一种腈水合酶氨基酸基序的改造及其应用

1.本发明涉及一种腈水合酶氨基酸基序的改造及其应用，属于生物工程技术领域。


背景技术：

2.腈水合酶(nitrile hydratase，简称nhase，ec 4.2.1.84)，是一类可以催化腈类物质通过水合反应转化为高附加值酰胺类化合物的金属酶，在大宗化学品丙烯酰胺的工业生产上已经被广泛应用。目前，腈水合酶以其绿色环保、反应条件较温和、安全系数高等优势，而逐渐替代传统的化学法，使得酰胺类的生产符合可持续发展和绿色生产理念。
3.腈水合酶通常由α和β两个亚基构成，研究发现，目前已报道的原核生物来源的腈水合酶大都存在稳定性差、催化活性低、催化底物谱窄的问题。也有很多研究尝试对其进行了改造，来提高其相关的性质。但是目前的催化效率不高、底物谱窄等问题仍然限制着腈水合酶进一步的开发和应用。


技术实现要素：

4.针对现有的技术难点及存在的问题，本发明通过对来源于嗜热假诺卡氏菌(pseudonocardiathermophila)的腈水合酶的氨基酸改造，以期能拓宽底物谱并提升催化性能。
5.本发明提供了一种腈水合酶突变体，所述腈水合酶包含α亚基和β亚基；所述突变体是将腈水合酶亲本的β亚基的第129位突变；所述腈水合酶亲本的α亚基的氨基酸序列如seq id no.1所示，β亚基的氨基酸序列如seq id no.2所示。
6.在一种实施方式中，所述突变体的特征为：将β亚基的第129位突变为精氨酸，得到突变体a129r。
7.本发明提供了编码所述突变体的基因。
8.本发明提供了携带所述基因的重组质粒。
9.在一种实施方式中，以pet-24a(+)为表达载体。
10.本发明提供了表达所述突变体，或含有所述基因的宿主细胞。
11.在一种实施方式中，所述宿主细胞包含原核或真核微生物。
12.在一种实施方式中，所述宿主细胞以大肠杆菌为出发菌株，优选的，以e.coli bl21(de3)为表达宿主。
13.本发明提供了一种生产酰胺类物质的方法，所述方法是以腈类物质为底物，利用所述突变体a129r催化生成酰胺类物质。
14.在一种实施方式中，所述腈类物质包括异丁腈、正戊腈、烟腈、2-氰基吡嗪、苯甲腈、肉桂腈、1-萘甲腈和噻虫啉。
15.在一种实施方式中，所述酰胺类物质包括异丁酰胺、戊酰胺、烟酰胺、吡嗪酰胺、苯甲酰胺、肉桂酰胺、萘-1-甲酰胺和酰胺噻虫啉。
16.本发明还提供了所述突变体，或所述基因，或所述重组质粒，或所述宿主细胞在制
dh5α中，在lb平板培养后、挑取单克隆由天霖生物科技(无锡)有限公司进行测序验证，得到阳性转化子，从阳性转化子中提取质粒，即为突变体质粒pet24a(+)-a129r。
30.表1引物序列
[0031][0032]
表2 pcr扩增体系
[0033][0034]
实施例2：pt nhase的野生型及突变体对于烟腈的催化效率
[0035]
将ptnhase的野生型wt的质粒pet24a(+)-ptnhasewt及重构质粒pet24a(+)-a129r分别转化至e.coli bl21(de3)，挑取单菌落至5ml lb培养基，37℃、200rpm条件下培养7-8h。将种子液按1％(v/v)转接至100ml 2
×
yt培养基，37℃、200rpm条件下培养至od
600
至0.6-0.8，加入终浓度为0.4mm的异丙基硫代半乳糖苷(iptg)以及0.1g/l的cocl2·
6h2o，改变培养温度为24℃，诱导表达16h。
[0036]
纯化野生型wt及a129r突变体，采用sds-page检测目的蛋白的纯化质量，检测如图1所示，可见野生型及其突变体所表达的蛋白在纯化后蛋白条带单一，纯化质量高。
[0037]
用10mm kpb(按k2hpo4:kh2po4＝4:1配制，ph 7.4)缓冲液将wt及a129r突变体纯酶的浓度稀释至0.5mg/ml，取10μl至1.5ml离心管中，置于25℃金属浴上。向离心管中加入490μl底物(200mm烟腈溶液)，充分涡旋混匀，25℃下反应10min，然后加入500μl纯乙腈溶液进行终止。将反应液用纯乙腈溶液稀释适当倍数，过0.22μm滤膜。
[0038]
液相检测方法：流动相组成为乙腈：水＝1：2(v/v)，流速为0.6ml/min，检测波长为215nm，柱温为40℃，测定反应体系中产物烟酰胺的生成量。
[0039]
wt及突变体a129r的比酶活计算结果如图2所示，野生酶wt的比酶活为70.8
±
2.3u/mg，突变体a129r的比酶活为661.8
±
69.0u/mg。
[0040]
即当上述β亚基上的129位氨基酸残基发生突变时，腈水合酶的比酶活有显著地提高，说明上述129位的氨基酸残基可能在亚基的关键结构域，对于腈水合酶的催化活性具有重要作用。
[0041]
实施例3：pt nhase的野生型及突变体a129r的底物谱
[0042]
培养诱导及反应体系同实施例2。基于上述的纯酶进行不同底物催化反应，在培养基中分别添加不同的底物，其中异丁腈、2-氰基吡嗪、苯甲腈、肉桂腈、1-萘甲腈和噻虫啉催化反应用的浓度为0.05mg/ml，戊腈、烟腈催化反应用的浓度为0.5mg/ml。
[0043]
液相检测方法：流动相组成为乙腈：水＝1：2(v/v)；流速：除苯甲酰胺、肉桂酰胺和酰胺噻虫啉为1ml/min外，异丁酰胺、戊酰胺、烟酰胺、吡嗪酰胺和萘-1-甲酰胺均为0.6ml/min；检测波长：异丁酰胺和戊酰胺为202nm，烟酰胺、苯甲酰胺和萘-1-甲酰胺为215nm，吡嗪酰胺和肉桂酰胺为261nm，酰胺噻虫啉为242nm；柱温为40℃，测定反应体系中产物酰胺的生成量。
[0044]
wt及突变体a129r的比酶活计算结果如图3所示，对于异丁腈、正戊腈、烟腈、2-氰基吡嗪、苯甲腈、肉桂腈、1-萘甲腈和噻虫啉等8种腈类底物催化，野生酶wt的比酶活分别为666.2
±
80.8u/mg、14.4
±
0.9u/mg、70.8
±
2.33u/mg、203.2
±
8.1u/mg、176.5
±
8.1u/mg、45.8
±
1.0u/mg、13.1
±
1.7u/mg、21.4
±
0.3u/mg，突变体a129r的比酶活分别为1498.9
±
89.6u/mg、60.5
±
15.3u/mg、661.8
±
69.0u/mg、660.4
±
4.0u/mg、1211.9
±
17.6u/mg、379.1
±
0.0u/mg、20.6
±
1.8u/mg、78.9
±
2.3u/mg。其中，a129r催化异丁腈、正戊腈的比酶活分别是wt的2.25倍、4.2倍；其催化烟腈、2-氰基吡嗪、苯甲腈、肉桂腈、1-萘甲腈、噻虫啉和丰加霉素的比酶活分别是wt的9.35、3.25、6.87、8.3、1.6和3.69倍。
[0045]
即当β亚基上129号位点的丙氨酸突变为精氨酸时，腈水合酶对于其他不同腈类底物的比酶活均有不同程度地提高，尤其是对于较大位阻的芳香族和杂环族底物分子的活性提升更为显著。
[0046]
表3野生型与突变体对不同底物的酶活比较
[0047][0048]
实施例4
[0049]
具体实施方式参见实施例1，区别在于，对于野生型ptnhase做单点饱和突变，将第129位的丙氨酸替换为其他19个氨基酸(分别突变为c/d/e/f/g/h/i/k/l/m/n/p/q/r/s/t/v/w/y)。待突变体经培养和诱导表达之后，将细胞调至相同od
600
至0.5，测定其酶活，结果显示突变为精氨酸时，酶活性最高。
[0050]
表4野生型与突变体的全细胞对烟腈催化活性的比较
[0051][0052]
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。