一种金福菇的杂交育种方法与流程

1.本发明属于食用真菌杂交技术领域，尤其涉及一种金福菇的杂交育种方法。


背景技术：

2.目前，金福菇子实体丛生或族生，形大，菌肉白色或乳白色，菌盖平展光滑、呈半球形，菌柄上小下大、呈长棒状。是珍稀的食用菌新品种。在我国南方及台湾省均有小面积栽培。
3.金福菇营养丰富，据分析每100克干品中含有蛋白质27.56％，粗脂肪9.58％，总糖38.44％，粗纤维8.20％，其子实体肥厚脆嫩，味微甜而鲜美，耐贮性好，适于鲜销与干制加工，深受市场青睬。
4.然而，现有技术并没有针对金福菇进行杂交育种的方法。
5.通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：现有技术主要是我国科研人员于1998年通过台湾菌株和分离野生菌株杂交选育，筛选出生产性状和经济性状均优于台湾菌株的新宇tg-1，该菌株虽具有一定的优良性状，但是引进到海南省试种发现出菇并不理想，出菇慢、出菇的次数少，产量较低。可见，现有栽培品种并不太适合在海南种植，要想达到高产的目标，还需另外杂交选育适合海南本土种植的优良品种。
6.解决以上问题及缺陷的难度为：不同亲本杂交选育工作量大，要杂交出上百甚至上千个子一代，才能从众多的子一代中筛选出性状表现优良的菌株，另外，如果选的亲本没有某一突出的性状表现，也很难杂交出适合海南本土种植且达到高产的子一代菌株。
7.解决以上问题及缺陷的意义为：本发明通过野生金福菇和栽培种杂交选育出适合海南本土种植的优良菌株，解决了现有的杂交选育品种在海南种植性状表现不良、产量低的问题，有利于调节海南鲜菇市场或本土菇房实施常年栽培的品种搭配；同时，优良的菌株，能提高金福菇的产量，为生产者创造出更高的经济效益，助力海南乡村经济发展，为海南自由贸易港添砖加瓦。


技术实现要素：

8.针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种金福菇的杂交育种方法。
9.本发明是这样实现的，一种金福菇的杂交育种方法，所述金福菇的杂交育种方法包括：
10.通过搜集野生和栽培种的优异遗传资源，得到相对性状差异较大且种质基因丰富的杂交亲本，通过单菌孢杂交获得新的菌株，选育优良的金福菇杂交子一代。
11.进一步，所述金福菇的杂交育种方法还包括：
12.通过采集野生种或引进栽培种金福菇，栽培成熟后获得孢子，并对孢子稀释分离获得单核菌丝体进行配对杂交，得到子一代；
13.通过拮抗试验和垂直平板聚丙烯酰胺凝胶电泳方法鉴定杂交子一代菌株是否不同且优于亲本菌株；同时测定杂交子一代与亲本母种和栽培阶段的菌丝体生长速率，比较
不同菌株的早熟性状，对不同菌株做耐高温初筛选，同时比较不同菌株对绿霉的抗性；
14.栽培出菇，测定不同菌株的产量，比较不同子实体的生物学特性，筛选得到优良杂交子一代品种。
15.进一步，所述金福菇的杂交育种方法包括以下步骤：
16.步骤一，通过选择种菇、进行菇体的表面消毒、收集并分离孢子、鉴定单核菌丝进行单核体的分离和鉴定，得到单核菌丝；
17.步骤二，将得到的单核菌丝进行配对杂交；对杂交得到的菌株进行鉴定，并测定菌丝生长速率；
18.步骤三，比较不同菌株早熟性状，进行耐高温菌株的初筛选；并进行不同菌株对绿霉抗性的比较、不同菌株的产量比较、子实体农艺性状的比较，筛选得到优良杂交子一代品种。
19.进一步，步骤一中，所述通过选择种菇、进行菇体的表面消毒、收集并分离孢子、鉴定单核菌丝进行单核体的分离和鉴定包括：
20.(1)选择具备亲本典型优良性状的种菇，并于种菇八成熟时，采摘备用；在采摘的种菇菇体表面利用75％酒精进行揩擦消毒，并用无菌水冲洗后用无菌纱布吸干菇体表面水分；
21.(2)将设置有支架且支架下方设置有培养皿的孢子采集装置进行灭菌干燥，将吸干水分的种菇插入孢子采集装置的支架上；
22.(3)采用连续稀释法进行孢子分离，吸取一定量的连续稀释后的孢子液注入平板培养基，将分离的孢子固定培养形成单孢菌落；
23.(4)当菌落长到2cm时，挑取边缘菌丝置载玻片上，用显微镜观察，若无锁状联合结构，则判断为孢子萌发而生成的单核菌丝，将所述单核菌丝转接到斜面培养基上，25℃恒温培养。
24.进一步，步骤(3)中，所述采用连续稀释法进行孢子分离，吸取一定量的连续稀释后的孢子液注入平板培养基，将分离的孢子固定培养形成单孢菌落包括：于无菌条件下在含有一定量孢子的三角瓶中，注入10m l无菌水并摇匀，再从中吸取1m l孢子液，加入9m l无菌水中；反复稀释，一直到稀释液中孢子浓度约为106个/m l，吸取最终稀释的孢子液0.5m l，用玻棒均匀涂于平板培养基上，25℃恒温培养。
25.进一步，步骤二中，所述将得到的单核菌丝进行配对杂交包括：
26.将两个不同亲本的单核菌丝同时接种于平板培养基上，保持两个单核菌丝相距1.0～1.5cm，培养12d左右，待两菌丝接触后，挑取交界处的部分菌丝用碱性甲基蓝染色后进行镜检，若发现锁状联合，则将其转接于新的斜面培养基上，于25℃下培养7～10d左右，选择菌丝生长旺盛、菌落形态均匀的菌株，从选择的菌株中挑取少许菌丝放置于显微镜下观察，鉴定确为双核菌丝后，进行pda斜面试管扩大培养，待菌丝满管后，选择优良的异核菌丝体，放入冰箱内保藏。
27.进一步，所述对杂交得到的菌株进行鉴定包括：
28.1)拮抗试验：在平板培养基的中间接种单孢杂交菌丝，两端分别接种亲本的菌丝，当且仅当培养基上同时出现两条拮抗线，则判断杂交成功，产生新的菌株；
29.2)液体培养基出菇试验：将所有的杂交组合分别接种到含30ml液体培养基的
100ml的三角瓶中，每个组合3次重复；25℃恒温培养，待菌丝长满液面时进行低温刺激培养，记录菇蕾产生情况，淘汰不具有结实能力的杂交组合；
30.3)杂交亲本及杂交子一代的酯酶同工酶电泳分析：将杂交子一代与2个杂交亲本菌株一起进行酯酶同工酶电泳，根据酯酶同工酶酶谱，比较子一代与亲本的差异，进一步鉴定金福菇杂交种，并初步预测杂交子一代杂种优势的强弱。
31.进一步，所述杂交亲本及杂交子一代的酯酶同工酶电泳分析包括以下步骤：
32.3.1)将菌龄相同，接种块大小相同的菌种接入液体培养基，在25℃条件下培养7d，取不同菌株的菌丝体，去除培养基用滤纸吸干后，称重0.5g于小研钵中，在冰箱中冰冻12h后，加入0.5ml稀释4倍的浓缩胶缓冲液研成匀浆，于5℃、6000r/m下离心30min，取上清液置冰箱内保存；
33.3.2)采用垂直平板聚丙烯酰胺凝胶电泳方法，溴酚蓝指示剂在浓度为3.75％的浓缩胶中时电流控制在20ma，待溴酚蓝进入浓度为7.5％分离胶后，加大电流至30ma，当溴酚蓝即胶板底部1cm时，停止电泳；所述电泳点样量20μl，电泳槽缓冲液为tris-甘氨酸，稳定电压180v；
34.3.3)用一支带长针头的注射器吸取蒸馏水，将针头紧靠玻璃内壁，插于凝胶与玻璃板壁之间，轻轻推动注射器，同时转动玻璃板，并使针头在管壁与凝胶间前进，使凝胶与管壁分离；
35.3.4)称取100mg坚牢兰，溶于150ml的0.1mol/l磷酸缓冲液，过滤待用；称取50mgα-乙酸萘酯，50mgβ-乙酸萘酯溶于3m l丙酮中，逐渐倒入上述溶液中，边加边搅拌均匀即可得到酯酶显色液，将脱出的胶条放入磷酸缓冲液配置的酯酶显色液中于25℃下显色，待看到桃红色或褐色酯酶同工酶区带时，用5％醋酸固定并可于4℃下保存。
36.进一步，步骤二中，所述测定菌丝生长速率包括：
37.母种阶段菌丝生长速率的测定：将筛选后的杂交组合分别接种于含20ml pda综合培养基直径为9cm的培养皿中，每皿接入直径为8mm、厚0.1mm的活化菌丝圆片，置于25℃恒温培养箱中培养，每个处理3个重复；当有一处理长满培养皿时，结束培养，记录菌丝生长天数和菌落半径，利用下式计算菌丝生长速度，观察菌丝形态及长势，结果进行显著性测验：菌丝生长速度(mm/d)＝菌落半径(mm)/生长天数(d)；
38.栽培种阶段菌丝生长速度的测定：栽培种采用22
×
35cm聚丙烯袋，每袋500g干料，高压灭菌2h，冷却室温时接种，接种量4％，每个品种接10袋，在25℃恒温培养箱中黑暗培养，利用下式计算菌丝生长速度，并记录计算的菌丝生长速度，观察菌丝形态及其长势，结果进行显著性测验：菌丝生长速度(mm/d)＝培养料的长度(mm)/满袋天数(d)。
39.进一步，步骤三中，所述比较不同菌株早熟性状，进行耐高温菌株的初筛选；并进行不同菌株对绿霉抗性的比较、不同菌株的产量比较、子实体农艺性状的比较包括：
40.(1)比较不同菌株早熟性状：
41.以22
×
35cm聚丙烯袋栽培袋，每袋500g干料，接种量10％，每个菌株接10袋，设3个重复，在25℃恒温培养，待菌丝长满菌袋后移入菇房，停止喷水降湿，控制空气湿度在85～90％，温度20～25℃，同时加强通风换气，增加光照，促进原基扭结形成子实体原基形成后控制湿度85％左右，温度25～30℃，气温超过30℃时采用加厚遮阳物、畦沟灌水、棚顶喷水、空间喷雾或其他方式降温；原基和幼菇生长期干燥时喷雾状水，子实体生长期一般每天喷
水1～2次，子实体进人成熟期停止喷水；记录菌丝长满菌袋的时间，、原基期即从接种到出现原基、菇峰期即从接种到出菇高峰；
42.(2)耐高温菌株的初筛选：根据金福菇丝生长的温度范围，分别将筛选后的杂交子一代菌株及亲本菌株接种到pda平板培养基上，设置3次重复，测量菌丝在25℃、30℃、35℃和40℃下培养5～7d的生长长度，并利用下式计算菌丝生长速度，进行金福菇耐高温菌株的初筛选：菌丝生长速度(mm/d)＝菌丝生长长度(mm)/菌丝生长天数(d)；
43.(3)不同菌株对绿霉抗性的比较：分别将筛选后的杂交组合接种到pda平板培养基上，2d后接入绿霉菌株，与菌种块之间相距2.5cm，每个处理设置3个重复，在25℃条件下培养7d，观察记录不同菌株与绿霉拮抗情况，测量拮抗线宽度；
44.以22
×
35cm聚丙烯袋栽培袋装入金福菇最适的栽培培养基，每袋500g干料，接种量10％，每个菌株接10袋，设3个重复，在25℃下容易发生杂菌的环境中培养，记录绿霉发生率；菌丝长满菌袋后移入菇房，停止喷水降湿，促使其由营养生长进人生殖生长，控制空气湿度控制在85～90％，温度20～25℃，同时加强通风换气，增加光照，促进原基扭结形成子实体原基形成后控制湿度85％左右，温度25～30℃，气温超过30℃时采用加厚遮阳物、畦沟灌水、棚顶喷水、空间喷雾或其他方式降温；原基和幼菇生长期仅在干燥时喷雾状水，子实体生长期一般每天喷水1～2次，子实体进入成熟期停止喷水，出完第一潮菇后记录绿霉发生率；
45.(4)不同菌株的产量比较：将菌株接入金福菇栽培料中，在25℃恒温培养，待菌丝长满后移入菇房，控制空气湿度在85～90％，温度20～25℃，同时加强通风换气，增加光照，促进原基扭结形成子实体原基形成后控制湿度85％左右，温度25～30℃，气温超过30℃时采用加厚遮阳物、畦沟灌水、棚顶喷水、空间喷雾或其他方式降温；原基和幼菇生长期仅在干燥时喷雾状水，子实体生长期一般每天喷水1～2次，子实体进入成熟期停止喷水；出菇时测定各菌株的子实体产量，利用下式计算其生物学效率，并作显著性测验，淘汰产量过低的菌株：生物学效率(％)＝子实体鲜品产量(g)/培养料干重(g)
×
100；
46.(5)子实体农艺性状的比较：以22
×
35cm规格的聚丙烯袋装入稻草谷壳栽培培养基，每袋500g干料，高压灭菌2h或者常压高温灭菌24小时，冷却后分别接入供试菌株，每个菌株接20袋，设2个重复，在25℃恒温培养箱中培养，待菌丝长满菌袋后移入出菇房，立放在出菇床架上出菇，停止喷水降湿，促使其由营养生长进人生殖生长，控制空气湿度在85～90％，温度20～25℃，同时加强通风换气，增加光照，促进原基扭结形成子实体原基形成后控制湿度85％左右，温度25～30℃，气温超过30℃时采用加厚遮阳物、畦沟灌水、棚顶喷水、空间喷雾或其他方式降温；原基和幼菇生长期仅在干燥时喷雾状水，子实体生长期一般每天喷水1～2次，子实体进入成熟期停止喷水；出菇后观察并记录菇体形态、颜色、菇柄长度和粗度及菇盖的直径和厚度。
47.结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：本发明通过引进和采集不同栽培种或野生的金福菇，野生种和栽培种的亲缘关系、生态类型和生理特性差异较大，相对性状的优缺点能彼此互补，杂种优势可能表现较强。栽培成熟后获得孢子，并对孢子稀释分离以获得单核菌丝体进行配对杂交以获得子一代，并对其做拮抗和出菇试验鉴定，测定杂交组合母种和栽培阶段的菌丝体生长速率，比较不同菌株的早熟性状，对不同菌株做耐高温初筛选，同时比较不同菌株对绿霉的抗性，然后栽培出菇，测定不同菌株的产
量，比较不同子实体的生物学特性，筛选得到最适合海南气候的优良品种，示范种植。同时获得相关栽培种植的技术参数，并制定技术规范规程。通过对不同杂交子一代的比较，寻找适合海南本土营养价值高的金福菇杂交品种，为菇农创收致富，为海南等热带地区金福菇种植业发展提供科学依据。
48.本发明提出了金福菇的杂交育种研究，搜集野生和栽培种的优异遗传资源，得到相对性状差异较大，种质基因丰富的杂交亲本，通过单菌孢杂交获得新的菌株，选出优良的金福菇杂交子一代品种。
附图说明
49.图1是本发明实施例提供的金福菇的杂交育种方法原理图。
50.图2是本发明实施例提供的金福菇的杂交育种方法流程图。
具体实施方式
51.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
52.针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种金福菇的杂交育种方法，下面结合附图对本发明作详细的描述。
53.如图1所示，本发明实施例提供的金福菇的杂交育种方法包括：
54.通过搜集野生和栽培种的优异遗传资源，得到相对性状差异较大且种质基因丰富的杂交亲本，通过单菌孢杂交获得新的菌株，选育优良的金福菇杂交子一代。
55.本发明实施例提供的金福菇的杂交育种方法还包括：
56.通过采集野生种或引进栽培种金福菇，栽培成熟后获得孢子，并对孢子稀释分离获得单核菌丝体进行配对杂交，得到子一代；
57.通过拮抗试验和垂直平板聚丙烯酰胺凝胶电泳方法鉴定杂交子一代菌株是否不同且优于亲本菌株；同时测定杂交子一代与亲本母种和栽培阶段的菌丝体生长速率，比较不同菌株的早熟性状，对不同菌株做耐高温初筛选，同时比较不同菌株对绿霉的抗性；
58.栽培出菇，测定不同菌株的产量，比较不同子实体的生物学特性，筛选得到优良杂交子一代品种。
59.如图2所示，本发明实施例提供的金福菇的杂交育种方法包括以下步骤：
60.s101，通过选择种菇、进行菇体的表面消毒、收集并分离孢子、鉴定单核菌丝进行单核体的分离和鉴定，得到单核菌丝；
61.s102，将得到的单核菌丝进行配对杂交；对杂交得到的菌株进行鉴定，并测定菌丝生长速率；
62.s103，比较不同菌株早熟性状，进行耐高温菌株的初筛选；并进行不同菌株对绿霉抗性的比较、不同菌株的产量比较、子实体农艺性状的比较，筛选得到优良杂交子一代品种。
63.本发明实施例提供的通过选择种菇、进行菇体的表面消毒、收集并分离孢子、鉴定单核菌丝进行单核体的分离和鉴定包括：
64.(1)选择具备亲本典型优良性状的种菇，并于种菇八成熟时，采摘备用；在采摘的种菇菇体表面利用75％酒精进行揩擦消毒，并用无菌水冲洗后用无菌纱布吸干菇体表面水分；
65.(2)将设置有支架且支架下方设置有培养皿的孢子采集装置进行灭菌干燥，将吸干水分的种菇插入孢子采集装置的支架上；
66.(3)采用连续稀释法进行孢子分离，吸取一定量的连续稀释后的孢子液注入平板培养基，将分离的孢子固定培养形成单孢菌落；
67.(4)当菌落长到2cm时，挑取边缘菌丝置载玻片上，用显微镜观察，若无锁状联合结构，则判断为孢子萌发而生成的单核菌丝，将所述单核菌丝转接到斜面培养基上，25℃恒温培养。
68.本发明实施例提供的采用连续稀释法进行孢子分离，吸取一定量的连续稀释后的孢子液注入平板培养基，将分离的孢子固定培养形成单孢菌落包括：于无菌条件下在含有一定量孢子的三角瓶中，注入10m l无菌水并摇匀，再从中吸取1m l孢子液，加入9m l无菌水中；反复稀释，一直到稀释液中孢子浓度约为106个/m l，吸取最终稀释的孢子液0.5m l，用玻棒均匀涂于平板培养基上，25℃恒温培养。
69.本发明实施例提供的将得到的单核菌丝进行配对杂交包括：
70.将两个不同亲本的单核菌丝同时接种于平板培养基上，保持两个单核菌丝相距1.0～1.5cm，培养12d左右，待两菌丝接触后，挑取交界处的部分菌丝用碱性甲基蓝染色后进行镜检，若发现锁状联合，则将其转接于新的斜面培养基上，于25℃下培养7～10d左右，选择菌丝生长旺盛、菌落形态均匀的菌株，从选择的菌株中挑取少许菌丝放置于显微镜下观察，鉴定确为双核菌丝后，进行pda斜面试管扩大培养，待菌丝满管后，选择优良的异核菌丝体，放入冰箱内保藏。
71.本发明实施例提供的对杂交得到的菌株进行鉴定包括：
72.1)拮抗试验：在平板培养基的中间接种单孢杂交菌丝，两端分别接种亲本的菌丝，当且仅当培养基上同时出现两条拮抗线，则判断杂交成功，产生新的菌株；
73.2)液体培养基出菇试验：将所有的杂交组合分别接种到含30ml液体培养基的100ml的三角瓶中，每个组合3次重复；25℃恒温培养，待菌丝长满液面时进行低温刺激培养，记录菇蕾产生情况，淘汰不具有结实能力的杂交组合；
74.3)杂交亲本及杂交子一代的酯酶同工酶电泳分析：将杂交子一代与2个杂交亲本菌株一起进行酯酶同工酶电泳，根据酯酶同工酶酶谱，比较子一代与亲本的差异，进一步鉴定金福菇杂交种，并初步预测杂交子一代杂种优势的强弱。
75.本发明实施例提供的杂交亲本及杂交子一代的酯酶同工酶电泳分析包括以下步骤：
76.3.1)将菌龄相同，接种块大小相同的菌种接入液体培养基，在25℃条件下培养7d，取不同菌株的菌丝体，去除培养基用滤纸吸干后，称重0.5g于小研钵中，在冰箱中冰冻12h后，加入0.5ml稀释4倍的浓缩胶缓冲液研成匀浆，于5℃、6000r/m下离心30min，取上清液置冰箱内保存；
77.3.2)采用垂直平板聚丙烯酰胺凝胶电泳方法，溴酚蓝指示剂在浓度为3.75％的浓缩胶中时电流控制在20ma，待溴酚蓝进入浓度为7.5％分离胶后，加大电流至30ma，当溴酚
蓝即胶板底部1cm时，停止电泳；所述电泳点样量20μl，电泳槽缓冲液为tris-甘氨酸，稳定电压180v；
78.3.3)用一支带长针头的注射器吸取蒸馏水，将针头紧靠玻璃内壁，插于凝胶与玻璃板壁之间，轻轻推动注射器，同时转动玻璃板，并使针头在管壁与凝胶间前进，使凝胶与管壁分离；
79.3.4)将脱出的胶条放入磷酸缓冲液配置的酯酶显色液中于25℃下显色，待看到桃红色或褐色酯酶同工酶区带时，用5％醋酸固定并可于4℃下保存。
80.本发明实施例提供的酯酶显色液配置方法包括：
81.称取100mg坚牢兰，溶于150ml的0.1mol/l磷酸缓冲液，过滤待用；称取50mgα-乙酸萘酯，50mgβ-乙酸萘酯溶于3m l丙酮中，逐渐倒入上述溶液中，边加边搅拌均匀即可得到酯酶显色液。
82.本发明实施例提供的测定菌丝生长速率包括：
83.母种阶段菌丝生长速率的测定：将筛选后的杂交组合分别接种于含20ml pda综合培养基直径为9cm的培养皿中，每皿接入直径为8mm、厚0.1mm的活化菌丝圆片，置于25℃恒温培养箱中培养，每个处理3个重复；当有一处理长满培养皿时，结束培养，记录菌丝生长天数和菌落半径，利用下式计算菌丝生长速度，观察菌丝形态及长势，结果进行显著性测验：菌丝生长速度(mm/d)＝菌落半径(mm)/生长天数(d)；
84.栽培种阶段菌丝生长速度的测定：栽培种采用22
×
35cm聚丙烯袋，每袋500g干料，高压灭菌2h，冷却室温时接种，接种量4％，每个品种接10袋，在25℃恒温培养箱中黑暗培养，利用下式计算菌丝生长速度，并记录计算的菌丝生长速度，观察菌丝形态及其长势，结果进行显著性测验：菌丝生长速度(mm/d)＝培养料的长度(mm)/满袋天数(d)。
85.本发明实施例提供的比较不同菌株早熟性状，进行耐高温菌株的初筛选；并进行不同菌株对绿霉抗性的比较、不同菌株的产量比较、子实体农艺性状的比较，筛选得到优良杂交子一代品种包括：
86.(1)比较不同菌株早熟性状：
87.以22
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35cm聚丙烯袋栽培袋，每袋500g干料，接种量10％，每个菌株接10袋，设3个重复，在25℃恒温培养，待菌丝长满菌袋后移入菇房，停止喷水降湿，控制空气湿度在85～90％，温度20～25℃，同时加强通风换气，增加光照，促进原基扭结形成子实体原基形成后控制湿度85％左右，温度25～30℃，气温超过30℃时采用加厚遮阳物、畦沟灌水、棚顶喷水、空间喷雾或其他方式降温；原基和幼菇生长期干燥时喷雾状水，子实体生长期一般每天喷水1～2次，子实体进人成熟期停止喷水；记录菌丝长满菌袋的时间，、原基期即从接种到出现原基、菇峰期即从接种到出菇高峰；
88.(2)耐高温菌株的初筛选：根据金福菇丝生长的温度范围，分别将筛选后的杂交子一代菌株及亲本菌株接种到pda平板培养基上，设置3次重复，测量菌丝在25℃、30℃、35℃和40℃下培养5～7d的生长长度，并利用下式计算菌丝生长速度，进行金福菇耐高温菌株的初筛选：菌丝生长速度(mm/d)＝菌丝生长长度(mm)/菌丝生长天数(d)；
89.(3)不同菌株对绿霉抗性的比较：分别将筛选后的杂交组合接种到pda平板培养基上，2d后接入绿霉菌株，与菌种块之间相距2.5cm，每个处理设置3个重复，在25℃条件下培养7d，观察记录不同菌株与绿霉拮抗情况，测量拮抗线宽度；
90.以22
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35cm聚丙烯袋栽培袋装入金福菇最适的栽培培养基，每袋500g干料，接种量10％，每个菌株接10袋，设3个重复，在25℃下容易发生杂菌的环境中培养，记录绿霉发生率；菌丝长满菌袋后移入菇房，停止喷水降湿，促使其由营养生长进人生殖生长，控制空气湿度控制在85～90％，温度20～25℃，同时加强通风换气，增加光照，促进原基扭结形成子实体原基形成后控制湿度85％左右，温度25～30℃，气温超过30℃时采用加厚遮阳物、畦沟灌水、棚顶喷水、空间喷雾或其他方式降温；原基和幼菇生长期仅在干燥时喷雾状水，子实体生长期一般每天喷水1～2次，子实体进入成熟期停止喷水，出完第一潮菇后记录绿霉发生率；
91.(4)不同菌株的产量比较：将菌株接入金福菇栽培料中，在25℃恒温培养，待菌丝长满后移入菇房，控制空气湿度在85～90％，温度20～25℃，同时加强通风换气，增加光照，促进原基扭结形成子实体原基形成后控制湿度85％左右，温度25～30℃，气温超过30℃时采用加厚遮阳物、畦沟灌水、棚顶喷水、空间喷雾或其他方式降温；原基和幼菇生长期仅在干燥时喷雾状水，子实体生长期一般每天喷水1～2次，子实体进入成熟期停止喷水；出菇时测定各菌株的子实体产量，利用下式计算其生物学效率，并作显著性测验，淘汰产量过低的菌株：生物学效率(％)＝子实体鲜品产量(g)/培养料干重(g)
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100；
92.(5)子实体农艺性状的比较：以22
×
35cm规格的聚丙烯袋装入稻草谷壳栽培培养基，每袋500g干料，高压灭菌2h或者常压高温灭菌24小时，冷却后分别接入供试菌株，每个菌株接20袋，设2个重复，在25℃恒温培养箱中培养，待菌丝长满菌袋后移入出菇房，立放在出菇床架上出菇，停止喷水降湿，促使其由营养生长进人生殖生长，控制空气湿度在85～90％，温度20～25℃，同时加强通风换气，增加光照，促进原基扭结形成子实体原基形成后控制湿度85％左右，温度25～30℃，气温超过30℃时采用加厚遮阳物、畦沟灌水、棚顶喷水、空间喷雾或其他方式降温；原基和幼菇生长期仅在干燥时喷雾状水，子实体生长期一般每天喷水1～2次，子实体进入成熟期停止喷水；出菇后观察并记录菇体形态、颜色、菇柄长度和粗度及菇盖的直径和厚度。
93.下面结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步说明。
94.实施例1：
95.本发明通过引进和采集不同栽培种或野生的金福菇，野生种和栽培种的亲缘关系、生态类型和生理特性差异较大，相对性状的优缺点能彼此互补，杂种优势可能表现较强。栽培成熟后获得孢子，并对孢子稀释分离以获得单核菌丝体进行配对杂交以获得子一代，并对其做拮抗和出菇试验鉴定，测定杂交组合母种和栽培阶段的菌丝体生长速率，比较不同菌株的早熟性状，对不同菌株做耐高温初筛选，同时比较不同菌株对绿霉的抗性，然后栽培出菇，测定不同菌株的产量，比较不同子实体的生物学特性，筛选出最适合海南气候的优良品种，示范种植。同时获得相关栽培种植的技术参数，并制定技术规范规程。通过对不同杂交子一代的比较，寻找适合海南本土营养价值高的金福菇杂交品种，为菇农创收致富，为海南等热带地区金福菇种植业发展提供科学依据。
96.二、内容(内容、重点解决的问题、特色和创新之处)
97.1.主要内容
98.(1)本发明通过采集野生种或引进栽培种金福菇，栽培成熟后获得孢子，并对孢子稀释分离以获得单核菌丝体进行配对杂交以获得子一代；
99.(2)通过拮抗试验和垂直平板聚丙烯酰胺凝胶电泳方法去鉴定杂交子一代菌株是否不同且优于亲本菌株；
100.(3)测定杂交子一代与亲本母种和栽培阶段的菌丝体生长速率，比较不同菌株的早熟性状，对不同菌株做耐高温初筛选，同时比较不同菌株对绿霉的抗性；
101.(4)栽培出菇，测定不同菌株的产量，比较不同子实体的生物学特性，筛选出适合海南气候的优良杂交子一代品种，示范种植。
102.2.要重点解决的技术关键问题
103.(1)要引进或采集到亲缘关系、生态类型和生理特性差异较大的亲本；
104.(2)要对亲本孢子稀释分离以获得单核菌丝体以备顺利进行杂交；
105.(3)要用单核菌丝体来配对杂交获得杂交子一代菌株；
106.(4)子一代菌株的鉴定是关键，要通过拮抗试验和垂直平板聚丙烯酰胺凝胶电泳方法去鉴定杂交子一代菌株是否不同且优于亲本菌株；
107.(5)最终筛选出产量等农艺性状表现优良的杂交子一代。
108.3.本发明的特色和创新之处
109.本发明创新之处是提出金福菇的杂交育种研究，搜集野生和栽培种的优异遗传资源，得到相对性状差异较大，种质基因丰富的杂交亲本，通过单菌孢杂交获得新的菌株，选出优良的金富菇杂交子一代品种。
110.三、方案
111.1.技术路线
112.2.方法或设计、实施方案
113.2.1研究方法
114.2.1.1试验材料
115.(1)供试菌株
116.野生或栽培种金福菇
117.(2)供试培养基
118.①
培养孢子的完全合成培养基
119.蛋白胨2g，酵母膏3g，mg s04·
7h200.5g，kh2po40.46g，k2hp041g，葡萄糖20g，琼脂20g，蒸馏水1000m l。
120.②
pda综合平板培养基
121.马铃薯200g(去皮)，葡萄糖20g，琼脂20g，蛋白胨5g，kh2po43g，mg so41.5g，vb120mg，水1000m l，ph自然。
122.③
母种活化培养基
123.棉籽壳100g，马铃薯100g(去皮)，麸皮50g，葡萄糖20g，琼脂20g，蛋白胨5g，kh2po43g，mg so41.5g，vb120mg，水1000m l，ph自然。
124.④
原种和栽培种培养基
125.干稻草50％，谷壳40％，玉米粉6％，蔗糖1％，石膏1％，碳酸钙1％，石灰1％，料水比为1:1.4。
126.(3)试验仪器：培养皿、三角瓶、超净工作台sw-cj-2fd、显微镜smz-168、电泳仪dyy-6c、卧式高压灭菌锅炉1000cm
×
850cm、培养箱fyl-ys-100l、消毒锅炉室、多功能蒸汽
炉1.2米陪预热箱、枝条粉碎机ays005、装袋机、翻料机等食用菌生产专用设备以及酶提取试剂盒等试剂耗材。
127.2.1.2方法
128.2.1.2.1单核体的分离和鉴定
129.(1)种菇的选择
130.所选种菇应具备亲本典型优良性状，种菇选定后，并随时检查种菇的生长情况。种菇八成熟时，及时采摘备用。
131.(2)菇体的表面消毒
132.将采摘后的种菇，用75％酒精在菇体表面进行揩擦消毒，然后用无菌水冲洗，最后用无菌纱布吸干菇体表面水分，即可进行分离。
133.(3)孢子的收集
134.将消过毒的种菇插入孢子采集装置的支架上，支架可用粗铁丝折曲而成，在支架下放有培养皿底，作收集孢子用，整个装置都须先灭菌干燥，有关操作必须在超净工作台中进行。
135.(4)孢子的分离
136.孢子的分离采用连续稀释法，通过连续稀释孢子液，使孢子分散到较低限度，再吸取一定量的孢子液注入平板培养基，这样分离出的孢子就被固定培养而形成单孢菌落。其具体步骤如下：在无菌条件下在含有一定量孢子的三角瓶中，注入10m l无菌水并摇匀，再从中吸取1m l孢子液，加入9m l无菌水中。如此反复稀释，一直到稀释液中孢子浓度约为106个/m l，吸取最终稀释的孢子液0.5m l，用玻棒均匀涂于平板培养基上，25℃恒温培养。
137.(5)单核菌丝鉴别
138.菌落长到2cm时，挑取边缘菌丝置载玻片上，用显微镜观察，若无锁状联合结构，可初步认为是孢子萌发而生成的单核菌丝，然后转接到斜面培养基上，25℃恒温培养。
139.2.1.2.2单核菌丝配对杂交
140.将两个不同亲本的单核菌丝同时接种于平板培养基上，相距1.0～1.5cm，培养12d左右，待两菌丝接触后，挑取交界处的部分菌丝用棉兰(碱性甲基蓝)染色后进行镜检，如发现锁状联合，立即将其转接于新的斜面培养基上，于25℃下培养7～10d左右，挑出菌丝生长旺盛、菌落形态均匀的菌株，挑取少许菌丝放在显微镜下观察，鉴定确是双核菌丝后，进行pda斜面试管扩大培养，而菌落形态不均一、菌丝生长较弱的则淘汰，待菌丝满管后，选择优良的异核菌丝体，放入冰箱内保藏，留作筛选试验用。
141.2.1.2.3杂交菌株鉴定
142.(1)拮抗试验
143.拮抗试验是鉴定菌株间遗传差异的传统方法，菌丝之间的拮抗反应是菌株间不同菌株遗传特性的重要表现。
144.在平板培养基的中间接种单孢杂交菌丝，两端分别接种亲本的菌丝，如菌丝生长能连成一片，说明是同种菌丝，若在菌丝生长相交处形成明显的黄褐色拮抗线，便说明菌丝性质不同。只有在培养基上同时出现两条拮抗线，才说明杂交成功，产生了新的菌株。
145.(2)液体培养基出菇试验
146.将所有的杂交组合分别接种到含30ml液体培养基的三角瓶(100ml)中，每个组合3
次重复。25℃恒温培养，待菌丝长满液面时进行低温刺激培养，记录菇蕾产生情况，淘汰不具有结实能力的杂交组合。
147.(3)杂交亲本及杂交子一代的酯酶同工酶电泳分析
148.将上述杂交子一代与2个杂交亲本菌株一起进行酯酶同工酶电泳，根据酯酶同工酶酶谱，比较子一代与亲本的差异，进一步鉴定金福菇杂交种，并初步预测杂交子一代杂种优势的强弱。
149.①
酶液提取
150.将菌龄相同，接种块大小相同的菌种接入液体培养基，在25℃条件下培养7d，取不同菌株的菌丝体，去掉培养基用滤纸吸干后，称重0.5g于小研钵中，在冰箱中冰冻12h后，加入0.5ml稀释4倍的浓缩胶缓冲液研成匀浆，5℃离心(6000r/m)30min，取上清液置冰箱内保存备用。
151.②
电泳
152.采用垂直平板聚丙烯酰胺凝胶电泳方法。分离胶浓度为7.5％，浓缩胶浓度为3.75％，点样量20μl，电泳槽缓冲液为tris-甘氨酸，稳定电压180v，溴酚蓝指示剂在浓缩胶中时电流控制在20ma，待溴酚蓝进入分离胶后，加大电流至30ma，当溴酚蓝即胶板底部1cm时，停止电泳。
153.③
取胶
154.用一支带长针头的注射器吸取蒸馏水，将针头紧靠玻璃内壁，插于凝胶与玻璃板壁之间，轻轻推动注射器，同时转动玻璃板，并使针头在管壁与凝胶间前进，使凝胶与管壁分离。
155.④
酯酶同工酶的显色
156.将脱出的胶条放入磷酸缓冲液配置的酯酶显色液中于25℃下显色，待看到桃红色或褐色酯酶同工酶区带时，用5％醋酸固定并可于4℃下保存。
157.酯酶显色液的配制：称取100mg坚牢兰，溶于150m l 0.1mol/l磷酸缓冲液，过滤待用，使用前称取50mgα-乙酸萘酯，50mgβ-乙酸萘酯溶于3m l丙酮中，然后逐渐倒入上述溶液中，边加边搅拌，使其均匀混合即可染色。
158.2.1.2.4菌丝生长速率的测定
159.(1)母种阶段菌丝生长速率的测定
160.将筛选后的杂交组合分别接种于含20ml pda综合培养基直径为9cm的培养皿中，每皿接入直径为8mm、厚0.1mm的活化菌丝圆片，置于25℃恒温培养箱中培养，每个处理3个重复。当有一处理长满培养皿时，结束培养，记录菌丝生长天数和菌落半径，计算菌丝生长速度，观察菌丝形态及长势，结果进行显著性测验。
161.菌丝生长速度(mm/d)＝菌落半径(mm)/生长天数(d)
162.(2)栽培种阶段菌丝生长速度的测定
163.栽培种采用22
×
35cm聚丙烯袋，每袋500g干料，高压灭菌2h，冷却室温时接种，接种量4％，每个品种接10袋，在25℃恒温培养箱中黑暗培养，记录菌丝生长速度，观察菌丝形态及其长势，结果进行显著性测验。
164.菌丝生长速度(mm/d)＝培养料的长度(mm)/满袋天数(d)
165.2.1.2.5不同菌株早熟性状的比较
166.以22
×
35cm聚丙烯袋栽培袋，每袋500g干料，接种量10％，每个菌株接10袋，设3个重复，在25℃恒温培养，待菌丝长满菌袋后移入菇房，停止喷水降湿，促使其由营养生长进人生殖生长，此时空气湿度控制在85～90％，温度20～25℃，同时加强通风换气，增加光照，促进原基扭结形成子实体原基形成后控制湿度85％左右，温度25～30℃，气温超过30℃时采用加厚遮阳物、畦沟灌水、棚顶喷水、空间喷雾等方式降温。原基和幼菇生长期一般不喷水，干燥时喷雾状水，子实体生长期一般每天喷水1～2次，子实体进人成熟期停止喷水。按以上金福菇子实体阶段要求管理。记录菌丝长满菌袋的时间，原基期(从接种到出现原基)，菇峰期(从接种到出菇高峰)。
167.2.1.2.6耐高温菌株的初筛选
168.根据金福菇丝生长的温度范围，进行试验设计，分别将筛选后的杂交子一代菌株及亲本菌株接种到pda平板培养基上，设置3次重复，测量菌丝在25℃、30℃、35℃和40℃下培养5～7d的生长速度，进行金福菇耐高温菌株的初筛选。
169.菌丝生长速度(mm/d)＝菌丝生长长度(mm)/菌丝生长天数(d)
170.2.1.2.7不同菌株对绿霉抗性的比较
171.分别将筛选后的杂交组合接种到pda平板培养基上，2d后接入绿霉菌株，与菌种块之间相距2.5cm，每个处理设置3个重复，在25℃条件下培养7d，观察记录不同菌株与绿霉拮抗情况，测量拮抗线宽度。
172.以22
×
35cm聚丙烯袋栽培袋装入金福菇最适的栽培培养基，每袋500g干料，接种量10％，每个菌株接10袋，设3个重复，在25℃下容易发生杂菌的环境中培养，记录绿霉发生率。菌丝长满菌袋后移入菇房，停止喷水降湿，促使其由营养生长进人生殖生长，此时空气湿度控制在85～90％，温度20～25℃，同时加强通风换气，增加光照，促进原基扭结形成子实体原基形成后控制湿度85％左右，温度25～30℃，气温超过30℃时采用加厚遮阳物、畦沟灌水、棚顶喷水、空间喷雾等方式降温。原基和幼菇生长期一般不喷水，干燥时喷雾状水，子实体生长期一般每天喷水1～2次，子实体进入成熟期停止喷水。按以上金福菇子实体阶段要求管理，出完第一潮菇后记录绿霉发生率。
173.2.1.2.8不同菌株的产量比较
174.将菌株接入金福菇栽培料中，在25℃恒温培养，待菌丝长满后移入菇房，按金福菇子实体阶段要求管理，出菇时测定各菌株的子实体产量，计算其生物学效率，并作显著性测验，淘汰产量过低的菌株。
175.生物学效率(％)＝子实体鲜品产量(g)/培养料干重(g)
×
100
176.2.1.2.9子实体农艺性状的比较
177.以22
×
35cm规格的聚丙烯袋装入稻草谷壳栽培培养基，每袋500g干料，高压灭菌2h或者常压高温灭菌24小时，冷却后分别接入供试菌株，每个菌株接20袋，设2个重复，在25℃恒温培养箱中培养，待菌丝长满菌袋后移入出菇房，立放在出菇床架上出菇，停止喷水降湿，促使其由营养生长进人生殖生长，此时空气湿度控制在85～90％，温度20～25℃，同时加强通风换气，增加光照，促进原基扭结形成子实体原基形成后控制湿度85％左右，温度25～30℃，气温超过30℃时采用加厚遮阳物、畦沟灌水、棚顶喷水、空间喷雾等方式降温。原基和幼菇生长期一般不喷水，干燥时喷雾状水，子实体生长期一般每天喷水1～2次，子实体进入成熟期停止喷水。按以上金福菇子实体阶段要求管理。出菇后观察并记录菇体形态、颜
色、菇柄长度和粗度及菇盖的直径和厚度。
178.以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。