基于可视化法的滚环等温扩增技术检测食源性致病菌金黄色葡萄球菌的方法及其应用与流程

1.本发明属于微生物检测技术领域，具体涉及一种基于可视化法的滚环等温扩增技术检测食源性致病菌金黄色葡萄球菌的方法及其应用。


背景技术：

2.由食源性致病菌引发的疾病是食品安全的主要问题，也是广泛关注的一个重要公共卫生问题。近年来国内外食源性中毒事件的爆发，大量的感染仍然是由微生物引起。金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus) 是一种常见的人类病原体，隶属于葡萄球菌属(staphylococcus)，有“嗜肉菌”的别称，是革兰氏阳性菌的代表，多见于生牛乳和生肉中。金黄色葡萄球菌是常见的食源性致病菌，是造成很多重大食品安全事故和临床感染的主要致病菌之一，其产生的肠毒素热稳定性强，而且该菌广泛存在于自然界中，与人类接触密切，容易造成食品污染导致人类误食金黄色葡萄球菌造成食品安全事故。因此，如何快速准确、灵敏地检测出食源性病原微生物已成为控制食品安全问题的关键。
3.目前，检测金黄色葡萄球菌的方法包括传统培养，生化检测（如显色培养基），免疫学方法（如酶联免疫检测法），分子生物学方法（如多重pcr技术）等。其中，传统培养和生化检测方法检测时间长，容易受到杂菌菌落形态和数量以及变种金黄色葡萄球菌的影响，出现假阴性结果；免疫学方法试验周期长，步骤繁琐，各种非相关抗原易引起交叉反应，食物加热过程中产生的肠毒素蛋白凝集等会造成检测结果的假阳性或假阴性；分子生物学方法同样容易受到样品成分等因素的影响。这些常用的检测金黄色葡萄球菌的方法或需要长时间的处理、熟练的工作人员和昂贵的实验室设备，或具有不稳定、灵敏度低、准确性差等缺点。食品中金黄色葡萄球菌主要依据现行国家标准gb4789.10-2016进行。这些传统的方法虽然为金标准，但是操作复杂、检测周期较长，在突发的公共卫生事件如食物中毒，难以满足快速检测需求。因此建立灵敏高效的食源性致病菌-金黄色葡萄球菌检测方法，对于食品安全监控具有重要的意义。
4.近年来，随着分子检测技术的不断发展，等温扩增技术备受青睐，其中，滚环等温扩增技术因其具有高灵敏度、高特异性、高通量、扩增产物经磷酸化处理后可直接测序、简单易操作等特点，成为分子检测实用型的一种，为食源性致病菌检测提供新的检测方法。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种基于可视化法的滚环等温扩增技术（rolling circle amplification,rca）检测食源性致病菌金黄色葡萄球菌的方法及其应用。该检测方法利用滚环扩增技术（rca）的优势，针对食源性致病菌-金黄色葡萄球菌设计相应的锁式探针及引物，对目标菌进行滚环等温扩增反应，并结合扩增产物的特点，用sybr greenⅰ对扩增产物进行颜色反应。整个操作过程简单，大约4小时可完成检测，而且不需要大型精密仪器，实现了直接从肉眼上判断有无目标扩增产物的可视化需求，特别适合基层实验室或者检验机构
对金黄色葡萄球菌的检测，在突发公共卫生事件中为食源性致病菌的检测指明了新方向。
6.为实现上述目的，本发明采用如下的技术方案：一种基于可视化法的滚环等温扩增技术检测食源性致病菌金黄色葡萄球菌的方法，包括以下步骤：（1）样品dna提取；（2）rca技术对金黄色葡萄球菌的检测方法的建立；（3）灵敏度验证及可视化反应；（4）特异性验证及可视化反应。
7.上述的基于可视化法的滚环等温扩增技术检测食源性致病菌金黄色葡萄球菌的方法，所述步骤（1）样品dna提取方法为：收集金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、藤黄微球菌、沙门菌、大肠埃希菌经胰酪大豆胨液体培养基培养24h的培养物，根据细菌dna提取试剂盒说明书进行。
8.所述步骤（2）rca技术对金黄色葡萄球菌的检测方法的建立，方法如下：a1.根据金黄色葡萄球菌特异性目标序列，设计锁式探针及滚环扩增引物，其中，引物pf：5
’‑
tcatgctgctaacggtcgag-3’（seqidno:2）；引物pr1：5
’‑
cgcacatgtaccgctgaatg-3’（seqidno:3）；b1.连接反应，以金黄色葡萄球菌菌液、dna为模板，其中10
×
e.colibuffer1.0
µ
l、sa-plp（200pm）0.5
µ
l、模板2.0
µ
l，补足水至8.0
µ
l，将反应体系于95℃5min、50℃1h后再加入e.colidna连接酶（1000u）1.0
µ
l、10
×
bsa1.0
µ
l，总体积为10
µ
l，于37℃条件下连接30min；同时以ddh2o为空白对照；c1.酶切反应，在连接反应中加入10
×
exonucleaseibuffer2.0
µ
l、10
×
exonucleaseⅲbuffer2.0
µ
l、核酸外切酶exonucleasei（750u）和exonucleaseⅲ（5000u）各1.0
µ
l、ddh2o4.0
µ
l，反应总体积为20
µ
l，37℃反应1h、95℃10min；d1.滚环扩增，反应体系为20
µ
l，其中10
×
bst聚合酶buffer2.0
µ
l、pf（10
µ
m）1.0
µ
l、pr1（10
µ
m）1.0
µ
l、dntp（datp,dctp,dgtp,dttp各2.5mm）1.0
µ
l、bst大片段聚合酶（800u）1.0
µ
l、上一步酶切产物2.0
µ
l，补足ddh2o至20
µ
l，于65℃下反应1h；f1.将扩增产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，目标产物在电泳图上呈梯度分布。
9.所述步骤（3）灵敏度验证方法为：将金黄色葡萄球菌提取好的dna进行浓度测定，再将dna稀释10倍、100倍、1000倍，以此为模板，各浓度梯度取2
µ
l按照已建立的方法进行滚环扩增，对扩增产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，同时加入稀释10倍的sybrgreeni（10000
×
）1.0
µ
l，根据电泳条带及颜色反应判断此检测方法对金黄色葡萄球菌dna检测的灵敏度。
10.所述步骤（4）特异性验证方法为：金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、藤黄微球菌、沙门菌、大肠埃希菌的dna为模板，取2
µ
l按照已建立的方法进行滚环扩增，对扩增产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，同时加入稀释10倍的sybrgreeni（10000
×
）1.0
µ
l，根据电泳条带及颜色反应判断此检测方法对金黄色葡萄球菌检测有无特异性。
11.本发明的另一目的在于提供所述的基于可视化法的滚环等温扩增技术（rolling circle amplification，rca）检测食源性致病菌金黄色葡萄球菌的方法在检测金黄色葡萄球菌中的应用。
12.相对于现有技术，本发明提供的基于可视化法的滚环等温扩增技术检测食源性致病菌金黄色葡萄球菌的方法及其应用具有以下优势：（1）本发明基于可视化法的滚环等温扩增技术检测食源性致病菌金黄色葡萄球菌的方法，该检测方法根据金黄色葡萄球菌的特异性目标片段，设计了相应的锁式探针，在有目标片段存在的情况下，锁式探针两端与目标序列互补成环，在e.coli dna连接酶作用下连接成环，以此为模板，设计引物实现滚环扩增，扩增产物可达109拷贝。该检测方法根据金黄色葡萄球菌特异性的目标片段，设计了锁式探针，锁式探针两端只有在存在目标序列的情况下才会互补，进而成环，因此，特异性较高。
13.（2）本发明所述的食源性致病菌金黄色葡萄球菌的检测方法，该检测方法可以在短时间内对靶序列进行扩增，其线性滚环扩增效率为105倍，而指数型扩增效率可高达109倍，这一高灵敏度的特性使其检测达到了单分子水平。
14.（3）本发明利用rca技术的优势，针对食源性致病菌-金黄色葡萄球菌设计相应的锁式探针及引物，对目标菌进行滚环等温扩增反应，并结合扩增产物的特点，用sybr greenⅰ对扩增产物进行颜色反应。在有扩增产物存在的情况下，sybr green i结合扩增产物，荧光大大增强，颜色反应由橙色变为荧光绿色，从肉眼上直接判断结果，特别适合基层实验室或者检验机构对金黄色葡萄球菌的检测。该方法灵敏度较高、检测时间较短，对金黄色葡萄球菌dna的检测限为11.5pg/
µ
l。
15.（4）本发明提供的基于可视化法的滚环等温扩增技术（rolling circle amplification,rca）检测食源性致病菌金黄色葡萄球菌的方法，该检测方法属于等温扩增，其操作简单，不需要依赖大型精密仪器，水浴锅即可进行扩增，对扩增产物可以直接通过加入荧光染料进行初步判断，因此，特别适合一些基层实验室和检验机构，为食源性致病菌的快检需求提供一种新方法。
16.（5）本发明提供的基于可视化法的滚环等温扩增技术检测食源性致病菌金黄色葡萄球菌的方法，整个操作过程简单，大约4小时可完成检测，而且不需要大型精密仪器，实现了直接从肉眼上判断有无目标扩增产物的可视化需求，在突发公共卫生事件中为食源性致病菌的检测指明了新方向。
附图说明
17.图1为实施例2中 rca技术对金黄色葡萄球菌的检测所得的凝胶电泳图，图中从左往右依次为：dna marker（dl2000）、1～2泳道为空白对照、3～4泳道为金黄色葡萄球菌菌液、5～6泳道为金黄色葡萄球菌dna。
18.图2为实施例2中rca技术对金黄色葡萄球菌dna检测的灵敏度试验结果图；图中，左边为凝胶电泳图，右边为颜色反应管，凝胶电泳图中：m为marker dl2000、1：空白对照、2：dna浓度为11.5ng/
µ
l、3: dna浓度为1.15 ng/
µ
l、4：dna浓度为115pg/
µ
l、5：dna浓度为11.5pg/
µ
l；颜色反应管对应的编号同凝胶电泳图。
19.图3为实施例2中rca技术对金黄色葡萄球菌dna检测的特异性试验结果图；图中，
左边为凝胶电泳图，右边为颜色反应管，凝胶电泳图中：m为markerdl2000、1：空白对照、2：金黄色葡萄球菌dna、3:表皮葡萄球菌dna、4：藤黄微球菌dna、5：沙门菌dna；6：大肠埃希菌dna；颜色反应管中，k：空白对照、j：金黄色葡萄球菌dna、b：表皮葡萄球菌dna、t：藤黄微球菌dna、s：沙门菌dna、d：大肠埃希菌dna。
具体实施方式
20.下面结合实施例及附图来详细说明本发明。
21.实施例1一种基于可视化法的滚环等温扩增技术检测食源性致病菌金黄色葡萄球菌的方法，包括以下步骤：(1)样品dna提取：收集金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、藤黄微球菌、沙门菌、大肠埃希菌经胰酪大豆胨液体培养基培养24h的培养物，根据细菌dna提取试剂盒说明书进行。
22.(2)rca技术对金黄色葡萄球菌的检测方法的建立：a1.根据金黄色葡萄球菌特异性目标序列，设计锁式探针及滚环扩增引物，其中，引物pf：5
’‑
tcatgctgctaacggtcgag-3’（seqidno:2）；引物pr1：5
’‑
cgcacatgtaccgctgaatg-3’（seqidno:3）；b1.连接反应，以金黄色葡萄球菌菌液、dna为模板，其中10
×
e.colibuffer1.0
µ
l、sa-plp（200pm）0.5
µ
l、模板2.0
µ
l，补足水至8.0
µ
l，将反应体系于95℃5min、50℃1h后再加入e.colidna连接酶（1000u）1.0
µ
l、10
×
bsa1.0
µ
l，总体积为10
µ
l，于37℃条件下连接30min；同时以ddh2o为空白对照；c1.酶切反应，在连接反应中加入10
×
exonucleaseibuffer2.0
µ
l、10
×
exonucleaseⅲbuffer2.0
µ
l、核酸外切酶exonucleasei（750u）和exonucleaseⅲ（5000u）各1.0
µ
l、ddh2o4.0
µ
l，反应总体积为20
µ
l，37℃反应1h、95℃10min；d1.滚环扩增，反应体系为20
µ
l，其中10
×
bst聚合酶buffer2.0
µ
l、pf（10
µ
m）1.0
µ
l、pr1（10
µ
m）1.0
µ
l、dntp（datp,dctp,dgtp,dttp各2.5mm）1.0
µ
l、bst大片段聚合酶（800u）1.0
µ
l、上一步酶切产物2.0
µ
l，补足ddh2o至20
µ
l，于65℃下反应1h；f1.将扩增产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，目标产物在电泳图上呈梯度分布。
23.（3）灵敏度验证及可视化反应；灵敏度验证方法为：将金黄色葡萄球菌提取好的dna进行浓度测定，再将dna稀释10倍、100倍、1000倍，以此为模板，各浓度梯度取2
µ
l按照已建立的方法进行滚环扩增，对扩增产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，同时加入稀释10倍的sybrgreeni（10000
×
）1.0
µ
l，根据电泳条带及颜色反应判断此检测方法对金黄色葡萄球菌dna检测的灵敏度。
24.（4）特异性验证及可视化反应；特异性验证方法为：金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、藤黄微球菌、沙门菌、大肠埃希菌的dna为模板，取2
µ
l按照已建立的方法进行滚环扩增，对扩增产物进行2%琼脂糖凝胶
电泳，同时加入稀释10倍的sybr green i（10000
×
）1.0
µ
l，根据电泳条带及颜色反应判断此检测方法对金黄色葡萄球菌检测有无特异性。
25.实施例2方法确认1、rca技术对金黄色葡萄球菌的检测方法的建立按照液相rca建立的体系，以金黄色葡萄球菌dna、菌液为模板进行rca扩增，同时以水替代模板作为空白对照。结果，该检测方法实现了对目标菌的扩增，在凝胶电泳图上条带呈规则的阶梯状分布，说明建立的液相rca反应体系是有效的。结果见图1。
26.2、灵敏度验证及可视化颜色反应将金黄色葡萄球菌提取好的dna进行浓度测定，再将dna稀释10倍、100倍、1000倍，以此为模板按照已建立的方法进行滚环扩增。其中金黄色葡萄球菌dna浓度经测定为11.5ng/
µ
l，结果显示金黄色葡萄球菌dna稀释梯度在10-1
（dna浓度为1.15ng/
µ
l）、10-2
（dna浓度为115pg/
µ
l）均可呈现出较亮的条带，10-3
（dna浓度为11.5pg/
µ
l）的稀释级条带较暗，推测该检测方法对金黄色葡萄球菌dna检测的灵敏度为11.5pg/
µ
l。颜色反应的结果也显示了当dna浓度为11.5pg/
µ
l时，反应管的颜色呈现出橙绿色，颜色反应的结果基本与琼脂糖凝胶电泳的结果一致，见图2。
27.3、特异性验证及可视化颜色反应以表皮葡萄球菌、藤黄微球菌、沙门菌、大肠埃希菌dna为模板，同时以ddh2o为空白对照、金黄色葡萄球菌dna为阳性对照，按照已建立的方法进行滚环扩增。结果显示，只有金黄色葡萄球菌dna出现特异性目标条带，其余菌株均未出现条带，说明该检测方法特异性好。颜色反应的结果也显示，只有目标菌存在时才会出现扩增产物，经sybr green
ꢀⅰ
染色后呈现出阳性反应的荧光绿色，其余菌株未发生扩增，因此颜色反应呈现出阴性反应的橙色，颜色反应的结果与电泳的结果是一致的，见图3。
28.以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。