一种模拟BtCry1Ac蛋白关键抗虫功能表位的短肽及其编码基因与应用

display cloned antigens on the virion surface”，science，1985年05期)首次报道将外源多肽基因克隆到丝状噬菌体dna上，经串联共表达，外源多肽展示到噬菌体衣壳表面，实现多肽表型与其基因型统一于一个噬菌体上，由此开创了噬菌体表面展示多肽技术并获得了2018年度诺贝尔化学奖。噬菌体表面展示多肽技术实现了靶标多肽材料体外可人工定向筛选、修饰的新阶段，同时多肽基因可以依托噬菌体和宿主菌进行持续表达，使多肽制备更方便、更省时、更省力“phage display:concept,innovations,applications and future”(pande等，biotechnol.adv.，2010年06期)，且还能将多肽基因转移克隆到更合适的载体或表达体系中进行优化表达“optimizing antibody expression:the nuts and bolts”(ayyar等，methods(san diego,calif.)，2017年116卷)，乃至进行进一步体外亲和成熟修饰“基因突变技术在抗体亲和力体外成熟中的应用”(刘媛等，浙江大学学报(农业与生命科学版)，2015年第1期)。
6.目前，利用噬菌体表面展示多肽技术筛选具体模拟bt cry1ac蛋白关键抗虫功能表位的短肽技术尚未见报道。


技术实现要素：

7.针对上述问题，本技术提供一种可高效靶向结合棉铃虫中肠类钙黏蛋白毒素结合区并能模拟bt cry1ac及其抗独特型抗体关键抗虫功能表位的短肽材料(h-sc01)，该短肽序列片段小，可以替代多种生物材料的关键功能表位，实现全功能或部分功能替代，可用于丰富抗虫蛋白的多样性，为防控bt cry靶标害虫储备更多潜在可用的蛋白类生物抗虫材料。
8.具体来说，本发明是这样实现的：
9.本技术首先提供了一种可模拟bt cry1ac蛋白关键抗虫功能表位的新型短肽材料，其氨基酸序列如seq id no.2所示，申请人将该短肽材料自命名为h-sc01，编码该短肽材料基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。
10.该短肽材料可以应用于模拟并替代bt cry1ac蛋白关键抗虫功能表位。
11.其次，本技术提供了一种经氨基酸序列如氨基酸序列如seq id no.2所示短肽替换bt cry蛋白domian
ⅱ‑
loop2区后的重组体i，其氨基酸序列如seq id no.6所示，重组体i的编码基因核苷酸序列如seq id no.5所示。
12.该重组体i可以应用于杀灭棉铃虫、小菜蛾。
13.第三，本技术本技术提供了一种经氨基酸序列如氨基酸序列如seq id no.2所示短肽替换bt cry蛋白domian
ⅱ‑
loop3区后的重组体ii，其氨基酸序列如seq id no.8所示，重组体ii的编码基因核苷酸序列如seq id no.7所示。
14.该重组体ii可以应用于杀灭棉铃虫、小菜蛾。
15.第四，本技术本技术提供了一种经氨基酸序列如氨基酸序列如seq id no.2所示短肽替换bt cry1ac蛋白抗独特型人源重链单域抗体cdr2区的重组体iii，其氨基酸序列如seq id no.10所示，重组体iii的编码基因核苷酸序列如seq id no.9所示。
16.该重组体iii可以应用于杀灭棉铃虫、小菜蛾。
17.本技术通过随机合成短肽序列的形式，构建了一个库容量为109的噬菌体展示随机6肽库，首次设计以克隆表达的bt cry1ac靶标害虫棉铃虫中肠类钙黏蛋白毒素结合区
(hacadcr9-cr11)作为为包被靶点，通过特异性富集筛选，从供试库中进行体外高通量靶向筛选与hacadcr9-cr11发生高结合活性，具有模拟bt cry1ac蛋白关键抗虫功能表位的短肽材料，进而将短肽替换bt cry1ac蛋白及其抗独特型抗体中的关键抗虫活性区域，将构建的重组体进行室内靶标害虫的抗虫活性测定，获得具有抗虫活性的的重组体。与现有技术相比，本技术获得的短肽具有以下有益效果：
18.1、本发明首次锚定bt cry1ac靶标害虫棉铃虫中肠类钙黏蛋白毒素结合区作为包被靶点，采用多轮富集淘筛的方式筛选靶标短肽，指向性强，制备周期短，筛选效率高，短肽的氨基酸序列小，适合体外重组克隆。
19.2、本技术提供的短肽可以用于改造bt cry蛋白及其模拟物，既提高bt cry蛋白及其模拟物抗虫活性，也可避免靶标害虫对bt cry蛋白及其模拟物的抗药性。此外该短肽还有望作为增效剂直接用于辅助bt cry蛋白及其模拟物抗虫活性和抗虫谱系中。
20.3、本技术的实施例中，以模拟bt cry1ac蛋白关键抗虫功能表位的短肽替换替换bt cry1ac蛋白及其抗独特型抗体关键功能表位后的重组体，均具有较高抗虫活性，可作为新型抗虫蛋白用于靶标害虫的绿色防控，丰富了bt cry蛋白及其抗独特型抗体多样性。
附图说明
21.图1为elisa测定可特异性结合bt cry1ac靶标害虫棉铃虫中肠类钙黏蛋白毒素结合区(hacadcr9-cr11)的噬菌体展示短肽富集效果示意图。
22.图2为elisa测定靶标噬菌体展示短肽与bt cry1ac靶标害虫棉铃虫中肠类钙黏蛋白毒素结合区(hacadcr9-cr11)特异性结合活性检测结果示意图。
23.图3为靶标短肽替换bt cry蛋白domian
ⅱ‑
loop2区、-loop3区以及bt cry1ac蛋白抗独特型人源重链单域抗体cdr2区后的重组体对棉铃虫的致死率检测结果示意图；
24.图3中，ck-:为pbs溶液阴性对照；ck1+:为bt cry 1ac蛋白溶液阳性对照；ck2+:为bt cry1ac蛋白抗独特型人源重链单域抗体蛋白h9溶液阳性对照；重组体1:为靶标短肽(h-sc01)替换bt cry蛋白domian
ⅱ‑
loop2区后的重组体蛋白溶液；重组体2：为靶标短肽(h-sc01)替换bt cry蛋白domian
ⅱ‑
loop3区后的重组体蛋白溶液；重组体3：为靶标短肽(h-sc01)替换bt cry1ac蛋白抗独特型人源重链单域抗体cdr2区后的重组体蛋白溶液。
25.图4为靶标短肽替换bt cry蛋白domian
ⅱ‑
loop2区、-loop3区以及bt cry1ac蛋白抗独特型人源重链单域抗体cdr2区后的重组体对小菜蛾的致死率检测结果示意图；
26.图4中，ck-:为pbs溶液阴性对照；ck1+:为bt cry 1ac蛋白溶液阳性对照；ck2+:为bt cry1ac蛋白抗独特型人源重链单域抗体蛋白h9溶液阳性对照；重组体1:为靶标短肽(h-sc01)替换bt cry蛋白domian
ⅱ‑
loop2区后的重组体蛋白溶液；重组体2：为靶标短肽(h-sc01)替换bt cry蛋白domian
ⅱ‑
loop3区后的重组体蛋白溶液；重组体3：为靶标短肽(h-sc01)替换bt cry1ac蛋白抗独特型人源重链单域抗体cdr2区后的重组体蛋白溶液。
具体实施方式
27.实施例中所涉及的试剂和培养基配方：
28.(1)2
×
ty液体培养基：
29.在900ml蒸馏水中加入16g胰蛋白胨，10g酵母提取物和5g nacl，搅拌混匀，用蒸馏
水定容到1l，置于高压灭菌锅中，121℃，20min灭菌，冷却后，置于4℃保存备用。
30.(2)2
×
ty-ag液体培养基：
31.在2
×
ty的培养基中加入终浓度为100μg/ml氨苄青霉素和质量比为1％葡萄糖。
32.(5)tye固体培养基：
33.在900ml蒸馏水中加入15g琼脂糖，8g nacl，10g胰蛋白胨，5g酵母提取物，用蒸馏水定容到1l，置于高压灭菌锅中，121℃，20min灭菌，冷却后，置于4℃保存备用。
34.(6)tye-ag固体培养基：
35.在tye固体培养基中加入终浓度为100μg/ml氨苄青霉素和质量比为1％葡萄糖。
36.(7)pbs溶液
37.称取nacl 8g，kcl 0.2g，na2hpo4·
12h2o 2.9g，kh2po40.2 g，分别加入到蒸馏水中，充分溶解后，定容到1l。
38.(8)pbst溶液
39.在pbs溶液中加入体积比为0.05％的吐温-20。
40.(9)peg/nacl溶液：
41.称取20g peg 8000，14.61g nacl，加80ml去离子水，定容到100ml，置于高压灭菌锅中，121℃，20min灭菌，冷却后，置于4℃保存备用。
42.(10)柠檬酸盐缓冲液(cpbs,底物缓冲液，ph5.5)：
43.取c6h7o8(柠檬酸)21g，na2hpo4·
12h2o 71.6g，分别加入到蒸馏水中充分溶解后定容到1l。
44.(11)四甲基联苯胺(tmb)溶液：
45.称取10mg四甲基联苯胺溶于1ml二甲基亚砜中，避光，置于4℃保存备用。
46.(12)底物显色溶液：
47.10ml配方成分：9.875ml cpbs、100μl tmb溶液、25μl体积比为20％h2o2。
48.(13)lb液体培养基
49.1l体系：称取10g胰蛋白胨，5g酵母提取物，10gnacl，以蒸馏水定容至1l，置于高压灭菌锅中，121℃，20min灭菌，冷却后，置于4℃保存备用。
50.(14)lb固体培养基
51.1l体系：取10g胰蛋白胨，5g酵母提取物，10gnacl，15g琼脂粉，以蒸馏水定容至1l置于高压灭菌锅中，121℃，20min灭菌，冷却后，置于4℃保存备用。
52.(15)iptg溶液
53.1ml体系：称取0.238g(1mm)iptg溶于1ml蒸馏水中，配置成浓度为1mm/ml的母液，于-20℃保存备用。
54.实施例中所涉及材料来源：
55.噬菌体展示随机6肽库(库容量为109)由专利申请人实验室(省部共建国家重点实验室培育基地-江苏省食品安全重点实验室)自构建，其中随机6肽基因委托通用生物系统(安徽)有限公司合成；该6肽库采用常规方法构建，即随机合成6肽基因，然后将其随机克隆至pit2噬菌粒载体上，再导入e.coli tg1宿主菌中，即构成噬菌体展示形式的6肽库。具体步骤如下：
56.①
委托通用生物系统(安徽)有限公司随机合成含有ncoi和noti酶切位点的6肽基
因序列。
57.②
将合成的ncoi-6肽序列-noti基因和提取的pit2噬菌粒载体，按照50μl总酶切体系(包含5μl的10
×
neb buffer，30μl的ncoi-6肽序列-noti基因或pit2噬菌粒载体，0.5μl的100
×
bsa buffer，2μl的noti酶溶液，2μl的ncoi酶溶液和10.5μl ddh2o)吹打混匀后，将体系放置到37℃恒温金属浴中进行酶切过夜。第二天，取出酶切好的体系，按照pcr产物胶回收试剂盒附录的产品说明书(genelutetm gel extraction kit，sigma-usa)所描述方式进行除酶、除杂纯化，最后获得的目的片段以ddh2o溶解(可置-20℃冻存备用)。取酶切后的ncoi-6肽序列-noti基因或pit2噬菌粒载体片段，按照50μl总酶连体系(包含5μl的10
×
t4 ligase buffer，25μl的ncoi-6肽序列-noti基因酶切片段，5μl的pit2噬菌粒载体酶切片段，2μl的t4 ligase和13μl
58.ddh2o)吹打混匀后，将体系放置到16℃恒温金属浴中进行过夜酶连。第二天，取出一管分装冻存的e.coli tg1电转感受态细胞，在手中捂化并迅速置于冰水中，将酶连体系加入到感受态细胞中(持续保持冰水预冷状态)，用移液器轻轻吹打(20～30次)混匀，接着在冰水中冰浴5min。取出冰浴混合物，迅速加入到事先冰浴预冷的商品化一次性电转杯中，并立即插入电转仪相应凹槽中以电压2500v电激100μs，取出电转杯，快速将电激后的混合物加入到800μl事先预热的2
×
ty液体培养基中，接着置于37℃恒温水浴锅中静置孵育40min。取出孵育体系，吸取100μl培养物涂布于tye-ag(a和g分别表示含终浓度为100μg/ml amp和1％glu)固体培养基上，然后置涂布板于37℃恒温培养箱中倒置培养过夜。通过计算长出的单菌落数换算成为整个电转体系所能长出菌落数的理论值即判定为该噬菌体展示6肽库的库容量。
59.pit2噬菌粒载体、e.coli tg1细菌和辅助噬菌体km13购于英国sourcebioscience公司；
60.靶标短肽基因替换bt cry蛋白domian
ⅱ‑
loop2和-loop3区以及替换btcry1ac蛋白抗独特型人源重链单域抗体cdr2区相应基因后的重组体全长基因序列，以及将重组体基因分别克隆到pgex-6p-1上并化转进入e.colibl21感受态细胞中，均委托通用生物系统(安徽)有限公司合成和克隆化转。cry1ac的结构为本领域公知技术，cry1ac的晶体结构(pdb:4ary)可从rcsb pdb数据库(https://www.rcsb.org/)获得；也可以通过“cry1ac 3d sutructure 4ary.pdb:crystal protein[bacillus thuringiensis]genbank:aaa22331.1 journal gene 36(3),289-300(1985)pubmed 3000881”获得。
[0061]
anti-m13-[hrp]antibody,his-trap hp亲和纯化柱购于美国ge healthcare公司；
[0062]
bt cry1ac靶标害虫棉铃虫中肠类钙黏蛋白毒素结合区(hacadcr9-cr11)蛋白“roles of midgut cadherin from two moths in different bacillus thuringiensis action mechanisms:correlation among toxin binding,cellular toxicity,and synergism”(gao等，j.agric.food chem，2019年总第67期)和bt cry1ac抗独特型抗体h9(h9不具备任何抗虫活性，其氨基酸序列如seq id no.12所示，编码基因的核苷酸序列如seq id no.11所示，h9序列首位为起始密码子)均由申请人实验室表达制备(省部共建国家重点实验室培育基地-江苏省食品安全重点实验室)；
[0063]
棉铃虫和小菜蛾均由专利申请人实验室(省部共建国家重点实验室培育基地-江
苏省食品安全重点实验室)饲养保存；
[0064]
bt cry1ac购于上海佑隆生物科技有限公司。
[0065]
实施例1淘筛模拟bt cry1ac蛋白关键抗虫功能表位的噬菌体展示短肽
[0066]
(1)取500μl冻存的自构建的噬菌体展示随机6肽库菌液加入到200ml 2
×
ty-ag液体培养基中，37℃恒温培养到od
600
为0.4，接着加入200μl滴度为～10
12
pfu/ml的km13辅助噬菌体进行侵染，随即在37℃中孵育30min，然后以3300g离心10min，弃上清液，用100ml 2
×
ty-ak液体培养基重悬沉淀物；最后30℃恒温培养过夜。次日取出培养体系，以3300g离心30min，收集上清液并加入25ml peg/nacl溶液，冰浴1h，再以3300g离心30min，最后用5ml pbs重悬沉淀。重悬液以11600g离心10min，上清液即为扩增的噬菌体展示随机6肽库。
[0067]
(2)取步骤1获得的扩增的噬菌体展示随机6肽库进行4轮富集淘筛：第1轮富集淘筛，吸取4ml浓度为100μg/ml的bt cry1ac靶标害虫棉铃虫中肠类钙黏蛋白毒素结合区(hacadcr9-cr11)蛋白溶液加入无菌的细胞培养瓶中，在4℃冰箱中静置包被过夜；次日，每次以1ml pbs溶液清洗细胞培养瓶，重复洗涤3次，然后加入1ml步骤(1)获得扩增的噬菌体展示随机6肽库与4ml 3％的mpbs溶液混匀的混合物，在室温下缓慢摇动1h，再静置1h，倾去培养瓶中液体；以每次1ml pbst溶液洗瓶，重复洗涤20次；最后加入1ml浓度为10mg/ml的胰蛋白酶(trypsin)溶液洗脱特异性结合的噬菌体展示6肽材料，洗脱液即为第1轮富集淘筛的噬菌体展示6肽；第2、3、4轮富集淘筛中bt cry1ac靶标害虫棉铃虫中肠类钙黏蛋白毒素结合区(hacadcr9-cr11)蛋白包被的浓度分别为50、25、10μg/ml，所投入富集淘筛的噬菌体展示随机6肽库为前一轮富集淘筛获得的噬菌体6肽库，富集淘筛方法与第1轮相同，各轮次富集效果如图1所示。
[0068]
取20μl第4轮富集淘筛获得的噬菌体展示随机6肽库溶液侵染1ml处于对数生长期的e.colitg1细菌，37℃孵育1h后，涂布于tye-ag固体培养基上，接着37℃培养过夜。次日，随机挑取单菌落，接种到含有100μl/孔2
×
ty-ag液体培养基的96孔板中，37℃培养过夜；接着从板孔中吸出2.5μl菌液转接到新的含有100μl/孔2
×
ty-ag液体培养基的96孔板中，37℃孵育2h；随即每孔加入25μl滴度为～10
12
pfu/ml的km13辅助噬菌体，30℃孵育1.5h，1800g离心10min，用200μl 2
×
ty-ak液体培养基重悬沉淀后30℃培养过夜；次日以1800g离心30min，分别取上清液用于elisa分析。
[0069]
(3)bt cry1ac靶标害虫棉铃虫中肠类钙黏蛋白毒素结合区(hacadcr9-cr11)蛋白溶液，按照100μl/孔加入到96孔板中，4℃包被过夜；次日，每孔分别加入100μl步骤(2)获得的上清液，阴性对照加100μl 2
×
ty-ak液体培养基，37℃水浴2h；每孔用250μl pbst洗板后，每孔加入100μl 1:3000稀释的anti-m13-[hrp]antibody，37℃孵育2h；每孔加入100μl底物显色溶液，每孔加入100μl底物显色溶液，室温下避光显色反应15min，最后每孔加入50μl浓度为2m的h2so4快速终止反应，用酶标仪测定od
450
值。以此评价步骤(3)中筛选到的阳性噬菌体展示6肽材料对bt cry1ac靶标害虫棉铃虫中肠类钙黏蛋白毒素结合区(hacadcr9-cr11)蛋白的结合活性，即溶液od
450
值/阴性对照od
450
值大于3.0，判定为阳性，与该溶液对应的步骤(2)中的上清液即为筛选到的含有与bt cry1ac靶标害虫棉铃虫中肠类钙黏蛋白毒素结合区(hacadcr9-cr11)蛋白结合活性的噬菌体展示6肽上清液。
[0070]
通过上述筛选和鉴定，申请人筛选到一种与bt cry1ac靶标害虫棉铃虫中肠类钙黏蛋白毒素结合区(hacadcr9-cr11)蛋白具有较强结合活性且能模拟bt cry1ac蛋白关键
抗虫功能表位的短肽材料，将其自命名为h-sc01，其所对应步骤(2)的上清液对bt cry1ac靶标害虫棉铃虫中肠类钙黏蛋白毒素结合区(hacadcr9-cr11)蛋白结合活性的elisa检测效果如附图2所示，由图2检测结果可见，h-sc01具有较强结合活性。
[0071]
分别设计上游引物(其核苷酸序列如seq id no.3所示)和下游引物(其核苷酸序列如seq id no.4所示)，测定靶标短肽h-sc01核苷酸序列如seq id no.1所示，核苷酸翻译后的氨基酸序列如seq id no.2所示。
[0072]
实施例2靶标短肽(h-sc01)替换bt cry1ac蛋白及其抗独特型抗体关键功能表位后的重组体蛋白可溶性表达及纯化
[0073]
委托通用生物系统(安徽)有限公司，以bt cry1ac和bt cry1ac蛋白抗独特型人源重链单域抗体基因序列为模板，分别将bt cry1ac蛋白domian
ⅱ‑
loop2区、bt cry蛋白domian
ⅱ‑
loop3区和bt cry1ac蛋白抗独特型人源重链单域抗体h9的cdr2区的基因片等量替换为实施例获得的h-sc01短肽，获得重组体依次为重组体i、重组体ii、重组体iii。
[0074]
重组体i的核苷酸序列如seq id no.5所示(其第1111-1128位基因被替换为h-sc01序列)，氨基酸序列如seq id no.6所示；重组体ii的核苷酸序列如seq id no.7(其第位1312-1329基因被替换为h-sc01序列)所示，氨基酸序列如seq id no.8所示；重组体iii的核苷酸序列如seq id no.9(其第151-168位基因被替换为h-sc01序列)所示，氨基酸序列如seq id no.10所示。
[0075]
将重组体i、重组体ii、重组体iii分别在lb液体培养基(含终浓度为100μg/ml氨苄霉素)中25℃250rpm震荡培养至od
600 nm为0.6，然后加入iptg(终浓度为0.8mm)诱导表达12h；次日，取各菌液，分别以3300g离心20min，收集沉淀细胞，用细胞破碎仪破碎细胞，然后5000g离心20min取上清液，过his-trap hp affinity chromatography纯化收集各重组体蛋白(纯化方法参照论文“人源化抗cry1b毒蛋白单链抗体的原核表达及生物学活性测定”徐重新等，南京农业大学学报，2013年3期)。最后收集的各重组体蛋白均采用超微量分光光度计将浓度定量到500μg/ml，冻存备用。
[0076]
实施例3靶标短肽(h-sc01)替换bt cry1ac蛋白及其抗独特型抗体关键功能表位后的重组体蛋白室内抗虫活性测定
[0077]
将喂食棉铃虫和小菜蛾的人工饲料铺于24孔板，将靶标短肽(h-sc01)替换bt cry1ac蛋白及其抗独特型抗体关键功能表位后的3种重组体蛋白分别用pbs溶液将蛋白浓度定量到20μg/ml，然后每孔200μl均匀涂布在饲料表面，晾干。各组试验均以等体积的pbs溶液作为阴性对照，以等浓度等体积的bt cry1ac蛋白溶液作为阳性对照。取不同板，每孔接入1头2龄棉铃虫(或小菜蛾)，并置于温度为28℃
±
1℃，相对湿度80
±
5％，光周期(l:d)16h：8h的培养箱内饲养，每隔24h观察并记录死亡数，连续统计7天。每个处理组接30头幼虫，并重复3次试验。
[0078]
结果如图3、4所示。浸药饲养108h后，靶标短肽(h-sc01)替换bt cry蛋白domian
ⅱ‑
loop2区后的重组体蛋白i对供试棉铃虫和小菜蛾的校正死亡率分别达到75.3％和84.5％；靶标短肽(h-sc01)替换bt cry蛋白domian
ⅱ‑
loop3区后的重组体蛋白ii对供试棉铃虫和小菜蛾的校正死亡率分别达到73.5％和25.1％；靶标短肽(h-sc01)替换bt cry1ac蛋白抗独特型人源重链单域抗体(h9)cdr2区的重组体蛋白iii对供试棉铃虫和小菜蛾的校正死亡率分别达到21.6％和27.3％；而阴性对照(pbs溶液阴性对照)中供试棉铃虫和小菜
蛾校正死亡率分别为3.2％和5.7％，ck1+阳性对照(bt cry 1ac蛋白溶液)中供试棉铃虫和小菜蛾校正死亡率分别为96.2％和93.9％；ck2+阳性对照(bt cry1ac蛋白抗独特型人源重链单域抗体蛋白h9)中供试棉铃虫和小菜蛾几乎与ck-阴性对照一样，校正死亡率分别为3.5％和6.1％。
[0079]
以上实验结果证明h-sc01分别替换bt cry1ac的loopii和loopiii区，仍能保持良好的杀虫效果，该结果扩大了bt cry1ac抗虫材料多样性，也可以为防控靶标害虫抗药性提供了潜在替代新材料。而bt cry1ac蛋白抗独特型人源重链单域抗体(h9)对棉铃虫和小菜蛾均无任何抗虫活性，其cdr2区替换为h-sc01序列后的重组体蛋白iii则对两种害虫表现出抗虫活性，说明该短肽促进了人源重链单域抗体抗虫活性，在材料功能上实现了抗体新材料的抗虫活性的促进作用，具有良好的应用价值和应用潜力。
[0080]
以上实施例验证了的靶标短肽(h-sc01)具备模拟bt cry1ac蛋白关键抗虫功能表位的功能，可用于bt cry1ac蛋白及其抗独特型抗体(h9)改造，具有良好应用价值。