Sub基因在调控水稻耐寒性中的应用

sub基因在调控水稻耐寒性中的应用
技术领域
1.本发明涉及基因工程及分子生物学领域，尤其涉及sub基因在调控植物耐寒性中的应用。


背景技术：

2.水稻原产中国，是世界范围内重要的粮食作物之一。随着世界人口的不断增加，耕地面积逐渐减少，如何提高粮食产量及提高品质已成为备受瞩目的研究课题。水稻作为我国最重要的粮食作物，产量居粮食作物首位，播种面积占粮食作物总面积的1/3。低温寒害作为主要逆境胁迫，对水稻的各个时期尤其是芽苗期生长均产生严重影响，是我国稻作生产中的主要限制因子。严重的低温寒害可导致东北粳稻主产区年产量平均减产50-100亿公斤，约占正常年总产的20％。同时水稻直播是中国水稻生产的必然发展趋势，目前面临最大的问题之一是芽苗期水稻耐冷性较差，极大限制水稻直播时期，因此培育水稻耐寒品种，对提高我国水稻产量及品质，推广水稻直播面积，保障粮食安全具有非常重大的意义。
3.sub(os01g0769200)基因属于水稻枯草杆菌蛋白酶家族，该类蛋白在植物中功能报道极少，与植物耐寒性是否相关尚无报道。


技术实现要素：

4.本发明的目在于解决芽苗期水稻耐冷性较差问题，提供sub基因在调控水稻耐寒性中的应用，本发明通过在植物中利用crispr技术敲除技术获得sub基因，并获得耐寒的转基因植物。
5.为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：
6.本发明提供一种sub基因在调控植物耐寒性中的应用，所述的sub基因具有如下任一种核苷酸序列：
7.i)seq id no.1所示的核苷酸序列；或
8.ii)seq id no.1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；或
9.iii)在严格条件下与seq id no.1所示序列杂交的核苷酸序列；或
10.iv)与i)、ii)或iii)的核苷酸序列具有90％以上同源性且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。
11.sub基因编码区由2550个碱基组成，sub基因来源于水稻品种zh11。
12.本发明还提供一种由上述sub基因编码的蛋白在调控植物耐寒性中的应用，所述蛋白具有如下任一种氨基酸序列：
13.i)seq id no.2所示的氨基酸序列；或
14.ii)seq id no.2所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸且表达相同功能蛋白质的氨基酸序列；或
15.iii)在严格条件下与seq id no.2所示序列杂交的氨基酸序列；或
16.iv)与i)、ii)或iii)所示的蛋白的n端和/或c端连接标签得到的融合蛋白。
17.上述应用中的严格条件是指：在含0.1％sds的0.1
×
sspe或含0.1％sds的0.1
×
ssc溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；
18.应理解，考虑到密码子的简并性及不同物种密码子的偏爱性，本领域技术人员可以根据需要使用适合特定物种表达的密码子。
19.本发明还提供一种调控植物耐寒性的方法，所述方法通过敲除植物体内sub基因或降低受体植物体内sub基因的表达实现。
20.优选的，所述方法利用crispr基因编辑技术，对sub基因进行定点突变，使得sub基因功能缺失或表达减低。
21.优选的，所述植物为单子叶植物，更优选为水稻。
22.将本发明的sub基因定点突变后，获得功能缺失的水稻突变体。突变型水稻表现为耐寒的表型。为了便于对转基因植物进行鉴定及筛选，可对所使用的载体进行加工，如加入植物可选择性标记或具有抗性的抗生素标记物等。
23.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
24.本发明通过对编码植物枯草杆菌蛋白酶的基因os01g0769200的研究，发现对该基因进行缺失突变的植株较野生型植株具有明显耐寒的表型。
25.本发明从水稻中分离出sub基因，并将其应用于水稻耐寒性的提高，对于培育抗逆境水稻新品种乃至植物抵抗逆境的遗传改良都将具有非常重要的意义。
附图说明
26.图1为本发明实施例1中突变体与野生型对照的测序结果。
27.图2a为本发明实施例2中突变体在正常生长条件及低温处理1，2，3天后植株生长情况照片。
28.图2b为本发明实施例2中突变体在正常生长条件及低温处理1，2，3天后植株的存活率。
具体实施方式
29.以下将对本发明的具体实施方式进行详细描述。为了避免过多不必要的细节，在以下实施例中对属于公知的结构或功能将不进行详细描述。以下实施例中所使用的近似性语言可用于定量表述，表明在不改变基本功能的情况下可允许数量有一定的变动。除有定义外，以下实施例中所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如sambrook等分子克隆实验手册(sambrook j&russell dw,molecular cloning:a laboratory manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
30.以下实施例中的主要试剂为：各种限制性内切酶、taq dna聚合酶、购自neb、takara等生物公司；质粒小提试剂盒和琼脂糖凝胶回收试剂盒购自天根生物有限公司；琼脂粉、琼脂糖、各种抗生素以及glucose、bsa、lb medium等购自sigma、bio-rad等公司；实施例中所使用的各种其它化学试剂均为进口或国产分析纯试剂。
31.实施例1sub基因缺失突变体纯合鉴定
32.sub基因的缺失突变体t1代种子购自外部公司，通过pcr鉴定及测序，筛选纯合的突变植株，进行后续耐寒表型鉴定实验。
33.野生型及突变体的突变位点检测过程如下：
34.一、取样
35.对突变体及对照组(野生型)植株进行取样，取叶片中段3-5cm于装有珠子的2ml离心管中，做好标记，-80℃保存。
36.二、ctab法提dna
37.1.从-80℃取出后放入scientz-192高通量组织研磨器磨样。
38.2.磨样后，每管加入750ul的ctab，摇匀。
39.3.65℃水浴45min，每15min取出摇晃几次。
40.4.每管加入500ul的氯仿，摇匀，静置分层。
41.5.常温下，12000rpm离心10min。取上清(500-600ul)到1.5ml离心管中。
42.6.每管加入500ul异丙醇，摇匀后放到-20℃冷冻2h。
43.7.从-20℃取出后4℃、12000rpm离心10min，弃上清。
44.8.每管加入1ml 75％乙醇，常温12000rpm离心3min，小心倒掉上清。
45.9.重复步骤8一次。
46.10.常温或37℃烘箱中开盖15-30min，晾干管中残留乙醇和水。
47.11.加入适量蒸馏水以溶解dna，振荡器混匀。
48.12.用nanodrop 1000测定dna浓度。
49.三、pcr
50.用f向引物(ctactagcttcatcagctccac)和r向引物(ggagagattctcacccaaactg)对突变体dna和对照组zh11的dna进行pcr，30ul体系反应体系如下：
[0051][0052]
pcr程序如下：
[0053][0054]
四、1％琼脂糖凝胶电泳
[0055]
取pcr产物5ul点样，在250v下跑电泳12min。突变体和对照组的dna在500bp左右均有明亮条带，将剩余25ul pcr产物送测序。
[0056]
五、测序结果分析
[0057]
用snapgene软件对测序结果进行分析，将突变体序列和zh11序列进行比对，确定各突变体突变位点。
[0058]
检测结果见图1，可以看出突变体与野生型相比，在第567位碱基发生缺失，从而导致翻译提前终止(sub基因序列为seq id no.1所示序列，虚线框标注567c突变位点；生成完整蛋白序列为seq id no.2所示序列。sub突变基因序列为seq id no.3所示序列，生成的提前终止的sub突变蛋白序列为seq id no.4所示序列。)
[0059]
实施例2sub突变体植物的耐寒能力检测
[0060]
将对照材料野生型(zh11)水稻幼苗和实施例1中所得的sub突变体各选取饱满种子40粒，种植于水稻培养土中，在28℃光照培养箱中培养十五天左右至两叶一心时期，移到4℃光照培养箱分别处理0，1，2，3天，移至28℃光照培养箱恢复7天并观察表型，并统计植株存活率。
[0061]
结果显示(图2)，突变体与野生型相比，在低温处理不同时间后均表现出较强耐寒性，数据统计表明突变体具有较高的存活率。这说明sub突变植株的耐寒能力得到显著提高。由此可见，水稻sub基因突变后可显著提高植物的耐寒性。
[0062]
以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明。凡在本发明的申请范围内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。