更新和创制提供参考。
[0038]
与现有技术相比，本发明提供的一种鉴别rv感染以及鉴定病毒基因型的方法及其应用的优点：
[0039]
(1)操作简单、检测周期短、费用低且检测敏感性高。
[0040]
(2)有效确定轮状病毒感染以及病毒基因型。
[0041]
(3)方法效率高、重复性好且对于新的基因型可以覆盖。
[0042]
(4)能快速、准确鉴定轮状病毒vp4基因型。
附图说明
[0043]
图1是本发明提供的一种鉴别rv感染以及鉴定病毒基因型的方法中第一轮pcr扩增vp4结果。
[0044]
图2是本发明提供的一种鉴别rv感染以及鉴定病毒基因型的方法中第二轮pcr扩增vp4结果。
[0045]
图3是本发明提供的一种鉴别rv感染以及鉴定病毒基因型的方法中pcr反应特异性分析结果。
[0046]
图4是本发明提供的一种鉴别rv感染以及鉴定病毒基因型的方法中pcr反应敏感性分析结果。
[0047]
图1和图2中，m为dna marker；1为g9p[23]strain nmtl；2为g3p[2]strain sa11；3为g5p[23]strain 523-802；4为g1p[7]strain 17-802；5为g12p[7]strain 127-702。
具体实施方式
[0048]
为使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，以下实施例对本发明的作进一步详细描述，以下实施例仅用于说明发明，但不用来限制本发明的范围。
[0049]
一种鉴别rv感染以及鉴定病毒基因型的方法，包括：
[0050]
s101引物设计：
[0051]
基于轮状病毒vp4基因保守motif和锚定引物设计反转录引物conrev r；
[0052]
s102病毒核酸提取：
[0053]
取200μl肛拭子pbs上清液，4℃、2000r/min离心10min后取上清，用病毒基因组dna/rna提取试剂盒提取病毒rna；
[0054]
s103病毒核酸反转录：
[0055]
s301，取提取得到的rna 4.5μl、conrev r 0.5μl混匀后65℃保温5min后，立即冰浴5min；
[0056]
s302，10μl反应体系中，依次加入10mm的dntp 0.5μl、5
×
m-mlv buffer 2μl、m-mlv 0.5μl、rri 0.25μl、h2o 1.75μl，混匀后42℃保温1h；
[0057]
s104 pcr扩增：
[0058]
s401，第一轮pcr扩增，pcr反应体系50μl：2
×
premix 25μl、con f 1μl、anchor r 1μl、cdna1μl、ddh2o 22μl；pcr反应30～55个循环；72℃，10min；
[0059]
s402，第二轮pcr产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测后，将目的基因片段回收后进行第二轮pcr；
[0060]
s105测序分析：
[0061]
将目的基因片段回收后进行测序分析，确定毒株基因型。
[0062]
进一步的，所述的vp4基因保守motif为nt802-806：atgca。
[0063]
进一步的，所述的锚定引物设计反转录引物conrev r如下表；
[0064][0065]
进一步的，所述的肛拭子pbs为肛拭子置于500μl pbs所得。
[0066]
进一步的，所述的conrev r浓度为50μm；
[0067]
进一步的，所述的第一轮pcr扩增反应条件为：94℃，5min；94℃，30s、50℃，30s、72℃，45s；30～55个循环；72℃，10min；
[0068]
进一步的，所述的第二轮pcr扩增反应条件为：94℃，5min；94℃，30s、55℃，30s、72℃，45s；30～55个循环；72℃，10min。
[0069]
进一步的，所述的测序分析为blast基因型比对分析。
[0070]
本发明还提供一种鉴别rv感染以及鉴定病毒基因型方法的应用。
[0071]
一种鉴别rv感染以及鉴定病毒基因型方法的应用，所述的方法用于鉴定轮状病毒vp4基因型。
[0072]
本发明还提供另外一种鉴别rv感染以及鉴定病毒基因型方法的应用。
[0073]
一种鉴别rv感染以及鉴定病毒基因型方法的应用，所述的方法用于rv流行病学监测及防控。
[0074]
实施例1
[0075]
一种鉴别rv感染以及鉴定病毒基因型的方法
[0076]
1.引物设计：
[0077]
从ncbi中下载rv vp4基因序列，主要包括从人、猪和猴子中分离或检测到的轮状病毒vp4基因；通过megalign进行序列比对分析。基于保守motif(nt802-806：atgca)和锚定引物(ggccacgcgtcgactagtactat)设计反转录引物conrev r。
[0078]
锚定引物设计反转录引物conrev r如下表；
[0079][0080]
2.病毒核酸提取：
[0081]
取200μl肛拭子pbs上清液，4℃、2000r/min离心10min后取上清，用病毒基因组dna/rna提取试剂盒提取病毒rna；
[0082]
3.病毒核酸反转录：
[0083]
取提取所得rna 4.5μl、conrev r(50μm)0.5μl混匀后65℃保温5min后，立即冰浴5min；然后依次加入dntp(10mm)0.5μl、5
×
m-mlv buffer 2μl、m-mlv 0.5μl、rri 0.25μl、h2o 1.75μl(10μl反应体系)，混匀后42℃1h。
[0084]
4.pcr扩增：
[0085]
第一轮pcr扩增，pcr反应体系50μl：2
×
premix 25μl、con f 1μl、anchor r 1μl、cdna 1μl、ddh2o 22μl；pcr反应35个循环；72℃，10min；pcr扩增反应条件为：94℃，5min；94℃，30s、50℃，30s、72℃，45s；
[0086]
第二轮pcr产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测后，将目的基因片段回收后进行第二轮pcr；pcr反应体系50μl：2
×
premix 25μl、con f 1μl、anchor r 1μl、cdna 1μl、ddh2o 22μl；pcr反应35个循环；72℃，10min；pcr扩增反应条件为：94℃，5min；94℃，30s、55℃，30s、72℃，45s；35个循环。
[0087]
5.测序分析：
[0088]
将目的基因片段回收后进行blast基因型比对分析，确定毒株基因型。
[0089]
实施例2
[0090]
扩增vp4 nt11-806区域方法的建立
[0091]
提取病毒上清液rna后制备cdna作为模板。第一轮pcr退火温度设定为50℃，循环数设定为35个。pcr产物经琼脂糖凝胶电泳分离后观察到两个不同的条带。如图1所示，分别在750bp～1000bp和500bp～750bp处扩增出条带。
[0092]
按照目的片段大小(≈800bp)将750bp～1000bp处条带进行切胶回收后进行第二轮pcr。第二轮pcr退火温度设定为55℃，循环数设定为35个。pcr产物经琼脂糖凝胶电泳分离后在750bp～1000bp处扩增到目的条带，如图2所示。将条带进行切胶回收后进行测序。
[0093]
通过blast证实分别为p[23]、p[2]、p[23]、p[7]、p[7]基因型与毒株相符。
[0094]
实施例3
[0095]
特异性和敏感性检测
[0096]
以不同猪肠道病毒rna为模板，在相同条件下对该方法特异性进行验证。结果如图3所示，g9p[23]nmtl株在750bp-1000bp处可以扩增到目的条带，而其他病毒未出现扩增条带。
[0097]
将10倍倍比稀释的病毒上清制备模板，用该方法鉴定其敏感性。结果如图4所示，建立的方法其检测限为102tcid
50
，表明该方法敏感性较高。
[0098]
实施例4
[0099]
临床拭子样品检测
[0100]
提取我国不同地区猪场拭子样品rna后制备cdna作为模板；经pcr鉴定为vp7阳性后，利用建立的巢式pcr，确定了轮状病毒样品vp4基因型分别为p[23]、p[13]、p[6]、p[7]，详见下表。
[0101]
porv vp4基因型鉴定结果
[0102][0103]
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种变换，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
[0104]
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征和步骤，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
[0105]
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。