用于反复植入失败的生物标志物和诊断与治疗方法与流程

1.本发明涉及体外受精-胚胎植入技术领域。更具体地，本发明涉及用于反复植入失败的黄体支持治疗方法、以及预测反复植入失败患者的黄体支持治疗反应性的方法和生物标志物。


背景技术：

2.反复植入失败(rif,repeated implantation failure)是辅助生殖治疗领域的一种特殊疾病类型(bashiri a,halper ki,orvieto r.recurrent implantation failure-update overview on etiology,diagnosis,treatment and future directions.reproductive biology and endocrinology 2018；16:121)。一般，患者经过三次以上连续周期的优质胚胎移植而未获得临床妊娠，被认为是反复植入失败。rif在体外受精-胚胎移植(ivf-et)中的发生率为10-15％。rif的病因有1/3与胚胎质量相关，另外2/3与母体因素相关。针对rif，目前的临床策略包括：改善胚胎质量和子宫内膜容受性。改善子宫内膜容受性的方法包括激素药物治疗(雌激素、黄体酮和溴隐亭)、辅助药物治疗(维生素d、阿司匹林、低分子量肝素、抗微生物剂、和抗生素)、免疫疗法(泼尼松、主动免疫、被动免疫、和粒细胞克隆刺激因子g-csf)、辅助生殖疗法(子宫内膜窗口期检测)、手术(宫腔镜和腹腔镜)、中药、干细胞治疗、和生理治疗，等。尽管这些方法可以治疗一些rif患者；然而，仍有一些rif患者无法获得生育问题的解决。
3.在体外受精-胚胎移植中，黄体支持已经被提出应用于新鲜和冻融胚胎移植周期。一般认为，黄体中期血清黄体酮(p)水平达到一定值，是实现成功植入的关键。为此，提出了两种黄体支持策略，一种常规的黄体支持策略为外源补充黄体酮和雌激素药物；另一种黄体支持策略为通过外源lh活性药物(例如，lh或hcg)加强黄体的激素(黄体酮和雌激素)产生。在行新鲜胚胎移植周期的ivf-ef患者中，由于促排卵药物的使用等原因，常导致患者出现黄体功能不全；对于此类患者，已经证实，补充黄体酮进行黄体支持可以带来明确的临床治疗改善效果。但是，关于黄体支持的有效性，取决于所用的具体黄体支持药物和方案和具体应用的患者情况，在本领域仍多有争议。对于hcg作出黄体支持药物的应用，例如，ludwig m等报道，在新鲜胚胎移植周期中，在常规黄体酮黄体支持外补充hcg并未带来优于单独使用黄体酮的有效性(ludwig m,finasa,katalinica,strikd,kowalceki,schwartzp,et al.prospective,randomized study to evaluate the success rates using hcg,vaginal progesterone or a combination of both for luteal phase support.acta obstetricia et gynecologica scandinavica 2001；80:574-82.)。类似地，linden等也报道了，meta分析显示，对于新鲜胚胎移植周期，黄体酮联合hcg进行黄体支持，与单独使用黄体酮比较，在活产率和持续妊娠率上并无统计学差异(luteal phase support for assisted reproduction cycles(review)，cochrane database of systematic reviews 2015,issue 7.art.no.:cd009154.)。目前，对于rif患者，对于不同黄体支持方案及其在不同rif患者群体中的适宜性，研究仍然是有限的；而且，随着精准的个性化黄体支持治疗概
念的提出，针对特定的黄体治疗方案，确定指示治疗方案反应性的生物标志物以及基于生物标志物选择针对性的治疗方案，是有必要的。
4.近年来，基于微阵列芯片以及差异表达基因的功能富集研究，已经被提出来应用于复杂疾病的病因学和治疗反应性的研究。在rif疾病领域，也已经提出使用功能富集研究，对rif患者的子宫内膜容受性状况进行分期、以及进行植入窗口相关基因谱图的分析。例如，ercan bastu等人(potential marker pathways in the endometrium that may cause recurrent implantation failure,reproductive sciences,2018,p1-12)，将rif患者与能育个体进行比较，通过转录组学和差异基因功能富集，鉴定并提出了9个与自然周期rif患者的子宫内膜容受性可能相关的kegg生物学通路，包括circadian rhythm,pathways in cancer,proteasome,complement and coagulation cascades,citrate cycle,adherens junction,immune system and inflammation,cell cycle,和renin-angiotensin system。类似地，koot等(an endometrial gene expression signature accurately predicts recurrent implantation failure after ivf,sci.rep.2016；6:19411)也提出了差异表达基因微阵列和功能富集分析在rif预测中的应用。然而，这些基于差异表达基因的分析通常都要求在周期的特定时间点从患者获取子宫内膜活检物；并且分析结果也常随活检时间的变化而变化，因此此类方法存在一定的应用局限性。
5.鉴于前述，目前对于未明原因的rif的诊断和治疗方法存在局限性。本领域中需要区分rif患者以及改进rif治疗和诊断的新方法。
6.发明概述
7.通过临床研究，探索黄体生成素(lh)水平与rif患者的相关性，本发明人提出了一种适宜于具有特定的低lh血清水平的rif疾病患者的新黄体支持方法。进一步，本发明人进行了全基因组外显子测序和变异基因的功能富集分析；并在此基础上确立了该黄体支持治疗反应性与特定生物学通路上的基因变异的相关性。
8.结合以上在分子水平、基因水平和临床水平上的深入研究，本发明人也提出了一个新的rif疾病亚型——“亚临床垂体功能减退”性反复植入失败，该亚型的rif患者具有诊断性的特定生物通路基因变异和/或任选地，诊断性的黄体期d2低lh水平，并对移植后补充hcg的黄体支持方案表现出良好的临床反应性。
9.因此，在一个方面，本发明提供一种诊断或分类rif患者的方法，其包括检测患者的特征性生物通路相关基因的变异，和/或黄体期d2日的lh血清水平。再一方面，本发明提供了一种黄体支持方法，包括对具有特征性生物通路相关基因的变异、和/或低于一定阈值的黄体期d2日lh血清水平的rif患者，在给与黄体酮和/或雌激素进行黄体支持的基础上，进一步补充黄体生成相关活性药物，尤其是hcg，优选地，该方法改善患者的临床妊娠率和/或活产率。再一方面，本发明提供了一种预测rif患者对补充hcg的黄体支持治疗的反应性的方法，包括检测患者的特征性生物通路相关基因的变异，和/或黄体期d2日的lh血清水平。
10.再一个方面，本发明也提供了可用于诊断或分类rif患者的生物标志物及其组合，以及可用于预测rif患者对补充hcg的黄体支持方法的治疗反应性的生物标志物及其组合。再另一方面，本发明也提供了所述的生物标志物及其组合在制备用于本发明的诊断或预测方法的试剂盒中的用途。
11.附图简述
12.图1显示，在因输卵管问题行ivf-et的一些患者中测定到的促黄体生成素lh的周期变化。
13.图2显示，在一些反复植入失败患者中测定到的促黄体生成素lh的周期变化。
14.图3显示，对实施例3所有样本的测序数据的质量控制。
15.图4显示，病例组通路分析富集结果。病例组中富集到的通路ecm-receptor interaction与extracellular matrix organization是一个通路在kegg和go-bp两个不同数据库中的描述。
16.图5显示，对照组通路分析富集结果。
17.图6显示，与病例组中的主要kegg/go富集通路(ecm-receptor interaction/extracellular matrix organization；pi3k-akt signaling pathway,和focal adhesion)相关的27种基因。
18.图7显示，基于通路富集分析确定的治疗反应性相关基因在病例组和对照组样本的富集统计。
19.图8显示，10个病例组样本的主要通路相关基因富集统计。
20.图9显示，本发明的特征性生物通路及通路相关基因。
21.图10显示，在hcg黄体支持治疗反应性患者中鉴定的特征性通路snp列表。
22.发明详述
23.在详细描述本发明之前，应了解，本发明不受限于本说明书中的特定方法及实验条件，因为所述方法以及条件是可以改变的。另外，本文所用术语仅是供说明特定实施方案之用，而不意欲为限制性的。
24.定义
25.除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语均具有与本领域一般技术人员通常所理解的含义相同的含义。为了本发明的目的，下文定义了以下术语。
26.术语“约”在与数字数值联合使用时意为涵盖具有比指定数字数值小5％的下限和比指定数字数值大5％的上限的范围内的数字数值。
27.术语“和/或”当用于连接两个或多个可选项时，应理解为意指可选项中的任一项或可选项中的任意两项或多项。
28.如本文中所用，术语“包含”或“包括”意指包括所述的要素、整数或步骤，但是不排除任意其他要素、整数或步骤。在本文中，当使用术语“包含”或“包括”时，除非另有指明，否则也涵盖由所述及的要素、整数或步骤组成的情形。
29.在本文中,d0是指子宫内膜转化日，在自然周期和促排卵周期的情况下为排卵日；在人工周期的情况下为给与子宫内膜转化用药的当日。相应地，d2是指d0天后的第2日。在本发明中可以采取任何已知的方法进行排卵监测，例如，可以自月经第8～10天开始每天行经阴道超声检测卵泡发育，直至发现优势卵泡消失，即视为排卵。
30.在本文中,临床妊娠定义为：移植后30-35天行腹部b超检查，观察到孕囊。
31.在本文中,活产定义为：妊娠满20周后娩出一个或多个活产儿。
32.在本文中，通路相关基因定义为：根据kegg和go注释到以下至少一个生物学通路和/或生物学过程上的基因：
33.kegg_pathway：细胞外基质-受体相互作用通路(hsa04512)；
[0034]-go_bp_direct:细胞外基质组织(go:0030198)；
[0035]-kegg_pathway:pi3k-akt信号传导通路(hsa04511)；
[0036]-kegg_pathway:focal adhesion(hsa04510)。
[0037]
在根据本发明方法、组合物、试剂盒和/或用途的一些实施方案中，通路相关基因选自：kegg注释在hsa04510、hsa04511、hsa04512，和/或go_bp_direct注释在go:0030198下的基因。
[0038]
在一些实施方案中，通路相关基因选自注释在kegg通路hsa04512下的基因，例如，col1a,col2a,col4a,col6a,col9a,lama1_2,lama3_5,lama4,lamb1,lamb2,lamb3,lamb4,lamc1,lamc2,lamc3,chad,reln,thbs1,thbs2s,fn1,spp1,vtn,tn(tnc，tenascin c),vwf,ibsp,agrn,hspg2,itga1,itga2,itga2b,itga3,itga4,itga5,itga6,itga7,itga8,itga9,itga10,itga11,itgav,itgb1,itgb3,itgb4,itgb5,itgb6,itgb7,itgb8,cd44,sdc1,sdc4,sv2,cd36,gp5,gp1ba,gp1bb,gp9,gp6,dag1,cd47,hmmr,col24a。
[0039]
在一些实施方案中，通路相关基因选自go_bp_direct注释在go:0030198下的基因，例如，pecam1,itgb2,app,fbn1,cd44,ncan,spock2,col16a1,lamb2,b4galt1,dag1,slc39a8,jam2,itga8,ibsp,col28a1,acan,adamts18,itgb6,lamb3,itga9,itga5,pdgfb,itgae,itgb5,mpzl3,nf1,ptk2,lamc1,tgfbi,sox9,ccn1,itgam,egflam,npnt,vit,tnf,itgb3,bsg,foxf1,lama1,vwf,mmp12,ndnf,fbln1,itga4,vcan,tnr,col14a1,itgav,icam3,comp,icam5,lama3,lama5,fn1,adamts13,ccdc80,col7a1,col3a1,col1a1,fbln2,lama2,thbs1,lamb1,vcam1,icam1,itgad,col4a3,dmp1,ddr1,fgg,fgb,fga,itga1,cdh1,mmp14,vtn,itgb4,itga6,postn,madcam1,adam15,jam3,itga7,myf5,itgb8,itgb7,itga3,wnt3a,tnc,pdgfra,adamts12,hapln1,ecm2,nid1,egfl6,lamc2,itga2b,adamts9,itga10,col8a2,fbln5,serpine1,nid2,f11r,col13a1,cd47,col8a1,hsd17b12,smoc2,icam2,col4a6,itga11,col6a3,col6a2,col6a1,itgax,itgal,mmp24,spp1,col19a1,icam4,itgb1,adam12,col18a1,col15a1,col24a,adam19,lama4,kdr,itga2,col17a1,col5a1,bcan,col5a3,lamc3,dnajb6,spink5,ddr2，col9a3，ercc2。
[0040]
在一些实施方案中，通路相关基因选自注释在kegg通路hsa04510下的基因，例如，col1a,col2a,col4a,col6a,col9a,lama1_2,lama3_5,lama4,lamb1,lamb2,lamb3,lamb4,lamc1,lamc2,lamc3,chad,reln,thbs1,thbs2s,fn1,spp1,vtn,tn,vwf,ibsp,itga1,itga2,itga2b,itga3,itga4,itga5,itga6,itga7,itga8,itga9,itga10,itga11,itgav,itgb1,itgb3,itgb4,itgb5,itgb6,itgb7,itgb8,pdgfa,pdgfb,pdgfc_d,egf,igf1,vegfa,vegfb,pgf,vegfc_d,hgf,pdgfra,pdgfrb,igf1r,kdr,egfr,flt1,flt4,met,erbb2,src,arhgap35,arhgap5,rhoa,diaph1,rock1,rock2,myl2,myl5,myl7,myl9,myl10,myl12,mylpf,ppp1c,ppp1r12a,ppp1r12b,ppp1r12c,mylk,actb_g1,rasgrf1,capn2,actn1_4,tln,flna,pxn,ilk,zyx,vasp,vcl,parv,pdpk1,akt,gsk3b,ctnnb1,prkca，prkcb,prkcg,ptk2,pik3ca_b_d,pik3r1_2_3,pten,vav,rac1,rac2,rac3,pak1,pak2,pak3,pak4,pak5,pak6,cdc42,bcar1,crk,dock1,rapgef1,rap1a,rap1b,jnk,jun,braf,cav1,cav2,cav3,fyn,shc1,shc2,shc3,shc4,grb2,sos,hras,raf1,map2k1,erk,elk1,ccnd1,ccnd2,ccnd3,birc2_3,xiap,bad,bcl2.
[0041]
在一些实施方案中，通路相关基因选自注释在kegg通路hsa04511下的基因，例如，egf,tgfa,ereg,areg,fgf1,fgf2,fgf,fgf19,fgf21,fgf23,ngfa,ngfb,bdnf,ntf3,ntf4,ins,igf1,igf2,pdgfa,pdgfb,pdgfc_d,csf1,kitlg,flt3lg,vegfa,vegfb,pgf,vegfc_d,hgf,angpt1,angpt2,angpt4,efna,egfr,erbb2,erbb3,erbb4,fgfr1,fgfr2,fgfr3,fgfr4,ngfr,ntrk1,ntrk2,insr,igf1r,pdgfra,pdgfrb,csf1r,kit,flt3,flt1,flt4,kdr,met,tek,epha2,grb2,sos,hras,kras,nras,raf1,map2k1,map2k2,erk,irs1,tlr2,tlr4,rac1,igh,syk,cd19,pik3ap1,gh,prl,osm,il2,il3,il6,il4,il7,ifna,ifnb,epo,csf3,ghr,prlr,osmr,il2ra,il2rb,il2rg,il3ra,il6r,il4r,il7r,ifnar1,ifnar2,epor,csf3r,jak1,jak2,jak3,col1a,col2a,col4a,col6a,col9a,lama1_2,lama3_5,lama4,lamb1,lamb2,lamb3,lamb4,lamc1,lamc2,lamc3,chad,reln,thbs1,thbs2s,fn1,spp1,vtn,tn,vwf,ibsp,itga1,itga2,itga2b,itga3,itga4,itga5,itga6,itga7,itga8,itga9,itga10,itga11,itgav,itgb1,itgb3,itgb4,itgb5,itgb6,itgb7,itgb8,ptk2,pik3ca_b_d,pik3r1_2_3,f2r,chrm1,chrm2,lpar1,lpar2,lpar3,lpar4,lpar5,lpar6,gnb1,gnb2,gnb3,gnb4,gnb5,gng2,gng3,gng4,gng5,gng7,gng8,gng10,gng11,gng12,gng13,gngt1,gngt2,pik3cg,pik3r5_6,pdpk1,stk11,prkaa,ddit4,tsc1,tsc2,rheb,mlst8,mtor,raptor,eif4ebp1,eif4e,rps6kb,eif4b,rp-s6e,prkca,pkn1,sgk1,sgk2,sgk3,akt,aip3,aip1,pten,them4,ppp2c,ppp2r1,ppp2r2,ppp2r3,ppp2r5,hsp90a,hsp90b,cdc37,crtc2,phlpp,tcl1a,tcl1b,mtcp1,nos3,brca1,gsk3b,gys,e4.1.1.32,g6pc,myc,ccnd1,cdkn1a,cdkn1b,cdk2,cdk4,cdk6,ccnd2,ccnd3,ccne,foxo3,rbl2,tnfsf6,bcl2l11,ywhab_q_z,ywhae,ywhag_h,bad,bcl2l1,bcl2,casp9,creb1,atf2,atf4,creb3(creb3l4),creb5,atf6b,mcl1,rxra,nr4a1,ikbkg,ikbka,ikbkb,rela,nfkb1,myb,mdm2,tp53。
[0042]
在根据本发明方法、组合物、试剂盒和/或用途的一些实施方案中，通路相关基因选自图9中列出的kegg通路hsa04510、hsa04511、hsa04512，和/或go_bp_direct生物学过程go:0030198的基因之一或其组合。
[0043]
在本文中,术语“标志物”或“生物标志物”是指生物分子、或生物分子的部分/片段，所述分子的改变和/或存在与特定的生物状况或状态具有相关性。在一些实施方案中，本发明的标志物是基因标志物，涵盖了所鉴定的基因及其编码蛋白的所有生物学相关形式，包括例如，基因变异(例如错义突变)、基因表达水平、以及相应编码蛋白的突变形式和/或蛋白表达水平和/或活性。在一些实施方案中，基因标志物是基因外显子中的序列变异，和/或相应的由所述变异引起的蛋白质氨基酸改变。在一些实施方案中，对生物标志物分子的检测可以是对其片段或部分的检测。所述部分可以是例如基因的片段或蛋白的片段，例如，包含5-30个核苷酸的基因片段，或包含5-30个氨基酸的蛋白质片段。
[0044]
术语“标志物组”或“生物标志物组”，在本文中，是指包含一个或多个生物标志物(例如基因标志物)的组合，例如组合物，阵列或集合。在一些实施方案中，用于标志物组中的生物标志物的数目取决于针对特定的生物标志物量值组合的检测灵敏度和特异性。灵敏度和特异性表明，基于在生物学样本中检测到的生物标志物的量值来正确分类受试者的能力。在一些实施方案中，在本发明的方法例如诊断和预测方法中，针对所用的生物标志物组，诊断或预测方法的灵敏度到达70％、80％以上，例如，90％以上。在一些实施方案中，在一些实施方案中，在本发明的方法例如诊断和预测方法中，针对所用的生物标志物组，诊断
或预测方法的特异性到达70％、80％以上，例如，90％以上。
[0045]
术语“基因变异”是指，相对于所述基因的规范序列而言，编码所述基因的序列发生改变，包括但不限于缺失、插入、和/或替换。术语“规范序列”在本文中指，在人类中最常出现的序列，例如人类参考基因组(grch37/hg19)的序列。优选地，基因变异导致的等位基因频率在人群体中不大于0.03，例如不大于0.02，不大于0.01，例如根据gnomad数据库，该等位基因频率不大于0.01。
[0046]
术语“错义突变”指可导致多肽产物的氨基酸序列改变或功能性rna碱基序列改变的基因序列变异。在一些优选实施方案中，本发明的基因变异包含错义突变，优选地所述错义突变不导致基因编码蛋白的完全失活，但影响基因编码蛋白的生物活性。在一个实施方案中，所述错义突变为有害错义突变。在本文中，有害错义突变是指，影响基因编码产物(例如多肽产物)的结构和/或功能改变的突变；但是所述突变不导致蛋白质的完全失活。在一个实施方案中，有害错义突变为通过sift和/或polyphen-2软件预测的有害错义突变。
[0047]
术语“阵列”或“微阵列”指可杂交阵列元件，优选多核苷酸探针(例如寡核苷酸)，在基质上的有序排列。基质可以是固体基质例如玻璃载玻片或半固体基质例如硝酸纤维素膜。
[0048]
术语“诊断”在本文中用于指分子或病理学状态、疾病或状况的鉴定或分类。例如，“诊断”可以指rif的特定亚型的分类，例如通过组织病理学标准(例如d2血清lh水平)和/或通过分子特征(例如特定基因变异或特异基因变异的组合、由所述基因编码的蛋白质的表达、或变异基因富集模式)进行分类。
[0049]
术语“辅助诊断”在本文中用于指辅助作出有关rif特定类型的症状或状况的存在或性质或治疗反应性的临床决定的方法。在一些实施方案中，本发明也提供例如，帮助rif亚型诊断的方法或帮助诊断rif患者治疗反应性的方法，所述方法可以包括测量来自个体的生物样本中特定基因或基因组合的基因变异、或特定基因变异富集模式。
[0050]
与生物标志物有关的术语“检测”，在本文中，涵盖任何方式的检测，包括直接和间接检测。
[0051]
术语“预测治疗反应性”在本文中用于指患者将有利地或不利地响应药物或药物组的可能性。在一个实施方案中，预测涉及所述应答的程度。在一个实施方案中，预测涉及：患者是否和/或可能将在治疗例如用特定治疗剂进行治疗后获得临床结局改善，例如临床妊娠率、活产率等。
[0052]
如本文使用的，”参照样本”、“对照样本”，是指该样本得自的来源已知或被认为未患有待用本发明的方法或组合物鉴定的疾病或状况。例如，“参照”可以是从未经补充hcg的黄体支持治疗和/或未经黄体期lh水平检测的反复植入失败患者中盲选的多数个体组成的群体。或者，“参照”可以是未曾被诊断为rif的受试者，或可以是由于胚胎质量引起的rif的受试者，或可以是具有器质性病变如输卵管问题的ivf-et受试者。
[0053]
如本文使用的，术语“样本”指得自或源自目的受试者的组合物，其包含或疑似包含待表征和/或鉴定，例如基于物理、生物化学、化学和/或生理学特征表征和/或鉴定的，细胞实体和/或其他分子实体(在本发明的情况下，尤其是待检测的核酸如全外显子核酸序列，或待检测的生物标志物核酸或其片段)。
[0054]
术语“黄体生成活性相关药物”，在本文中是指，具有促黄体生物素样作用的药物，
例如lh，hcg，包括重组生产的或分离纯化的形式，例如基因重组lh，尿源性hcg和基因重组hcg。
[0055]
术语“黄体酮药物”，在本文中指，可用于生育相关治疗的黄体酮类药物，包括天然或人工合成的黄体酮类药物。常规的黄体酮药物包括，例如，但不限于，肌肉注射黄体酮，如17α-羟己酸孕酮酯；阴道用黄体酮，例如黄体酮缓释凝胶和微粒化黄体酮胶囊；口服黄体酮，例如地屈孕酮。
[0056]
术语“雌激素药物”，在本文中指，可用于生育相关治疗的雌激素类药物，包括但不限于，戊酸雌二醇和微粒化雌二醇，可经口服、阴道以及经皮等方式给药。
[0057]
以下对本发明的各个方面作进一步详细的描述。
[0058]
本发明至少部分地基于反复流产失败(rif)的独特新疾病亚型(本文中也称作亚临床垂体功能减退rif亚型)的定义。此疾病亚型的特征在于：特征性生物通路相关基因的变异，和/或黄体期d2日的lh血清水平。本发明也提供了与该亚型的诊断和分类相关的生物学标志物，和适宜该亚型的胚胎移植临床结局改善的新黄体支持方法、以及用于预测患者对该黄体支持治疗的反应性的方法和生物标志物。
[0059]
i.本发明的疾病亚型及其特征性的生物通路相关基因变异
[0060]
结合基因水平和临床水平的研究，本发明人提出了一种新的反复植入失败疾病亚型——亚临床垂体功能减退性反复植入失败。该疾病亚型具有特征性的生物通路相关基因变异并对补充hcg的黄体支持治疗表现出有利的临床妊娠反应性，且优选地，还具有如下之一或多项，优选全部的特征：
[0061]
(1)无明确的反复植入失败原因；
[0062]
(2)无明显的器质性垂体损伤；
[0063]
(3)垂体功能减退症状轻微；
[0064]
(4)黄体期d2日的血清lh水平≤5iu/l。
[0065]
因此，在一个方面，本发明提供了，可以通过在来自受试者的生物样本中筛查作为生物标志物的特征性生物通路相关基因的变异，来表征(包括，但不限于，诊断和/或分类)亚临床垂体功能减退性反复植入失败、和/或预测患者对补充hcg的黄体支持治疗的反应性的方法和组合物。
[0066]
变异基因筛查
[0067]
本发明的变异基因筛查包括对受试者基因组和/或外显子组上的核苷酸变异的检测。所述基因变异包括但不限于，多态性、剪接变体、突变等。本领域已知多种变异基因筛查技术，包括，但不限于，全基因组测序，靶区域测序、全外显子组测序，snp阵列杂交等。此外，本领域已知，也可以通过检测基因编码产物(例如蛋白质)的生物学活性/功能改变(例如降低)来筛查变异基因。所有这些技术均可以适用于本发明。并且，如本领域技术人员可以理解，本发明并不受限于具体的变异筛查技术。
[0068]
在本发明的一些实施方案中，优选地，通过全外显子组测序(wes)，对受试者基因组中的蛋白质编码序列进行分析。使用该技术，可以探查主要位于外显子区域中的疾病相关性遗传异常。wes将产生高通量结果。本领域中存在多种技术手段，可以应用于测序数据的分析，以允许检测核苷酸变异和核苷酸多态性。通过这些方法获得的数据可以组合并进一步应用于诸如疾病亚型的诊断和分类。
[0069]
现有的两种主要的第二代测序(ngs)方法均可以用于本发明中实行wes，即，基于dna扩增的测序(例如，可获自illumina,ion torrent)和单分子实时测序(可获自pacific biosciences,oxford nanopore)。用于测序的组织样本可以是新鲜冻存的、甲醛固定且石蜡包埋的、或基于液体的样本(如血液样本)。用于从这些样本之每一种中分离核酸的试剂盒是可商购获得的。可以通过基于阵列或基于磁珠的方式，捕获外显子组。为了达到足够的测序覆盖深度，也可以适当地捕获靶区域。在获得wes测序数据后，通常进行数据处理，控制数据质量，修剪去除低质量的读段。此后，可以将读段映射到所选的参照基因组上，识别基因变异并进行注释。在一个实施方案中，通过wes技术，识别基因变异，包括但不限于，frameshift(移码突变)、stop-gain(终止密码子获得性突变)、和stop-loss(终止密码子丢失性突变)和错义突变。在一个优选的实施方案中，在本发明的组合物和方法中，识别导致氨基酸改变的错义突变。可以用于wes数据中识别单核苷酸变异的工具包括，但不限于，varscan2,mutect,strelka,platypus,freebayes,somaticsniper。这些方法之任何及其组合均适用于本发明的基因变异检测。
[0070]
有害错义突变的识别
[0071]
本发明人发现，在本发明的rif疾病亚型中，与其亚临床表现相一致，在病例和对照的变异基因功能富集分析中检测到的基因变异主要为不导致基因失活但影响蛋白生物学活性的错义突变，即有害错义突变。
[0072]
因此，在本发明一些优选的实施方案中，在本发明的组合物和方法中，检测作为生物标志物的通路相关基因中的有害错义突变。可以通过多种本领域已知的软件，识别有害错义突变，例如sift和polyphen-2软件。
[0073]
变异基因的功能注释
[0074]
在本文中，在筛查出受试者的变异基因后，在一些实施方案中，可以使用kegg和go数据库，对检出的受试者变异基因进行功能注释，包括kegg生物通路和go生物学过程注释，任选地还可以对检出的变异基因进行功能富集分析，并与参照样本进行比较。
[0075]
kegg(kyoto encyclopedia of genes and genomes)注释
[0076]
kegg是一个用于基因功能系统分析的数据库，该数据库将基因组信息与更有序的生物功能信息联系起来。kegg数据库包括三个数据库，gene数据库，pathway数据库和ligand数据库。genes数据库存储基因组信息，是一个基因目录的集合，涵盖了已经完整测序的基因组以及一些部分测序的基因组，具有实时更新的基因功能注释。pathway数据库存储更有序的生物功能信息，其中包括细胞生物学过程的图形表现形式，例如新陈代谢、膜运输、信号传导、细胞周期等。kegg也提供直系同源物组群列表作为pathway数据库的补充，提供有关保守的子路径(途径基序)的信息，这些子路径常常由染色体上位置偶联的多个基因编码，对于基因功能的预测十分有用。kegg的第三个数据库是ligand，其提供有关化合物、酶分子和酶促反应的信息。kegg提供java图形工具用于基因组图谱浏览、两基因组图谱比较、和表达谱图的操作，并提供计算工具用于序列比较、图形比较和路径计算。kegg数据库可以在http://www.genome.jp/kegg/为公众所获得的。
[0077]
在根据本发明方法和组合物的一些实施方案中，具有本发明rif疾病亚型和/或表现出对补充hcg黄体支持的治疗反应性的rif患者，表现出在细胞外基质(ecm)-受体相互作用kegg通路上具有一个或多个基因变异。ecm-受体相互作用kegg通路记载在条目(entry)
hsa04512下。
[0078]
在一些实施方案中，因此，在本发明的组合物和方法例如诊断和预测方法中，检测的基因标志物包含根据kegg注释在ecm-受体相互作用kegg通路上的1个或多个基因，例如1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,15,20,25,30,35,40,45,50,55,60,或65个或更多个基因。在一些实施方案中，所述基因可以选自：kegg数据库条目hsa0451的补充直系同源物组群列表中列出的基因，例如基因col1a,col2a,col4a,col6a,col9a,lama1_2,lama3_5,lama4,lamb1,lamb2,lamb3,lamb4,lamc1,lamc2,lamc3,chad,reln,thbs1,thbs25,fn1,spp1,vtn,tn,vwf,ibsp,agrn,hspg2,itga1,itga2,itga2b,itga3,itga4,itga5,itga6,itga7,itga7,itga8,itga9,itga10,itga11,itgav,itgb1,itgb3,itgb4,itgb5,itgb6,itgb7,itgb8,cd44,sdc1,sdc4,sv2,cd36,gp5,gp1ba,gp1bb,gp9,gp6,dag1,cd47,hmmr,col24a。在优选的实施方案中，本发明的生物标志物包含ec-受体相互作用通路基因，其选自：lama5，lama2,itgb4,itga11,spp1,tnc,itga9,col24a,和col6a6。
[0079]
在根据本发明方法和组合物的一些实施方案中，具有本发明rif疾病亚型和/或表现出对补充hcg黄体支持的治疗反应性的rif患者，表现出在kegg通路pi3k-akt信号传导通路上具有一个或多个基因变异。pi3k-akt信号传导通路记载在条目(entry)hsa04511下。
[0080]
在一些实施方案中，因此，在本发明的组合物和方法例如诊断和预测方法中，检测的基因标志物包含根据kegg注释在pi3k-akt信号传导通路下的1个或多个基因，例如1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,15,20,25,30,35,40,45,50,55,60,或65个或更多个基因。在一些实施方案中，所述基因可以选自：kegg数据库条目hsa04511的补充直系同源物组群列表中列出的基因，例如基因egf,tgfa,ereg,areg,fgf1,fgf2,fgf,fgf19,fgf21,fgf23,ngfa,ngfb,bdnf,ntf3,ntf4,ins,igf1,igf2,pdgfa,pdgfb,pdgfc_d,csf1,kitlg,flt3lg,vegfa,vegfb,pgf,vegfc_d,hgf,angpt1,angpt2,angpt4,efna,egfr,erbb2,erbb3,erbb4,fgfr1,fgfr2,fgfr3,fgfr4,ngfr,ntrk1,ntrk2,insr,igf1r,pdgfra,pdgfrb,csf1r,kit,flt3,flt1,flt4,kdr,met,tek,epha2,grb2,sos,hras,kras,nras,raf1,map2k1,map2k2,erk,irs1,tlr2,tlr4,rac1,igh,syk,cd19,pik3ap1,gh,prl,osm,il2,il3,il6,il4,il7,ifna,ifnb,epo,csf3,ghr,prlr,osmr,il2ra,il2rb,il2rg,il3ra,il6r,il4r,il7r,ifnar1,ifnar2,epor,csf3r,jak1,jak2,jak3,col1a,col2a,col4a,col6a,col9a,lama1_2,lama3_5,lama4,lamb1,lamb2,lamb3,lamb4,lamc1,lamc2,lamc3,chad,reln,thbs1,thbs2s,fn1,spp1,vtn,tn,vwf,ibsp,itga1,itga2,itga2b,itga3,itga4,itga5,itga6,itga7,itga8,itga9,itga10,itga11,itgav,itgb1,itgb3,itgb4,itgb5,itgb6,itgb7,itgb8,ptk2,pik3ca_b_d,pik3r1_2_3,f2r,chrm1,chrm2,lpar1,lpar2,lpar3,lpar4,lpar5,lpar6,gnb1,gnb2,gnb3,gnb4,gnb5,gng2,gng3,gng4,gng5,gng7,gng8,gng10,gng11,gng12,gng13,gngt1,gngt2,pik3cg,pik3r5_6,pdpk1,stk11,prkaa,ddit4,tsc1,tsc2,rheb,mlst8,mtor,raptor,eif4ebp1,eif4e,rps6kb,eif4b,rp-s6e,prkca,pkn1,sgk1,sgk2,sgk3,akt,aip3,aip1,pten,them4,ppp2c,ppp2r1,ppp2r2,ppp2r3,ppp2r5,hsp90a,hsp90b,cdc37,crtc2,phlpp,tcl1a,tcl1b,mtcp1,nos3,brca1,gsk3b,gys,e4.1.1.32,g6pc,myc,ccnd1,cdkn1a,cdkn1b,cdk2,cdk4,cdk6,ccnd2,ccnd3,ccne,foxo3,rbl2,tnfsf6,bcl2l11,ywhab_q_z,ywhae,ywhag_h,bad,bcl2l1,bcl2,casp9,creb1,atf2,atf4,creb3(creb3l4),creb5,atf6b,mcl1,rxra,nr4a1,ikbkg,ikbka,ikbkb,rela,nfkb1,myb,
mdm2,tp53。在优选的实施方案中，本发明的生物标志物包含pi3k-akt信号传导通路基因，其选自：lama5，lama2,itgb4,itga11,spp1,tnc,itga9，col24a,col6a6，phlpp2,ifna4,crtc2,csf3r,csf1,gys1,creb3l4,和lpar6。
[0081]
在根据本发明方法和组合物的一些实施方案中，具有本发明rif疾病亚型和/或表现出对补充hcg黄体支持的治疗反应性的rif患者，表现出在kegg通路focal adhension上具有一个或多个基因变异。focal adhension通路记载在条目(entry)hsa04510下。
[0082]
在一些实施方案中，因此，在本发明的组合物和方法例如诊断和预测方法中，检测的基因标志物包含根据kegg注释在focal adhension通路上的1个或多个基因，例如1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,15,20,25,30,35,40,45,50,55,60,或65个或更多个基因。在一些实施方案中，所述基因可以选自：kegg数据库条目hsa0450的补充直系同源物组群列表中列出的基因，例如基因col1a,col2a,col4a,col6a,col9a,lama1_2,lama3_5,lama4,lamb1,lamb2,lamb3,lamb4,lamc1,lamc2,lamc3,chad,reln,thbs1,thbs2s,fn1,spp1,vtn,tn,vwf,ibsp,itga1,itga2,itga2b,itga3,itga4,itga5,itga6,itga7,itga8,itga9,itga10,itga11,itgav,itgb1,itgb3,itgb4,itgb5,itgb6,itgb7,itgb8,pdgfa,pdgfb,pdgfc_d,egf,igf1,vegfa,vegfb,pgf,vegfc_d,hgf,pdgfra,pdgfrb,igf1r,kdr,egfr,flt1,flt4,met,erbb2,src,arhgap35,arhgap5,rhoa,diaph1,rock1,rock2,myl2,myl5,myl7,myl9,myl10,myl12,mylpf,ppp1c,ppp1r12a,ppp1r12b,ppp1r12c,mylk,actb_g1,rasgrf1,capn2,actn1_4,tln,flna,pxn,ilk,zyx,vasp,vcl,parv,pdpk1,akt,gsk3b,ctnnb1,prkca，prkcb,prkcg,ptk2,pik3ca_b_d,pik3r1_2_3,pten,vav,rac1,rac2,rac3,pak1,pak2,pak3,pak4,pak5,pak6,cdc42,bcar1,crk,dock1,rapgef1,rap1a,rap1b,jnk,jun,braf,cav1,cav2,cav3,fyn,shc1,shc2,shc3,shc4,grb2,sos,hras,raf1,map2k1,erk,elk1,ccnd1,ccnd2,ccnd3,birc2_3,xiap,bad,bcl2。在优选的实施方案中，本发明的生物标志物包含focal adhesion通路基因，其选自：lama5，lama2,itgb4,itga11,spp1,tnc,itga9，col24a,col6a6，shc4和myl12a。
[0083]
gene ontology
[0084]
gene ontology简称go。go注释可分为三大类：go_mf分子功能(molecular function)，go_bp生物过程(biological process)和go_cc细胞组分(cellular component)。通过此三个大类，go对一个基因进行描述。例如，在一个go注释中，基因产物“细胞色素c”可以通过分子功能(氧化还原酶活性)、生物学过程(氧化磷酸化)和分子组分(线粒体基质)来描述。
[0085]
在本文中，go功能富集分析可以是在分子功能(molecular function)，生物过程(biological process)和细胞组分(cellular component)三个层次之任一和/或其组合上，统计基因或者蛋白(例如，变异基因或其编码蛋白)的数目或组成。此外，也可以进一步挑选具体的go term，统计直接对应到该term的基因或蛋白数。
[0086]
在根据本发明方法和组合物的一些实施方案中，具有本发明rif疾病亚型和/或表现出对补充hcg黄体支持的治疗反应性的rif患者，表现出在go_bp_direct细胞外基质组织(extracellular matrix organization)生物学过程中具有一个或多个基因变异。在go数据库中，细胞外基质组织生物学过程记载在条目(entry)go:0030198下。
[0087]
因此，在一些实施方案中，在本发明的组合物和方法例如诊断和预测方法中，检测
的基因标志物包含根据go_bp_direct注释在细胞外基质组织生物学过程go:0030198上的1个或多个基因，例如1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,15,20,25,30,35,40,45,50,55,60,或65个或更多个基因。在一些实施方案中，所述基因也注释在go:0005576(胞外区，extracellular region)，go:0062023(含胶原蛋白的细胞外基因，collagen-containing extracellular matrix)，go:0007155(细胞粘着，cell adhesion)之一或多个上。
[0088]
在一些实施方案中，检测的基因标志物包含具有go_bp_direct细胞外基质组织注释的基因，并且选自例如，pecam1,itgb2,app,fbn1,cd44,ncan,spock2,col16a1,lamb2,b4galt1,dag1,slc39a8,jam2,itga8,ibsp,col28a1,acan,adamts18,itgb6,lamb3,itga9,itga5,pdgfb,itgae,itgb5,mpzl3,nf1,ptk2,lamc1,tgfbi,sox9,ccn1,itgam,egflam,npnt,vit,tnf,itgb3,bsg,foxf1,lama1,vwf,mmp12,ndnf,fbln1,itga4,vcan,tnr,col14a1,itgav,icam3,comp,icam5,lama3,lama5,fn1,adamts13,ccdc80,col7a1,col3a1,col1a1,fbln2,lama2,thbs1,lamb1,vcam1,icam1,itgad,col4a3,dmp1,ddr1,fgg,fgb,fga,itga1,cdh1,mmp14,vtn,itgb4,itga6,postn,madcam1,adam15,jam3,itga7,myf5,itgb8,itgb7,itga3,wnt3a,tnc,pdgfra,adamts12,hapln1,ecm2,nid1,egfl6,lamc2,itga2b,adamts9,itga10,col8a2,fbln5,serpine1,nid2,f11r,col13a1,cd47,col8a1,hsd17b12,smoc2,icam2,col4a6,itga11,col6a3,col6a2,col6a1,itgax,itgal,mmp24,spp1,col19a1,icam4,itgb1,adam12,col18a1,col15a1,adam19,lama4,kdr,itga2,col17a1,col5a1,bcan,col5a3,lamc3,dnajb6,spink5,ddr2，col9a3，ercc2。在优选的实施方案中，本发明的生物标志物包含具有go_bp_direct细胞外基质组织注释的基因，其选自：lama5，lama2,itgb4,itga11,spp1,tnc,itga9，col18a,col13a1,nid2,acan,cdh1,ercc2,和col9a3。
[0089]
在一些实施方案中，在本发明的组合物和方法例如诊断和预测方法中，检测的基因标志物包含来自(a)-(d)之一或多个中的基因的组合，：
[0090]
(a)具有kegg_pathway：细胞外基质-受体相互作用通路(hsa04512)注释的基因，例如图9中所示在hsa04512分类下的基因；
[0091]
(b)具有go_bp_direct:细胞外基质组织(go:0030198)注释的基因，例如图9中所示在go:0030198分类下的基因；
[0092]
(c)具有kegg_pathway:pi3k-akt信号传导通路(hsa04511)注释的基因，例如图9中所示在hsa04511分类下的基因；
[0093]
(d)具有kegg_pathway:focal adhesion(hsa04510)注释的基因，例如图9中所示在hsa04510分类下的基因。
[0094]
优选地，检测的基因标志物包含来自(a)或(b)的n基因；任选地，还包含来自(c)和/(d)的m基因。n可以是选自2至300，2至200,2至150，2至100，2至50，或2-40，或2-30，或2-25，或2-20，或2-15，或2-10，或2-5的整数。m可以是选自2至300，2至200,2至150，2至100，2至50，或2-40，或2-30，或2-25，或2-20，或2-15，或2-10，或2-5的整数。
[0095]
在优选的实施方案中，在本发明的组合物和方法例如诊断和预测方法中，检测的基因标志物包含以下的通路相关基因之一或其任意组合：lama5，lama2,itgb4,itga11,spp1,tnc,itga9,col24a,col6a6，col18a,col13a1,nid2,acan,cdh1,ercc2,col9a3,phlpp2,ifna4,crtc2,csf3r,csf1,gys1,creb3l4,lpar6,shc4,和myl12a。在一些实施方案
中，检测的基因标志物包含由n个通路相关基因组成的基因标志物组合，其中n是选自2至27，或2-25，或2-20，或2-15，或2-10，或2-5的整数。在另一些实施方案中，检测的基因标志物包含lama5，lama2,itgb4,itga11,spp1,tnc,itga9,col24a,col6a6，col18a,col13a1,nid2,acan,cdh1,ercc2,col9a3,phlpp2,ifna4,crtc2,csf3r,csf1,gys1,creb3l4,lpar6,shc4,和myl12a。
[0096]
ii..本发明的生物标志物
[0097]
本发明在再一方面提供了可用于表征、分类、和诊断本发明的“亚临床垂体功能减退性反复植入失败疾病亚型，以及可以用于预测反复植入失败患者对补充hcg的黄体支持治疗的反应性的标志物或标志物组合，及包含用于其检测的试剂的组合物或产品(例如，微阵列芯片)、及其在本发明的诊断和预测方法中的相应用途。
[0098]
因此，在一方面，本发明提供了分离的生物标志物或标志物组合，其包含或由一个或多数个通路相关基因组成，其中所述通路相关基因选自：根据kegg和go注释在以下至少一个或多个生物学通路或生物学过程上的基因：
[0099]
(a)kegg_pathway：细胞外基质-受体相互作用通路(hsa04512)；
[0100]
(b)go_bp_direct:细胞外基质组织(go:0030198)；
[0101]
(c)kegg_pathway:pi3k-akt信号传导通路(hsa04511)；
[0102]
(d)kegg_pathway:focal adhesion(hsa04510)，
[0103]
在一些实施方案中，分离的生物标志物组合包含图9所示通路相关基因生物标志物中的n个标志物。在一些优选实施方案中，分离的生物标志物组合包含选自图9中所示类别hsa04512和go:0030198中所列的生物标志物中的n个标志物；任选地，还包含选自图9中所示类别hsa04511和hsa04510中所列的生物标志物中的m个标志物。n可以是选自2至300，2至200,2至150，2至100，2至50，或2-40，或2-30，或2-25，或2-20，或2-15，或2-10，或2-5的整数。m可以是选自2至300，2至200,2至150，2至100，2至50，或2-40，或2-30，或2-25，或2-20，或2-15，或2-10，或2-5的整数。
[0104]
在优选的实施方案中，生物标志物或标志物组合由lama5，lama2,itgb4,itga11,spp1,tnc,itga9,col24a,col6a6，col18a,col13a1,nid2,acan,cdh1,ercc2,col9a3,phlpp2,ifna4,crtc2,csf3r,csf1,gys1,creb3l4,lpar6,shc4,和myl12a中的n个通路相关基因组成。n可以是选自2至27，或2-25，或2-20，或2-15，或2-10，或2-5的整数。
[0105]
在一些实施方案中，本发明的生物标志物组合包含选自一下的至少1个或至少两个分离的生物标志物：lama5，lama2,itgb4,itga11,spp1,tnc,itga9，col24a,col6a6。
[0106]
在一些实施方案中，本发明的生物标志物组合包含选自一下的至少1个或至少两个分离的生物标志物：lama5，lama2,itgb4,itga11,spp1,tnc,itga9，col18a,col13a1,nid2,acan,cdh1,ercc2,和col9a3。
[0107]
在一些实施方案中，本发明的生物标志物组合包含选自一下的至少1个或至少两个分离的生物标志物：lama5，lama2,itgb4,itga11,spp1,tnc,itga9，col24a,col6a6，phlpp2,ifna4,crtc2,csf3r,csf1,gys1,creb3l4,lpar6。
[0108]
在一些实施方案中，本发明的生物标志物组合包含选自一下的至少1个或至少两个分离的生物标志物：lama5，lama2,itgb4,itga11,spp1,tnc,itga9，col24a,col6a6，shc4,myl12a。
[0109]
在一些实施方案中，本发明的生物标志物组合可以用于表征、诊断或分类“亚临床垂体功能减退性”反复植入失败患者。
[0110]
在一些实施方案中，本发明的生物标志物组合可用于预测反复植入失败患者对黄体支持治疗的治疗反应性。在一些实施方案中，所述黄体支持治疗包括：在胚胎植入后，使用黄体生成活性相关药物，尤其是lh或lh替代物，优选地hcg。在一些优选方案中，黄体生成活性相关药物为肌注hcg，优选地，所述黄体生成活性相关药物在胚胎植入后施用，优选地所述药物与调节雌激素和/或孕激素的药物(例如黄体酮药物和/或雌激素药物)联合使用。优选地，hcg以剂量100-800iu，或200-500iu施用，更优选地在移植后隔日，患者每天肌内注射500iu hcg。
[0111]
在一些实施方案中，在本发明的组合物和方法中，本发明的生物标志物可以进一步与其他指示个体状况的标志物结合。在一些优选的实施方案中，与黄体期d2血清lh水平结合。可以采用本领域已知的任何方法，测量受试者的d2血清lh水平。在一个优选的实施方案中，在本发明疾病亚型患者中，或在本发明的治疗反应性患者中，d2血清lh水平为小于5iu/l，例如小于4iu/l,3iu/l,2iu/l,或小于1iu/l。iu指lh的国际单位。
[0112]
生物标志物的检测
[0113]
在本发明的组合物和方法例如诊断和预测方法中，在来自受试者的样本中检测本发明基因标志物的信息。在一些实施方案中，所述检测包括确定和比较受试者样本与参照之间在所述基因标志物上的基因变异。在一些实施方案中，基因变异通过在核酸水平上检测基因标记物来实现，例如测序、微阵列杂交、snp检测等。在另一些实施方案中，基因变异通过在蛋白水平上检测基因标记物的基因编码的蛋白来实现，例如对编码的蛋白在结构(例如氨基酸序列)、表达水平、和/或功能或活性上的检测，以指示所述基因中是否存在与受试者的疾病亚型和/或治疗反应性相关的基因变异。
[0114]
本领域已知多种可用于核酸和蛋白水平检测基因变异的方法。这些方法均适用于本发明。所述方法包括但不限于，核酸测序、聚合酶链式反应(pcr)、基于质谱的分析方法、基于抗体的分析方法、以及任何两者或多者的组合。
[0115]
在一些实施方案中，检测基因标志物的基因编码的rna。rna的检测可以通过测序、微阵列、sage、印迹、rt-pcr或定量pcr之一或其组合进行，优选通过微阵列进行。在另一些实施方案中，检测基因标志物的基因编码的蛋白质产物。蛋白质的检测可以通过elisa，质谱、印迹、或免疫化学来确定，优选通过elisa进行。
[0116]
根据本文描述的任何方法，用于本发明基因标志物检测的样本可以是核酸或包含核酸的样本。所述核酸可以是由基因组dna转录的rna或由rna生成的cdna。核酸可以源自受试者的细胞、组织、体液等适宜的生物学样本。在对核酸实施检测前，在一些实施方案中，可以包括获得核酸的拷贝，例如由扩增得到的拷贝。扩增在特定情况下可能是期望的，例如可以便于获得所需量的材料用于检测变异。随后可以对扩增子实施变异检测方法，例如本领域已知的和本文描述的基因变异检测方法，例如探针杂交等。
[0117]
根据本文描述的任何方法，用于本发明基因标志物检测的样本可以是基因标志物编码的蛋白/多肽/肽或包含所述蛋白/多肽/肽的样本。在一些实施方案中，在对蛋白/多肽/肽进行检测前，可以包括从样本纯化或分离所述蛋白/多肽/肽。
[0118]
在一些实施方案中，一个或多个生物标志物的检测和/或定量包括利用捕获试剂
的测定方法。捕获试剂的例子可以包括，但不限于，寡核苷酸、抗体、抗体片段、基于核酸的蛋白质结合物、小分子等等。在一些实施方案中，捕获试剂是与生物标志物基因杂交的寡核苷酸、多核苷酸或核酸分子。在一些实施方案中，所述捕获试剂为包含在微阵列中的探针，所述测定方法包括微阵列杂交。在另一些实施方案中，捕获试剂是抗体，所述测定方法可以是免疫测定法，例如western印迹、酶免疫测定(eia),酶联免疫吸附测定(elisa)，和放射免疫测定(ria)。用于捕获检测的固体基质可以包括，但不限于，96孔板、硝化纤维膜、微珠、微粒。
[0119]
在一个优选的实施方案中，微阵列用于检测本发明生物标志物基因中的变异。微阵列典型地使用排成阵列的数千个核酸探针，在高严格条件下与例如cdna或crna样本杂交。探针靶杂交一般通过检测荧光团、银或化学发光标记的靶来检测和定量，从而测定靶中核酸序列的相对丰度。在典型的微阵列中，探针通过与化学基质(经由环氧基硅烷、氨基硅烷、赖氨酸、聚丙烯酰胺或其他)的共价键与固体表面附着。固体表面是例如玻璃、硅片或微型珠。多种微阵列是商购可得的，包括例如由affymetrix，inc.和illumina，inc制造的微阵列。
[0120]
在另一优选实施方案中，检测方法用于检测由本发明的生物标志物编码的蛋白，以检测是否存在指示基因变异的蛋白质序列改变。在一个实施方案中，所述检测方法是基于elisa的方法。在一个实施方案中，elisa可以是直接elisa、间接elisa、多重elisa、elispot技术、夹心elisa、竞争性elisa，或本领域已知的其它类似技术。典型地的elisa使用抗体进行，但也可以使用与本发明生物标志物或其表达产物特异性结合的任何捕获试剂进行。
[0121]
许多蛋白质生物芯片可以用于本发明中。这些包括例如，但不限于，由packard bioscience company(meriden conn.),zyomyx(hayward,calif.)和phylos(lexington,mass.)生产的蛋白芯片。一般，蛋白芯片包含具有表面的基质。捕获试剂或吸附剂被附着在所述基质的表面上。所述表面经常包含多个可寻址的位置，每个位置具有结合在其上的捕获剂。这些捕获剂可以是生物分子，例如多肽或核酸或小分子，其以特异性的方式捕获本发明的生物标志物。
[0122]
为了便于检测，可检测标记物可以用于本文所述的任何直接或间接检测本发明生物标志物的方法中。各种可检测标记物均可以使用。可以基于检测所需的灵敏度、与捕获剂缀合的可行性、可用的检测仪器等等因素来选择可检测标记物。适宜的可检测标记物包括但不限于，荧光染料、化学发光染料、酶、纳米颗粒、生物素、地高辛、金属、放射性同位素等。
[0123]
适宜本发明的生物样本包括但不限于，血液、血清、及其他体液或活检组织。生物样本可以使用本领域技术人员已知的方法获得。在一些情况下，生物样本是血液、血浆、血清或外周血单核细胞(pbmc)。通过筛选此类样本，可以对于疾病例如rif实现简单的早期诊断。此外，就靶核酸(或编码的多肽)中的变异，通过测试此类样本，也可以容易地监控治疗的进展。
[0124]
在确定受试者或组织或细胞样本包含本文公开的变异基因功能富集模式、和/或指示本发明的疾病亚型的生物标志物或标志物组合后，可以考虑施用有效量的合适黄体支持治疗剂(包括黄体生成药物)，以改善受试者的胚胎移植临床结局，例如临床妊娠、胎儿活产。
[0125]
iii.本发明的诊断和预测方法
[0126]
基于本发明的特征性生物通路相关基因的变异检测，和/或基于本发明的生物标志物及其检测，本发明也提供了用于诊断和分类本发明疾病亚型的方法，和用于预测反复植入失败患者的治疗反应性的方法。
[0127]
因此，在一个方面，本发明提供了一种用于将受试者诊断或分类为亚临床垂体功能减退性反复植入失败疾病亚型的方法，所述方法包括在得自所述受试者的生物样品中检测受试者的基因变异信息，其中，如果受试者表现出在选自以下的至少一个或多个kegg生物学通路或go生物学过程中具有一个或多个通路相关基因(优选地至少2个，3个，且更优选地至少4个或5个基因)的变异，则将所述受试者诊断或分类为亚临床垂体功能减退性反复植入失败：
[0128]-kegg_pathway：细胞外基质-受体相互作用通路(hsa04512)；
[0129]-go_bp_direct:细胞外基质组织(go:0030198)；
[0130]-kegg_pathway:pi3k-akt信号传导通路(hsa04511)；
[0131]-kegg_pathway:focal adhesion(hsa04510)。
[0132]
在一些实施方案中，本发明的诊断方法包括：在来自受试者的生物学样本中检测一个或多数个(例如10个-30个、或30-100个、150-500个以上)通路相关基因的信息，其中所述通路相关基因选自：根据kegg和go注释在以下至少一个或多个生物学通路或生物学过程上的基因：
[0133]-kegg_pathway：细胞外基质-受体相互作用通路(hsa04512)；
[0134]-go_bp_direct:细胞外基质组织(go:0030198)；
[0135]-kegg_pathway:pi3k-akt信号传导通路(hsa04511)；
[0136]-kegg_pathway:focal adhesion(hsa04510)，
[0137]
其中，如果所述信息指示所述通路相关基因中的一个或多个(优选两个、3个，更优选地至少4个或5个)发生变异，则受试者诊断或分类为所述的疾病亚型，
[0138]
优选地，所述发生变异的通路相关基因中至少有一个(优选至少两个或3个)根据kegg和go注释在选自以下的kegg生物学通路或go生物学过程上：
[0139]-kegg_pathway：细胞外基质-受体相互作用通路；
[0140]-go_bp_direct:细胞外基质组织；
[0141]
更优选地，所述基因根据kegg和go被注释在kegg_通路细胞外基质-受体相互作用通路和/或go_bp_direct细胞外基质组织上、且注释在kegg_通路pi3k-akt信号传导通路和focal adhesion上。
[0142]
在一些优选的实施方案中，所述诊断/分类方法包括：在来自受试者的生物学样本中检测选自以下的通路相关基因之一或其任意组合：lama5，lama2,itgb4,itga11,spp1,tnc,itga9,col24a,col6a6，col18a,col13a1,nid2,acan,cdh1,ercc2,col9a3,phlpp2,ifna4,crtc2,csf3r,csf1,gys1,creb3l4,lpar6,shc4,和myl12a；其中，当在受试者的生物样本中检测到指示所述一个或多个通路相关基因(优选地至少2个或3个，且更优选地至少4个或5个基因)存在基因变异的信息时，则将所述受试者诊断或分类为所述的疾病亚型。
[0143]
在一些优选的实施方案中，根据本发明方法诊断为所述疾病亚型的受试者至少在选自以下的至少一个基因上具有变异：lama5，lama2,itgb4,itga11,spp1,tnc,itga9,
col24a,col6a6，col18a,col13a1,nid2,acan,cdh1,ercc2,col9a3。
[0144]
在另一些优选的实施方案中，根据本发明方法诊断为所述疾病亚型的受试者，与参照相比，表现出在所述的kegg生物学通路或go生物学过程中的变异基因富集，优选地所述富集表现为受试者比参照在所述生物学通路或生物学过程上具有更多个的通路相关基因发生变异，优选地，比参照多至少2个、3个或4个的通路相关基因发生变异。
[0145]
在根据前述的诊断方法的任一实施方案中，受试者可以无明确的反复植入失败原因且无明显的垂体器质性病变，但表现出轻微的垂体功能减退症状。
[0146]
在根据前述的诊断方法的任一实施方案中，所述诊断方法还包括检测受试者黄体期d2期血清水平，优选在早上进行检测。优选地，诊断为本发明疾病亚型的患者还具有小于或等于5iu/l的黄体期d2日血清lh水平，更优选小于3iu/l,2iu/l,或1iu/l。
[0147]
在另一方面，本发明提供了一种用于预测反复植入失败(rif)受试者是否适宜用黄体支持治疗剂进行治疗、或用于预测反复植入失败(rif)受试者对黄体支持治疗的反应性的方法，其中所述黄体支持治疗包括在子宫内膜转化日后，优选在胚胎植入后，施用黄体生成活性相关药物，例如lh和/或hcg，优选地hcg，
[0148]
其中所述方法包括：在得自所述受试者的生物样品中检测受试者的基因变异信息，其中，如果受试者表现出在选自以下的至少一个或多个kegg生物学通路或go生物学过程中具有一个或多个通路相关基因(优选地至少2个，3个，且更优选地至少4个或5个基因)的变异，则指示所述受试者适宜用所述黄体支持治疗剂，或可能对所述黄体支持治疗剂产生治疗反应：
[0149]-kegg_pathway：细胞外基质-受体相互作用通路(hsa04512)；
[0150]-go_bp_direct:细胞外基质组织(go:0030198)；
[0151]-kegg_pathway:pi3k-akt信号传导通路(hsa04511)；
[0152]-kegg_pathway:focal adhesion(hsa04510)。
[0153]
在本发明预测方法的一些实施方案中，所述预测方法包括：在来自受试者的生物学样本中检测一个或多数个通路相关基因的信息，其中所述通路相关基因选自：根据kegg和go注释在以下至少一个或多个生物学通路或生物学过程上的基因：
[0154]-kegg_pathway：细胞外基质-受体相互作用通路(hsa04512)；
[0155]-go_bp_direct:细胞外基质组织(go:0030198)；
[0156]-kegg_pathway:pi3k-akt信号传导通路(hsa04511)；
[0157]-kegg_pathway:focal adhesion(hsa04510)，
[0158]
其中，如果所述信息指示所述通路相关基因中的一个或多个(优选两个、3个，更优选地至少4个或5个)发生变异，则预测所述受试者适宜用所述黄体支持治疗剂，或可能对所述黄体支持治疗剂产生治疗反应，
[0159]
优选地，所述发生变异的通路相关基因中至少有一个(优选至少两个或3个)根据kegg和go注释在选自以下的kegg生物学通路或go生物学过程上：
[0160]-kegg_pathway：细胞外基质-受体相互作用通路；
[0161]-go_bp_direct:细胞外基质组织；
[0162]
更优选地，所述基因根据kegg和go被注释在kegg_通路细胞外基质-受体相互作用通路和/或go_bp_direct细胞外基质组织上、且注释在kegg_通路pi3k-akt信号传导通路和
focal adhesion上。
[0163]
在本发明预测方法的一些实施方案中，所述预测方法包括：在来自受试者的生物学样本中检测选自以下的通路相关基因之一或其任意组合：lama5，lama2,itgb4,itga11,spp1,tnc,itga9,col24a,col6a6，col18a,col13a1,nid2,acan,cdh1,ercc2,col9a3,phlpp2,ifna4,crtc2,csf3r,csf1,gys1,creb3l4,lpar6,shc4,和myl12a；其中，当在受试者的生物样本中检测到指示所述一个或多个通路相关基因(优选地至少2个或3个，且更优选地至少4个或5个基因)存在基因变异的信息时，则预测所述受试者适宜用所述黄体支持治疗剂，或可能对所述黄体支持治疗剂产生治疗反应。
[0164]
优选地，经预测适宜接受所述治疗或可能对所述治疗产生治疗反应的受试者至少在选自以下的至少一个基因上具有变异：lama5，lama2,itgb4,itga11,spp1,tnc,itga9,col24a,col6a6，col18a,col13a1,nid2,acan,cdh1,ercc2,col9a3。
[0165]
在根据本发明预测方法的一些实施方案中，所述方法包括：如果与参照相比，受试者表现出在所述的kegg生物学通路或go生物学过程中的变异基因富集，优选地所述富集表现为受试者比参照在所述生物学通路或生物学过程上具有更多个的通路相关基因发生变异，优选地，比参照多至少1个、至少2个、3个或4个的通路相关基因发生变异，则预测所述受试者适宜用所述黄体支持治疗剂，或可能对所述黄体支持治疗剂产生治疗反应。
[0166]
在根据本发明预测方法的任何实施方案中，受试者可以是无明确的反复植入失败原因且无明显的垂体器质性病变，但表现出轻微的垂体功能减退症状。
[0167]
在根据本发明预测方法的任何实施方案中，优选地，所述方法还包括检测受试者的黄体期d2日血清lh水平。优选地，预测具有治疗反应性的受试者具有小于5iu/l的d2血清lh水平，更优选小于3iu/l,2iu/l,或1iu/l的d2血清lh水平。
[0168]
在任何上述方法中，在一些实施方案中，基因变异为错义突变，优选地，所述变异不导致基因失活，但影响基因编码的蛋白质的生物学活性，优选地，所述突变在正常健康人群中的等位基因频率
[0169]
《0.01。
[0170]
在任何上述方法中，在一些实施方案中，所述生物样品选自血液、血清、及其他体液或活检组织。
[0171]
在任何上述方法中，在一些实施方案中，所述基因变异信息使用pcr法或微阵列芯片进行测量。
[0172]
在任何上述方法中，在一些实施方案中，所述基因变异信息使用测序方法，优选地外显子测序方法获得。
[0173]
在任何上述方法中，在一些实施方案中，所述基因变异信息通过检测所述基因编码的蛋白的生物学活性获得，优选地，所述生物学活性为降低的生物学活性。
[0174]
在任何上述方法中，在一些实施方案中，所述测量包含使用免疫测定，例如elisa测定，检测由变异基因编码的突变蛋白。
[0175]
在任何上述方法中，在一些实施方案中，所述黄体支持治疗包括：在补充黄体酮和/或雌激素药物的基础上，进一步在子宫内膜转化日后，优选在胚胎植入后，补充黄体生成相关活性药物，例如lh或hcg，更优选地，肌注hcg。优选地所述黄体支持治疗还包括，在黄体支持治疗期间，根据患者的孕激素和/或雌激素水平，调节黄体酮和/或雌激素药物的给
药量。优选地，hcg以剂量100-800iu或200-500iu施用，
[0176]
更优选地自移植后隔日开始，患者每日肌内注射500iu hcg。
[0177]
在本发明的诊断和预测方法，在另一些实施方案中，也可以采用基于机器学习的分类器来进行诊断和预测。适用于本发明的机器学习算法包括，但不限于，线性区分分析、支持向量机、递归特征消除、微阵列预测分析、logistic回归、cart、flextree,lart,随机森林等。因此，在一些实施方案中，本发明的诊断和预测方法包括如下步骤：
[0178]-体外测定多个已知的亚临床垂体功能减退性反复植入失败患者(优选地，所述患者具有黄体期d2血清lh水平《5iu/l)的样本中的多数个目标核酸的变异，构建训练数据集；
[0179]-使用训练数据集，训练分类器，例如随机森林分类器；
[0180]-从受试者的体外样本测定多数个目的核酸的变异，使用经训练的分类器，预测、判定或评价受试者分类为本发明rif疾病亚型、或对本发明的黄体支持治疗产生反应的可能性。
[0181]
分类和预测可以根据训练的机器学习模型而设置为阈值，即，用于确定样本属于给定类别的概率的阈值。该概率阈值可以是至少50％，或至少60％，或至少70％，或至少80％或更高。分类或预测也可以通过比较从受试者获得的数据集与参照数据集，确定两者之间是否存在统计学显著性差异，来进行。如果存在显著差异，则受试者被分类为属于不同于参照的类别。如果不存在显著差异，则受试者被分类为属于与参照相同的类别。
[0182]
通过生物标志组合和机器学习，在一些实施方案中，可以提供具有高特异性和高灵敏度的本发明诊断/分类和预测方法。
[0183]
在上述的任何诊断和预测方法中，检测的多数个生物标志物的变异，所述检测可以包括检测在图9中列出的n个生物标志物的基因变异。在一些实施方案中，n可以是选自n是选自2至50，或2-40，或2-30，或2-25，或2-20，或2-15，或2-10，或2-5的整数。在一些实施方案中，n是选自3至50，或3-40，或3-30，或3-25，或3-20，或3-15，或3-10，或3-5的整数。在一些实施方案中，n是选自4至50，或4-40，或4-30，或4-25，或4-20，或4-15，或4-10，或4-5的整数。在一些实施方案中，n是选自5至50，或5-40，或5-30，或5-25，或5-20，或5-15，或5-10的整数。在一些实施方案中，n是选自6至50，或6-40，或6-30，或6-25，或6-20，或6-15，或6-10的整数。本领域技术人员明了，n也可以选自相似或更大的数值范围。
[0184]
在优选的实施方案中，检测的多数个生物标志物的变异，所述的生物标志物组合由lama5，lama2,itgb4,itga11,spp1,tnc,itga9,col24a,col6a6，col18a,col13a1,nid2,acan,cdh1,ercc2,col9a3,phlpp2,ifna4,crtc2,csf3r,csf1,gys1,creb3l4,lpar6,shc4,和myl12a中的n个通路相关基因组成。n可以是选自2至27，或2-25，或2-20，或2-15，或2-10，或2-5的整数。
[0185]
在上述的任何诊断和预测方法中，优选地，生物标志物中的基因变异为错义突变，尤其是影响蛋白结构和/或功能的有害错义突变，例如通过sift和polyphen-2软件预测的有害错义突变。在一些实施方案中，错义突变的检测包括检测核酸序列上的核苷酸突变，包括例如snp，snv，插入和/或缺失等。在一些实施方案中，在上述的任何诊断和预测方法中，检测生物标志物中的基因变异包括检测本发明图10中列出的1个或多个snv(单核苷酸变异)，例如，2至50，或2-40，或2-30，或2-25，或2-20，或2-15，或2-10，或2-5个snv。可以通过微阵列杂交、测序等方式，进行snv的检测。也可以通过检测由该snv编码的蛋白质氨基酸序
列改变，来检测所述snv。也可以通过检测包含所述snv的基因编码的蛋白的活性，来检测所述snv。在一些优选的实施方案中，在本发明的组合物和方法中，包括检测选自以下的一个或多个snv：rs375041472,rs2276331,rs117194484,rs749258477,rs201006742,rs532783486,rs533178276,rs140413590,rs745335790,rs200254355,rs187465892,rs770208004,rs768170625,rs769085031,rs759512073,rs113055208,rs145852498,rs147773336,rs779870630,rs200796753,rs529211517,rs201251711,rs140368397,rs749946427,rs181688285,rs139813458,rs754919524,rs754641652,rs199896561，和lpar6上snv,例如染色体13位置48986219上c到t突变(该snv导致氨基酸改变：lpar6:nm_001162498:exon1:c.g341a:p.r114q)。在再一些优选实施方案中，在本发明的组合物和方法中，包括检测选自以下的一个或多个snv：rs375041472,rs2276331,rs117194484,rs749258477,rs201006742,rs532783486,rs533178276,rs745335790,rs200254355,rs187465892,rs770208004,rs768170625,rs769085031,rs759512073,rs145852498,rs147773336,rs779870630,rs200796753,rs529211517,rs201251711,rs140368397,rs749946427,rs181688285,rs139813458,rs754919524,rs754641652,rs199896561，和snv染色体13位置48986219上c到t突变。
[0186]
iv..本发明的黄体支持rif治疗方法
[0187]
在长期的临床实践中，本发明人发现，一些rif患者具有明显低的黄体期第2日(d2)lh血清激素水平。即，在这些rif患者中，在排卵后的黄体期中，除了通常已知的雌激素和孕激素异常外，(早上8点抽取的患者血液中)lh也表现出异常。但是，临床检查，这些患者并无明显的垂体器质性病变。
[0188]
通过致力于开发针对此类rif患者的临床治疗方案，本发明人发现：在此类患者群体中，在应用黄体酮和雌激素药物进行常规黄体支持的基础上，进一步补充hcg，可以有效地改善患者的临床结局，包括临床妊娠率和活产率。进一步基因水平研究发现，表现出治疗反应性的患者个体具有特征性的生物通路基因变异。
[0189]
由此，本发明人提出了一种新的黄体支持治疗方法，所述方法包括，在具有特征性生物通路基因变异和/或具有黄体期d2日lh水平小于5iu/l的反复植入失败患者中，在给与黄体酮和雌激素进行黄体支持治疗的基础上，进一步在胚胎移植后补充黄体生成活性相关药物。
[0190]
因此，再一方面，本发明提供了一种向反复植入失败患者提供黄体支持治疗的方法，所述方法包括，在子宫内膜转化日后，优选地在胚胎植入后，给所述患者施用有效量的黄体生成活性相关药物，例如hcg和/或lh，优选hcg，
[0191]
其中所述患者表现出在选自以下的至少一个或多个kegg生物学通路或go生物学过程中具有一个或多个通路相关基因(优选地至少2个，3个，且更优选地至少4个或5个基因)的变异：
[0192]-kegg_pathway：细胞外基质-受体相互作用通路(hsa04512)；
[0193]-go_bp_direct:细胞外基质组织(go:0030198)；
[0194]-kegg_pathway:pi3k-akt信号传导通路(hsa04511)；
[0195]-kegg_pathway:focal adhesion(hsa04510)；
[0196]
优选地，所述发生变异的通路相关基因中至少有一个(优选至少两个或3个)根据
kegg和go注释在选自以下的kegg生物学通路或go生物学过程上：
[0197]-kegg_pathway：细胞外基质-受体相互作用通路；
[0198]-go_bp_direct:细胞外基质组织；
[0199]
更优选地，所述基因根据kegg和go被注释在kegg_通路细胞外基质-受体相互作用通路和/或go_bp_direct细胞外基质组织上、且注释在kegg_通路pi3k-akt信号传导通路和focal adhesion上。
[0200]
在本发明的黄体支持治疗方法中，在一些优选的实施方案中，患者在以下的通路相关基因之一或其组合上具有基因变异：lama5，lama2,itgb4,itga11,spp1,tnc,itga9,col24a,col6a6，col18a,col13a1,nid2,acan,cdh1,ercc2,col9a3,phlpp2,ifna4,crtc2,csf3r,csf1,gys1,creb3l4,lpar6,shc4,和myl12a。
[0201]
在本发明的黄体支持治疗方法中，在一些优选实施方案中，患者在包含至少2个、至少3个，或更优选至少4个或5个通路基因的基因组合上具有基因变异，且更优选地，所述基因组合至少包含选自以下的至少一个基因：lama5，lama2,itgb4,itga11,spp1,tnc,itga9,col24a,col6a6，col18a,col13a1,nid2,acan,cdh1,ercc2,col9a3。
[0202]
在本发明的黄体支持治疗方法中，在一些优选实施方案中，患者的黄体期d2血清水平≤5iu/l，例如，小于4iu/l，或3iu/l，或2iu/l，或小于1iu/l。
[0203]
在前述黄体支持治疗方法的任何实施方案中，优选地，所述基因变异为错义突变，优选地，所述变异不导致基因失活，但影响基因编码的蛋白质的生物学活性，优选地，所述突变在正常健康人群中的等位基因频率《0.01。
[0204]
在一个实施方案中，rif患者还具有异常的雌激素和孕激素水平。在另一些实施方案中，所述黄体支持治疗方法还包括：自子宫内膜转化日起，根据患者的黄体期黄体酮、雌激素、黄体生成素水平，参照正常妊娠的标准激素曲线，给予黄体酮和/或雌激素药物进行患者的激素水平调整。
[0205]
优选地，在一些实施方案中，本发明的方法导致在所述rif患者中改善的临床结局。在一些实施方案中，所述改善的临床结局为改善的临床妊娠率。在另一些实施方案中，所述改善的临床结局为改善的活产率。在再一些实施方案中，所述改善的临床结果包括改善的临床妊娠率和改善的活产率。在又一些实施方案中，本发明的方法不导致增加的多胎妊娠率、流产率、和/或异位妊娠率。
[0206]
因此，在一些实施方案中，本发明也提供用于改善反复植入失败患者的胚胎植入临床结局，例如临床妊娠率和/或活产率的方法，其中所述反复植入失败患者根据本发明的方法被诊断或分类为本发明的亚临床垂体功能减退性反复植入失败，任选地所述患者还具有小于等于5iu/l的黄体期d2血清lh水平，所述方法包括：在黄体酮和/或雌激素的常规黄体支持治疗基础上，进一步在胚胎植入后补充黄体生成活性相关药物。优选地，与未补充黄体生成活性相关药物的常规方法相比，补充黄体生成活性相关药物的本发明方法在所述患者中导致临床结局的改善。
[0207]
在一个优选的实施方案中，补充的黄体生成活性相关药物为lh和/或hcg药物，优选为hcg。促黄体生成素lh目前的市场价格高而活性成分含量低，直接添加外源lh来补充lh给患者造成经济负担且效果差。而hcg是具有促黄体生成素样作用的药物绒毛膜促性腺激素。考虑到lh的α-亚基的结构与hcg相似，作用于相同受体，因此已经提出以外源hcg替代外
源lh来进行黄体支持的可能性。然而，hcg的加入存在着干扰植入后第7天的hcg检测值，不利于对生化妊娠的确认。因此，设计经济且实际的使用hcg的黄体支持方案，也是亟待解决的一个问题。
[0208]
在一个实施方案中，因此，本发明提供了一种补充hcg的rif患者黄体支持治疗方法。该方法解决了上述问题。在本发明的该黄体支持治疗方法中，在胚胎植入后，使用hcg，优选肌注hcg，且优选地，所述hcg以剂量100-800iu，或200-500iu施用，更优选地在移植后隔日起，患者每日肌内注射500iu hcg。
[0209]
正常人排卵后第2天雌激素e2水平不低于100pg/ml，孕激素p水平不低于10ng/ml，第5天促黄体生成素水平不低于6miu/ml。为治疗具有亚临床垂体功能不全的本发明复发性植入失败患者，在一些实施方案，本发明黄体支持治疗方法也包括：根据患者自身黄体期各项激素水平的高低，在胚胎植入周期中，例如自子宫内膜转化日起，参照标准激素曲线，开始给予相应黄体酮和/或雌激素药物，进行激素调整治疗。例如，在一些实施方案中，在黄体期d2后，定期测定激素(hcg，e2，lh和p)水平，并与设定的正常值比较，应用外源性激素药物(例如雌二醇和/或黄体酮)，补充相应的雌激素和/或孕激素，以使相应的激素水平达到设定的正常标准。
[0210]
在前述治疗方法的一些实施方案中，患者具有本文所描述的本发明疾病亚型所特征性的生物通路相关基因变异(例如，前述的kegg pathway和go通路相关基因)，或具有本文所描述的本发明疾病亚型所特征性的一个或多个生物标志物的基因变异(如，前述的本发明生物标志物中的基因变异)，其中优选地所述基因变异为错义突变。
[0211]
在前述治疗方法的一些实施方案中，所述方法用于改善所述rif患者的子宫内膜容受性，和/或用于改善所述rif患者的临床妊娠和/或娩出活产胎儿的可能性。
[0212]
在前述治疗方法的一些实施方案中，在所述方法中，胚胎移植为冻融胚胎移植或新鲜周期移植，优选冻融胚胎移植。
[0213]
在前述治疗方法的一些实施方案中，所述方法包括在患者的黄体期规律检查激素lh和补充hcg。
[0214]
在前述治疗方法的一些实施方案中，rif患者在进行移植前经由自然周期、人工周期或促排卵周期开始子宫内膜转化。在一个优选实施方案中，rif患者在自然周期排卵后实施冻融胚胎移植。在另一优选实施方案中，rif患者在促排卵周期后实施冻融胚胎移植。在再一优选实施方案中，rif患者在行人工周期进行子宫内膜转化后实施冻融胚胎移植。
[0215]
在前述治疗方法的一个实施方案中，所述治疗方法还包括：在植入前以及在胚胎植入周期中，监测患者的激素水平，包括lh，p，e2和hcg水平。
[0216]
v..本发明的产品及其用途
[0217]
在一个实施方案中，本发明提供了包含检测本发明生物标志物或标志物组合的试剂的组合物。在另一实施方案中，本发明提供了包含本发明组合物的试剂盒。在另一实施方案中，本发明提供，所述组合物在制备用于本发明诊断和/或预测方法的试剂盒中的用途。在再一实施方案中，本发明提供了微阵列，所述微阵列包含了用于检测本发明标志物组合的试剂组合。
[0218]
在一些实施方案中，本发明的组合物、试剂盒、微阵列可以用于检测在以上本发明生物标志物的任何实施方案中列出的n个生物标志物的基因变异。n可以是n可以是选自n是
选自2至50，或2-40，或2-30，或2-25，或2-20，或2-15，或2-10，或2-5的整数。在一些实施方案中，n是选自3至50，或3-40，或3-30，或3-25，或3-20，或3-15，或3-10，或3-5的整数。在一些实施方案中，n是选自4至50，或4-40，或4-30，或4-25，或4-20，或4-15，或4-10，或4-5的整数。在一些实施方案中，n是选自5至50，或5-40，或5-30，或5-25，或5-20，或5-15，或5-10的整数。在一些实施方案中，n是选自6至50，或6-40，或6-30，或6-25，或6-20，或6-15，或6-10的整数。本领域技术人员明了，n也可以选自相似或更大的数值范围。相应地，在一些实施方案中，本发明的组合物、试剂盒、微阵列包含用于检测所述n个生物标志物的一种或多种试剂。
[0219]
在再一些实施方案中，本发明的试剂盒包含用于检测生物标志物的一种或多种试剂，以及任选地，用于容纳从受试者分离的生物样本的容器；和用于说明如何进行生物标志物检测和/或实施本发明诊断和/或预测方法的说明书。所述多种试剂可以包装在分开的容器中。此外，试剂盒也可以包含一个或多个对照参照样本，以及任选地用于实施所述检测(如微阵列检测或免疫检测)所需的检测时间。在一些实施方案中，试剂可以是与标志物结合的抗体、或核酸探针、或蛋白微阵列芯片、或核酸微阵列芯片。
[0220]
在一个实施方案中，本发明的试剂盒也可以包含用于检测生物标志物编码产物的活性的试剂，以定量或定性地指示所述生物标志物是否存在导致产物结构/活性改变的变异。
[0221]
在一些实施方案中，本发明提供了用于诊断或分类rif患者或用于预测rif患者对补充黄体生成活性相关药物的黄体支持的治疗反应性的组合物，其中所述组合物包含用于检测生物标志物组的信息的试剂或试剂组合，
[0222]
其中所述生物标志物组由多数个通路相关基因组成，其中所述通路相关基因选自：根据kegg和go注释在以下至少一个或多个生物学通路或生物学过程上的基因：
[0223]-kegg_pathway：细胞外基质-受体相互作用通路(hsa04512)；
[0224]-go_bp_direct:细胞外基质组织(go:0030198)；
[0225]-kegg_pathway:pi3k-akt信号传导通路(hsa04511)；
[0226]-kegg_pathway:focal adhesion(hsa04510)，
[0227]
例如，所述生物标志物组由lama5，lama2,itgb4,itga11,spp1,tnc,itga9,col24a,col6a6，col18a,col13a1,nid2,acan,cdh1,ercc2,col9a3,phlpp2,ifna4,crtc2,csf3r,csf1,gys1,creb3l4,lpar6,shc4,和myl12a中的至少2个、至少5个、至少10个、至少15个、或全部通路相关基因组成，
[0228]
优选地，所述检测提供所述通路相关基因的变异信息，所述变异优选为错义突变，
[0229]
优选地，所述试剂为用于检测所述基因变异的多核苷酸、和/或用于检测由所述基因变异编码的突变蛋白的量和/或活性的试剂(例如抗体)。
[0230]
在一些优选的实施方案中，所述组合物以微阵列芯片的形式存在，包含用于提供所述生物标志物组的信息的多核苷酸试剂或试剂组合，优选地，所述多核苷酸试剂为与所述通路基因的错义突变位点(例如snp)杂交的多核苷酸。
[0231]
在一些实施方案中，本发明也提供了试剂盒，其中所述试剂盒包含本发明的诊断/预测组合物或微阵列芯片。
[0232]
在再一些实施方案中，本发明也提供了本发明的诊断/预测组合物、本发明的微阵
列芯片，或本发明的试剂盒在制备用于诊断或分类rif患者、或用于预测rif患者对补充黄体生成活性相关药物的黄体支持的治疗反应性的产品中的用途。
[0233]
以下缩略词用于实施例中。
[0234]
lh：
ꢀꢀꢀꢀꢀ
促黄体生成素；
[0235]
fsh:
ꢀꢀꢀꢀꢀ
促卵泡激素；
[0236]
p:
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
黄体酮(也称作孕酮)；
[0237]
e2： 雌二醇；
[0238]
hcg：
ꢀꢀꢀꢀ
绒毛膜促性腺激素；
[0239]
ivf-et： 体外受精-胚胎移植；
[0240]
fet：
ꢀꢀꢀꢀ
冻融胚胎移植；
[0241]
rif：
ꢀꢀꢀ
反复植入失败；
[0242]
m1,2,5,8,11,13,18:
ꢀꢀ
月经周期第1日、第2日、第5日、第8日、第11日、第13日、第18日
[0243]
d0：
ꢀꢀꢀꢀ
子宫内膜转化日，在自然周期和促排卵周期中为排卵日；在人工周期中为开始施用子宫内膜转化药物的施用日。
[0244]
d2：
ꢀꢀꢀꢀꢀ
自子宫内膜转化日d0起计算的第2日。
[0245]
bmi：
ꢀꢀꢀꢀ
体质指数。
实施例
[0246]
实施例1
[0247]
为探讨促黄体生成素与rif的关系，检测了rif患者促黄体生成素lh在月经周期中的血清水平周期变化，并与其它ivf患者的lh水平周期变化进行比较。
[0248]
在之前的研究中，曾选取无胚胎停育病史的、单独输卵管因素的继发性不孕症患者，年龄25-36岁(平均27.5
±
2.4)，三个月内无激素类药物应用，测定了排卵后第3天和第5天lh值。该患者群体的d3天的lh平均水平为7.63
±
3.49miu/ml；d5天的lh平均水平为6.67
±
4.53miu/ml，未表现出黄体期低lh水平。在本实施例中，为此选择了因单纯输卵管因素而行ivf-et的患者作为对照。
[0249]
简言之，在本实施例中，选择了有rif病史的患者作为试验组；同时选择了因单纯输卵管因素而行ivf-et的患者作为对照组。入选者均于月经第8日始每天行经阴道超声检测卵泡发育，确定排卵日(d0天)。于月经周期(m)第2,5,8,11,13日(即，m2,m5,m8,m11,m13，其中，以月经周期第1日为m1)，并于排卵后第2天(d2，其中以排卵日为d0日)，在早上8点抽取外周血，用于血清中促黄体生成素lh水平测定。由此，监测所选患者的lh周期变化并作曲线图。
[0250]
结果发现，相对于对照组，一些rif患者表现出黄体期低lh水平。
[0251]
在下面的表1和2中和图1和图2中，分别示例性显示了在一些rif患者和一些因输卵管问题行ivf的患者中检测到的lh水平周期变化(lh单位：miu/ml)。
[0252]
表1在反复植入失败患者中lh的周期变化
[0253][0254]
注:m2:月经期第2日；d2：排卵后的第2日
[0255]
表2在输卵管问题行ivf的患者中lh的周期变化
[0256][0257]
注:m2:月经期第2日；d2：排卵后的第2日
[0258]
临床观察发现，具有黄体期低lh血清水平的这些rif患者具有共同的特点：无明显的垂体器质性变化，且无可检测的特定反复植入失败原因；除具有已知的黄体期雌激素和黄体酮水平异常外，黄体期d2日lh水平也表现异常。促黄体生成素(lh)是由腺垂体细胞分泌的糖蛋白类促性腺激素，之前的研究表明，lh，除了通过黄体影响卵巢类固醇激素产生外，还可以直接作用于子宫。lh在这些rif患者中的d2血清水平异常提示：患者的垂体腺可能存在一定的功能损伤，并由此导致亚临床的垂体功能减退，并进而引发对胚胎植入和妊娠的多重不利影响。
[0259]
实施例2
[0260]
针对具有黄体期低lh血清水平的反复植入失败，给与补充lh功能类似物hcg的新黄体支持治疗方案，并对患者的相关临床治疗反应性进行了回顾性观察研究。在此回顾性观察研究中，根据之前在rif患者和输卵管因素ivf患者中进行的动态lh水平观察，将黄体期d2日血清lh水平≤5iu/l作为入组条件之一。
[0261]
入组本研究的患者均来自中国人民解放军总医院第六医学中心；并签署知情同意书。所有临床研究在进行之前均获得机构伦理委员会批准。
[0262]
共入组了84名患者。患者的一般健康状态良好，无免疫史、染色体异常和反复流产史；并且具有如下特征：(1)根据《胚胎植入前遗传学诊断/筛查技术专家共识》(中华医学遗传学杂质,2018,35(2):151-155)，诊断为具有rif病史，(2)年龄≥35岁且《45岁，其中29名患者的年龄≥35和《38,11名≥38和《40,25名的年龄≥40且《43,以及29名的年龄≥40和《45；(3)黄体期d2日血清lh水平≤5iu/l。经检查，这些入组患者均不表现器质性垂体损伤，且具有正常的基础促卵泡激素(fsh)、促黄体生成素(lh)和黄体酮(p)水平。
[0263]
根据采用的黄体支持方案的不同，将患者分为观察组和对照组。
[0264]
观察组的黄体支持方案：rif患者(包括自然周期、人工周期、和促排卵周期)，自子宫内膜转化日(即d0日)起，使用芬吗通(黄色片)、琪宁、阿司匹林和强的松。剂量如下：芬吗通(黄色片)1片，每日三次，口服(po)；琪宁2片，每日2次，经阴道给药(pv)；阿司匹林1片，每
日3次，po；强的松5mg，每日1次，po。在d2日，测定三种激素(雌二醇e2,促黄体生成素lh,和黄体酮p)的水平；并根据测定的雌激素和黄体酮水平，调整孕激素和雌激素药物的给药剂量。
[0265]
在移植后隔日起，患者每天肌内注射500iu hcg，其余药物同前。在移植后的第7日，评价hcg,e2,lh和p水平。
[0266]
·
如果hcg》50miu/ml，则确认妊娠。之后，每隔一天检测四种激素(hcg,e2,lh,和p)，以便及时确定hcg的加倍状态。调整雌激素和黄体酮药物的给药量，并每周一次检查这些激素的稳定情况，当激素不稳定时增加随访频率。在移植后30-35天，患者行阴道超声检查宫内妊娠和胚胎发育。在第49天行腹部超声以检查胎儿发育，酌情允许逐渐减少雌激素、黄体酮和hcg的给药。到12周，停止所有药物。行产科检查，随访期1年。
[0267]
·
如果5≤hcg≤50miu/ml，则继续施用药物hcg，并每隔一天检测四种激素(hcg,e2,lh,和p)。如果确认妊娠，则进行胎儿围护。如果hcg值不加倍，则终止药物。
[0268]
·
如果hcg≤5miu/ml，则确定患者未妊娠，终止药物施用。
[0269]
对照组的黄体支持方案：除了不施用hcg外，均与观察组相同。
[0270]
在此研究中，观察组和对照组中的移植均为冻融周期移植，这可以避免卵巢过度刺激综合征(ohss)。此外，由于lh和hcg的α亚基结构相似，且作用于相同受体；因此，可以以外源hcg替代外源lh来弥补欠缺的lh。hcg半衰期是25小时；肌内注射500iu的hcg后血液hcg值将不超过80miu/ml(实际上观察发现，大多数在50miu/ml内)。因此，每日小剂量500iu肌内注射，并不影响观察hcg因早期妊娠而出现的加倍。因此，当实际测量的hcg≥50miu/ml时，可以确认妊娠。
[0271]
临床结局记录
[0272]
记录两组的以下临床结局：生化妊娠、异位妊娠、临床妊娠、多胎妊娠、流产和活产。由于观察组使用hcg，因此对于两组的生化妊娠结局不进行比较。临床妊娠定义为：移植后30-35天行腹部b超检查，观察到孕囊。活产定义为：妊娠满20周后娩出一个或多个活产儿。
[0273]
统计分析
[0274]
使用spss版本21.0，进行数据统计分析。符合正态分布的定量数据表达为平均值
±
标准差，进行两独立样本t检验用于比较。不符合正态分布的定量数据表达为中值、p25和p75，进行秩和检验用于比较。定性数据表达为百分数，使用秩和检验用于比较。p《0.05视为统计学显著。
[0275]
结果：
[0276]
表3列出了观察组和对照组的患者特征和治疗周期的比较。表4列出了在两组之间的妊娠结局比较。在研究中，未检测到相关副反应。
[0277]
表3两组间患者特征和治疗周期的比较
[0278][0279][0280]
注:观察组：移植后隔日补充hcg的黄体支持；对照组:不补充hcg的常规黄体支持.p《0.05视为统计学显著差异。
[0281]
表4两组间妊娠结局的比较
[0282][0283]
注:观察组：移植后隔日补充hcg的黄体支持；对照组:不补充hcg的常规黄体支持；p《0.05视为统计学显著差异
[0284]
如表4所示，观察组和对照组之间没有检查到在异位妊娠率、多胎妊娠率和流产率上的显著差异(p》0.05)。但是，观察组和对照组在临床妊娠率(51.2％vs.29.3％,rr＝1.907,95％ci:1.106
–
3.289)和活产率(46.5％vs.24.4％,rr＝1.906,95％ci:1.019
–
3.570)上表现出了统计学显著的差异(p《0.05)。
[0285]
实施例3
[0286]
通过全基因组外显子测序和功能富集分析，检查在rif患者中hcg黄体支持治疗反应性的遗传基础。
[0287]
在本研究中，从采用实施例2所述hcg补充黄体支持治疗方案获得成功临床妊娠的rif患者中，随机选取了10例患者，作为病例组。同时，随机选取了未经lh激素水平测定且未经hcg补充黄体支持治疗的10例rif患者，作为对照组。入组研究的所有患者均来自中国人民解放军总医院第六医学中心；并签署知情同意书。病例组和对照组的患者特征比较显示在表5中。
[0288]
表5两组间患者的一般人口学特征的比较
[0289][0290]
注:p《0.05视为统计学显著差异。
[0291]
基因水平分析
[0292]
全基因组外显子测序
[0293]
使用dneasy血液&组织试剂盒(qiagen,hilden,germany)，从外周血提取基因组dna。使用qubit dna分析试剂盒和qubit 3.0荧光计，测量提取的dna的质量和数量。来自样
本的》0.6μg总dna用于文库构建。使用agilent sureselect human all exon v6试剂盒，根厂商说明书，有效富集人的全外显子区域dna，产生测序文库。qubit 2.0用于文库的初步扩增，使用ngs3k/caliper检测文库中的插入片段大小(180
–
280bp)。使用qpcr方法准确定量文库浓度(3nm)以确保质量。使用novaseq6000(illumina)，根据文库有效浓度，以150bp双端读长，进行全外显子组测序。数据输出要求为每个样本10gbp。
[0294]
测序结果的处理和分析
[0295]
原始测序数据通过bioinformatics获得。过滤原始数据，检查测序错误率，评价phred值q20和q30的比例、原始数据量、和映射率，以评估数据是否达到标准(q20碱基的平均比例》90％,q30碱基的平均比例》80％，平均错误率《0.1％)。来自所有样本的数据质量总结在图3中。经过清理的数据通过burrows-wheeler alignment(bwa)，比对到参考基因组(grch37/hg19)上，产生bam格式的初始比对结果。使用samtools[li h,durbin r.fast and accurate short read alignment with burrows-wheeler transform.
[0296]
bioinformatics(oxford,england)2009；25:1754-60]进行数据分拣，并执行sambamba markdup(去重)，结果用于计算测序覆盖度和深度。一般，样本的测序读数达到》95％的映射率(mapping rate)，且碱基的测序深度(read_depth)》10x，在此情况下，在该碱基位置检测到的单核苷酸多态性snp更可靠。对来自所有样本的测序结果进行检测，外显子靶区域的覆盖度(coverage_of_target_region)均达到了99％以上，且测序覆盖的靶区域中至少有95％以上具有至少10x的测序深度(fraction_of_target_covered_with_at_least_10x)。
[0297]
基因变异筛查和与疾病治疗反应性的相关性预测
[0298]
基因变异筛查
[0299]
将以上获得的高质量序列与人参考基因组(grch37/hg19)进行序列比对，获得样本中的基因变异信息。对检出的变异基因进行统计学分析和kegg和go注释。
[0300]
基于如下原则，对检出的变异进行筛选：
[0301]
1)变异后果是frameshift(移码突变)、stop-gain(终止密码子获得性突变)、和stop-loss(终止密码子丢失性突变)；
[0302]
2)也保留通过sift和polyphen-2软件预测为有害的错义突变[kumar p,henikoff s,ng pc.predicting the effects of coding non-synonymous variants on protein function using the sift algorithm.nature protocols2009；4:1073-81.]；
[0303]
3)基于gnomad数据库，等位基因频率《0.01。
[0304]
功能富集分析
[0305]
使用david生物信息学资源[huang da w,sherman bt,lempicki ra.bioinformatics enrichment tools:paths toward the comprehensive functional analysis of large gene lists.nucleic acids research 2009；37:1-13]，对根据以上原则筛选出的基因，进行功能富集分析。
[0306]
使用kegg(kyoto encyclopedia of genes and genomes)通路和gene ontology(go)的生物学过程(bp)、分子功能(mf)及细胞组分(cc)terms，调查了检出基因的功能。应用改良的fisher精确检验以及benjamini多重检验校正，获得统计学显著性(p值)。
[0307]
结果：
[0308]
在入组本研究的10名随机选择的治疗反应性病例组rif患者和10名随机选择的对照组rif患者中，均检测到具有潜在有害突变的多数个基因。
[0309]
对病例组和对照组中的所选变异基因分别进行功能富集分析。图4显示了病例组通路分析富集结果。图5显示了对照组通路分析富集结果。如图中结果所示，病例组中的基因在如下3个通路上形成显著的富集：ecm-受体相关作用通路；pi3k-akt信号传导通路；和focal adhesion通路；与之形成鲜明对比的是，这些通路无一出现在对照组的显著富集通路列表中。
[0310]
在病例组中检出的与上述三个主要富集通路相关的27个基因如下表6所示，其中17个基因与细胞外基因通路相关，并且10个基因根据kegg/go同时注释到三个通路上。各基因与通路的相关性也显示在图6中。
[0311]
表6：病例组中检出的与ecm-受体相互作用通路；pi3k-akt信号传导通路；和focal adhesion通路相关的27个基因
[0312][0313][0314]
在上述这些基因中检测到的变异主要是错义突变，这些突变改变蛋白质的特定氨基酸，但不导致蛋白失活，不属于功能丧失性突变，例如移码突变、终止密码子获得性/丢失性突变。这些发现与本研究中观察到的垂体亚临床表型相吻合。
[0315]
检查与三通路相关的上述27个基因在病例组和对照组样本中的分布。结果如图7所示，27个相关基因中，除了3个基因(col13a1,col24a1he lamc2)不仅出现在病例组样本中也出现在4个对照样本(wj02/yhf09，ty08，lmy06)中外，其余基因均仅在病例组样本中出现。该分析结果与之前的病例组和对照组的通路富集分析结果相吻合。对于出现三通路相关基因的4个对照样本，考虑到入组的对照患者个体盲选自之前未经lh激素水平检测和hcg补充治疗的rif患者群体，因此，由三通路相关基因在这些个体中的出现，可能预示了这些rif个体将在hcg补充黄体支持治疗中产生有益的临床反应性。
[0316]
此外，也检查了上述27个三通路相关基因在各病例样本中的分布。结果如图8所示，除1个病例样本外，其它所有病例组样本都显示了至少一个通路相关基因上的变异，其中7个病例个体均涉及与细胞外基质相关的ecm-receptor interaction/extracellular matrix organization通路分子,而另2个病例个体涉及pi3k和/或focal adhension途径分子。
[0317]
综合上述的结果说明，通过病例-对照研究在功能富集分析中获得的三个通路，ecm-受体相互作用通路；pi3k-akt信号传导通路；和focal adhesion通路，和27个通路基因，参与了亚临床rif病例患者对于hcg补充的反应性。可以预测在这些通路上存在的错义
基因变异，尤其是在ecm-受体相互作用通路上存在错义基因变异的rif患者个体，将可能对本发明的hcg补充黄体治疗产生有益的临床反应性，例如，在临床妊娠/活产率方面得以改善。因此，对于具有此类基因变异的rif患者，进行黄体期规律激素检查和hcg补充，将是有利的。
[0318]
基于以上的基因水平研究和临床研究的发现，本发明人提出了一个新的rif疾病亚型，即，“亚临床垂体功能减退性”反复植入失败。该疾病亚型的特征在于，具有特征性的生物通路相关基因变异，和低水平(≤5iu/l)的黄体期d2血清促黄体生成素lh水平；并对hcg补充在妊娠率和/或活产率方面表现出有利的治疗反应性。也基于以上的基因水平研究和临床研究的发现，本发明人提出了本发明的技术方案。
[0319]
本发明的一些实施方案
[0320]
1.一种用于将受试者诊断或分类为亚临床垂体功能减退性反复植入失败疾病亚型的方法，所述方法包括在得自所述受试者的生物样品中检测受试者的基因变异信息，其中，如果受试者表现出在选自以下的至少一个或多个kegg生物学通路或go生物学过程中具有一个或多个通路相关基因(优选地至少2个，3个，且更优选地至少4个或5个基因)的变异，则将所述受试者诊断或分类为亚临床垂体功能减退性反复植入失败：
[0321]-kegg_pathway：细胞外基质-受体相互作用通路(hsa04512)；
[0322]-go_bp_direct:细胞外基质组织(go:0030198)；
[0323]-kegg_pathway:pi3k-akt信号传导通路(hsa04511)；
[0324]-kegg_pathway:focal adhesion(hsa04510)。
[0325]
2.实施方案1的方法，其中所述方法包括：在来自受试者的生物学样本中检测一个或多数个通路相关基因的信息，其中所述通路相关基因选自：根据kegg和go注释在以下至少一个或多个生物学通路或生物学过程上的基因：
[0326]-kegg_pathway：细胞外基质-受体相互作用通路(hsa04512)；
[0327]-go_bp_direct:细胞外基质组织(go:0030198)；
[0328]-kegg_pathway:pi3k-akt信号传导通路(hsa04511)；
[0329]-kegg_pathway:focal adhesion(hsa04510)，
[0330]
其中，如果所述信息指示所述通路相关基因中的一个或多个(优选两个、3个，更优选地至少4个或5个)发生变异，则受试者诊断或分类为所述的疾病亚型，
[0331]
优选地，所述发生变异的通路相关基因中至少有一个(优选至少两个或3个)根据kegg和go注释在选自以下的kegg生物学通路或go生物学过程上：
[0332]-kegg_pathway：细胞外基质-受体相互作用通路；
[0333]-go_bp_direct:细胞外基质组织；
[0334]
且更优选地，所述的至少一个基因根据kegg和go被注释在kegg_通路细胞外基质-受体相互作用通路和/或go_bp_direct细胞外基质组织上、且注释在kegg_通路pi3k-akt信号传导通路和foc al adhesion上。
[0335]
3.根据实施方案2的方法，其中，在来自受试者的生物学样本中检测选自以下的通路相关基因之一或其任意组合：lama5，lama2,itgb4,itga11,spp1,tnc,itga9,col24a,col6a6，col18a,col13a1,nid2,acan,cdh1,ercc2,col9a3,phlpp2,ifna4,crtc2,csf3r,csf1,gys1,creb3l4,lpar6,shc4,和myl12a；其中，当在受试者的生物样本中检测到指示所
述一个或多个通路相关基因(优选地至少2个或3个，且更优选地至少4个或5个基因)存在基因变异的信息时，则将所述受试者诊断或分类为所述的疾病亚型。
[0336]
4.根据实施方案3的方法，其中，诊断为所述疾病亚型的受试者至少在选自以下的至少一个基因上具有变异：lama5，lama2,itgb4,itga11,spp1,tnc,itga9,col24a,col6a6，col18a,co l13a1,nid2,acan,cdh1,ercc2,col9a3。
[0337]
5.根据前述实施方案之任一项的方法，其中与参照相比，受试者表现出在所述的kegg生物学通路或go生物学过程中的变异基因富集，优选地所述富集表现为受试者比参照在所述生物学通路或生物学过程上具有更多个的通路相关基因发生变异，优选地，比参照多至少2个、3个或4个的通路相关基因发生变异。
[0338]
6.根据前述实施方案之任一的方法，其中所述受试者无明确的反复植入失败原因且无明显的垂体器质性病变，但表现出轻微的垂体功能减退症状。
[0339]
7.根据前述实施方案之任一的方法，其中所述受试者具有小于或等于5iu/l的黄体期d2日血清lh水平，更优选小于3iu/l,2iu/l,或1iu/l。
[0340]
8.一种用于预测反复植入失败(rif)受试者是否适宜用黄体支持治疗剂进行治疗、或用于预测反复植入失败(rif)受试者对黄体支持的治疗反应性的方法，其中所述黄体支持包括在子宫内膜转化日后，优选在胚胎植入后，施用黄体生成活性相关药物，例如lh和/或hcg，优选地hcg，
[0341]
其中所述方法包括：在得自所述受试者的生物样品中检测受试者的基因变异信息，其中，如果受试者表现出在选自以下的至少一个或多个kegg生物学通路或go生物学过程中具有一个或多个通路相关基因(优选地至少2个，3个，且更优选地至少4个或5个基因)的变异，则指示所述受试者适宜用所述黄体支持治疗剂，或可能对所述黄体支持治疗剂产生治疗反应：
[0342]-kegg_pathway：细胞外基质-受体相互作用通路(hsa04512)；
[0343]-go_bp_direct:细胞外基质组织(go:0030198)；
[0344]-kegg_pathway:pi3k-akt信号传导通路(hsa04511)；
[0345]-kegg_pathway:focal adhesion(hsa04510)。
[0346]
9.根据实施方案8的方法，其中所述方法包括：在来自受试者的生物学样本中检测一个或多数个通路相关基因的信息，其中所述通路相关基因选自：根据kegg和go注释在以下至少一个或多个生物学通路或生物学过程上的基因：
[0347]-kegg_pathway：细胞外基质-受体相互作用通路(hsa04512)；
[0348]-go_bp_direct:细胞外基质组织(go:0030198)；
[0349]-kegg_pathway:pi3k-akt信号传导通路(hsa04511)；
[0350]-kegg_pathway:focal adhesion(hsa04510)，
[0351]
其中，如果所述信息指示所述通路相关基因中的一个或多个(优选两个、3个，更优选地至少4个或5个)发生变异，则预测所述受试者适宜用所述黄体支持治疗剂，或可能对所述黄体支持治疗剂产生治疗反应，
[0352]
优选地，所述发生变异的通路相关基因中至少有一个(优选至少两个或3个)根据kegg和go注释在选自以下的kegg生物学通路或go生物学过程上：
[0353]-kegg_pathway：细胞外基质-受体相互作用通路；
[0354]-go_bp_direct:细胞外基质组织；
[0355]
且更优选地，所述至少一个基因根据kegg和go被注释在kegg_通路细胞外基质-受体相互作用通路和/或go_bp_direct细胞外基质组织上、且注释在kegg_通路pi3k-akt信号传导通路和foc al adhesion上。
[0356]
10.根据实施方案9的方法，其中，在来自受试者的生物学样本中检测选自以下的通路相关基因之一或其任意组合：lama5，lama2,itgb4,itga11,spp1,tnc,itga9,col24a,col6a6，col18a,col13a1,nid2,acan,cdh1,ercc2,col9a3,phlpp2,ifna4,crtc2,csf3r,csf1,gys1,creb3l4,lpar6,shc4,和myl12a；其中，当在受试者的生物样本中检测到指示所述一个或多个通路相关基因(优选地至少2个或3个，且更优选地至少4个或5个基因)存在基因变异的信息时，则预测所述受试者适宜用所述黄体支持治疗剂，或可能对所述黄体支持治疗剂产生治疗反应。
[0357]
11.根据实施方案10的方法，其中，经预测适宜接受所述治疗或可能对所述治疗产生治疗反应的受试者至少在选自以下的至少一个基因上具有变异：lama5，lama2,itgb4,itga11,spp1,tnc,itg a9,col24a,col6a6，col18a,col13a1,nid2,acan,cdh1,ercc2,col9a3。
[0358]
12.根据前述实施方案8-11之任一项的方法，其中，如果与参照相比，受试者表现出在所述的keg g生物学通路或go生物学过程中的变异基因富集，优选地所述富集表现为受试者比参照在所述生物学通路或生物学过程上具有更多个的通路相关基因发生变异，优选地，比参照多至少1个、至少2个、3个或4个的通路相关基因发生变异，则预测所述受试者适宜用所述黄体支持治疗剂，或可能对所述黄体支持治疗剂产生治疗反应。
[0359]
13.根据前述实施方案8-12之任一的方法，其中所述受试者无明确的反复植入失败原因且无明显的垂体器质性病变，但表现出轻微的垂体功能减退症状。
[0360]
14.根据前述实施方案8-13之任一的方法，其中所述方法还包括检测受试者的黄体期d2日血清lh水平，优选地，所述受试者具有小于5iu/l的d2血清lh水平，更优选小于3iu/l,2iu/l,或1iu/l的d2血清lh水平。
[0361]
15.根据前述实施方案之任一的方法，其中基因变异为错义突变，优选地，所述变异不导致基因失活，但影响基因编码的蛋白质的生物学活性，优选地，所述突变在正常健康人群中的等位基因频率《0.01。
[0362]
16.根据前述实施方案之任一的方法，其中所述生物样品选自血液、血清、及其他体液或活检组织。
[0363]
17.根据前述实施方案之任一的方法，其中所述基因变异信息使用pcr法或微阵列芯片进行测量。
[0364]
18.根据前述实施方案之任一的方法，其中所述基因变异信息使用测序方法，优选地外显子测序方法获得。
[0365]
19.根据前述实施方案之任一的方法，其中所述基因变异信息通过检测所述基因编码的蛋白的生物学活性获得，优选地，所述生物学活性为降低的生物学活性。
[0366]
20.根据前述实施方案之任一的方法，其中所述测量包含使用免疫测定，例如elisa测定，检测由变异基因编码的突变蛋白。
[0367]
21.根据前述实施方案8-20之任一的方法，其中所述黄体支持治疗包括：在胚胎植
入后施用hcg，更优选地，肌注hcg，优选地所述黄体支持治疗还包括补充孕酮和/或雌二醇药物，且任选地根据患者的孕激素和/或雌激素水平，调节所述药物的给药量；
[0368]
优选地，hcg以剂量100-800iu或200-500iu施用，
[0369]
更优选地自移植后隔日开始，患者每日肌内注射500iu hcg。
[0370]
22.一种向反复植入失败患者提供黄体支持治疗的方法，所述方法包括，在子宫内膜转化日后，优选地在胚胎植入后，给所述患者施用有效量的黄体生成活性相关药物，例如hcg和/或lh，优选hcg，
[0371]
其中所述患者表现出在选自以下的至少一个或多个kegg生物学通路或go生物学过程中具有一个或多个通路相关基因(优选地至少2个，3个，且更优选地至少4个或5个基因)的变异：
[0372]-kegg_pathway：细胞外基质-受体相互作用通路(hsa04512)；
[0373]-go_bp_direct:细胞外基质组织(go:0030198)；
[0374]-kegg_pathway:pi3k-akt信号传导通路(hsa04511)；
[0375]-kegg_pathway:focal adhesion(hsa04510)；
[0376]
优选地，所述受试者至少在选自以下的至少一个或多个kegg生物学通路或go生物学过程中的一个或多个基因上具有变异：
[0377]-kegg_pathway：细胞外基质-受体相互作用通路；
[0378]-go_bp_direct:细胞外基质组织；
[0379]
更优选地，所述受试者至少在一个或多个如下基因上具有变异，所述基因根据kegg和go注释到kegg_pathway细胞外基质-受体相互作用通路和/或go_bp_direct细胞外基质组织上、且注释到pi3k-akt信号传导通路和focal adhesion上。
[0380]
23.根据实施方案22的方法，其中所述患者在以下的通路相关基因之一或其组合上具有基因变异：lama5，lama2,itgb4,itga11,spp1,tnc,itga9,col24a,col6a6，col18a,col13a1,nid2,acan,cdh1,ercc2,col9a3,phlpp2,ifna4,crtc2,csf3r,csf1,gys1,creb3l4,lpar6,shc4,和myl12a；
[0381]
优选地，所述患者在包含至少2个、至少3个，或更优选至少4个或5个通路基因的基因组合上具有基因变异，更优选地，所述基因组合至少包含选自以下的至少一个基因：lama5，lama2,itgb4,itga11,spp1,tnc,itga9,col24a,col6a6，col18a,col13a1,nid2,acan,cdh1,ercc2,col9a3。
[0382]
24.根据实施方案22-23之任一的方法，其中所述患者的黄体期d2血清水平≤5iu/l，例如，小于4iu/l，或3iu/l，或2iu/l，或小于1iu/l。
[0383]
25.根据实施方案22-24之任一的方法，其中所述基因变异为错义突变，优选地，所述变异不导致基因失活，但影响基因编码的蛋白质的生物学活性，优选地，所述突变在正常健康人群中的等位基因频率《0.01。
[0384]
26.根据实施方案22-25之任一的方法，其中所述方法用于改善所述rif患者的临床妊娠和/或娩出活产胎儿的可能性。
[0385]
27.根据实施方案22-26之任一的方法，其中所述方法包括：在胚胎植入后施用hcg，更优选地，肌注hcg，优选地所述黄体支持治疗还包括补充孕酮和/或雌二醇药物，且任选地根据患者的孕激素和/或雌激素水平，调节所述药物的给药量；
[0386]
优选地，hcg以剂量100-800iu或200-500iu施用，
[0387]
更优选地自移植后隔日开始，患者每日肌内注射500iu hcg。
[0388]
28.根据实施方案22-27之任一的方法，其中胚胎移植为冻融周期移植或新鲜周期移植，优选冻融周期移植，
[0389]
优选地，患者在自然周期排卵后或在应用促排卵方案后或在人工周期后行胚胎移植，尤其是实施冻融胚胎移植。
[0390]
29.根据实施方案22-28之任一的方法，其中所述方法包括在植入前以及在胚胎植入周期中，监测患者的激素水平，包括lh，p，e2和hcg水平。
[0391]
30.用于诊断或分类rif患者或用于预测rif患者对补充黄体生成活性相关药物的黄体支持的治疗反应性的组合物，其中所述组合物包含用于检测生物标志物组的信息的试剂或试剂组合，
[0392]
其中所述生物标志物组由多数个通路相关基因组成，其中所述通路相关基因选自：根据kegg和go注释在以下至少一个或多个生物学通路或生物学过程上的基因：
[0393]-kegg_pathway：细胞外基质-受体相互作用通路(hsa04512)；
[0394]-go_bp_direct:细胞外基质组织(go:0030198)；
[0395]-kegg_pathway:pi3k-akt信号传导通路(hsa04511)；
[0396]-kegg_pathway:focal adhesion(hsa04510)，
[0397]
例如，所述生物标志物组由lama5，lama2,itgb4,itga11,spp1,tnc,itga9,col24a,col6a6，col18a,col13a1,nid2,acan,cdh1,ercc2,col9a3,phlpp2,ifna4,crtc2,csf3r,csf1,gys1,creb3l4,lpar6,shc4,和myl12a中的至少2个、至少5个、至少10个、至少15个、或全部通路相关基因组成，
[0398]
优选地，所述检测提供所述通路相关基因，例如实施方案8-11中所描述的通路相关基因，的变异信息，所述变异优选为错义突变，
[0399]
优选地，所述试剂为用于检测所述基因变异的多核苷酸、和/或用于检测由所述基因变异编码的突变蛋白的量和/或活性的试剂(例如抗体)。
[0400]
31.实施方案30的组合物，其中所述组合物以微阵列芯片的形式存在，包含用于提供所述生物标志物组的信息的多核苷酸试剂或试剂组合，优选地，所述多核苷酸试剂为与所述通路基因的错义突变位点(例如snp)杂交的多核苷酸。
[0401]
32.试剂盒，其中所述试剂盒包含实施方案30或31的组合物。
[0402]
33.实施方案30的组合物、实施方案31的微阵列芯片，或实施方案32的试剂盒在制备用于诊断或分类rif患者、或用于预测rif患者对补充黄体生成活性相关药物的黄体支持的治疗反应性的产品中的用途。