一种基于PCR的番茄枯萎病的快速鉴定方法

一种基于pcr的番茄枯萎病的快速鉴定方法
技术领域
1.本发明涉及分子生物学领域，特别是涉及一种基于pcr的番茄枯萎病的快速鉴定方法。


背景技术：

2.番茄枯萎病是由植物病原真菌尖孢镰刀菌番茄专化型fol(fusarium oxysporum f.sp.lycopersici)侵染番茄根部引起的土传维管束病害，分布广泛，病原菌在土壤中越冬并且能存活数年，一旦根部被侵染，fol就能在植株的维管束中由下向上蔓延，发病初期叶片会出现萎蔫，后逐渐从靠近地面的叶片逐渐失绿、黄化，最后叶片脱落，发病后期整株干枯萎蔫。病原菌严重影响了番茄的产量和品质，由于尖孢镰刀菌为土传病原真菌，一旦感染可连年发病，难以根治。目前最主要的防治方法是选用番茄枯萎病抗病品种，但是至今并未培育出高抗的品种，因此做好番茄枯萎病的预测预报工作就显得尤为重要。
3.随着分子生物学的发展，对于植物及病害的研究上升到分子水平。聚合酶链式反应(pcr)可用于体外扩增dna，在生物学、医学及植物病理学等领域已经得到了广泛应用。pcr技术应用于植物病害的诊断检测，如对植物病原真菌、细菌、线虫的分类鉴定、克隆基因以及病原物的定量等方面，具有快速、灵敏、特异、简便等特点。近年来，基于pcr的检测技术对多种作物病原菌的分子诊断及其在病害流行中的应用方面进行了较全面的研究。pcr技术的应用需要首先对dna进行提取，目前提取dna的方法主要有ctab法、微波法、sds法、尿素法、乙酸铵等，其中ctab提取基因组质量较高，并得到广泛应用。欧阳寿强等开发了一种利用ctab法提取基因组，结合pcr的方式对番茄枯萎病进行病害检测及发病程度鉴定。虽然使用ctab提取法可以稳定高质量的提取质量较高的基因组，但其步骤繁琐，即使改良后也仍然需要有机溶剂反复抽提，提取过程需在通风橱进行，对提取环境和使用药品有一定要求，对人身健康也有一定风险，尤其在样品数量较多时，仍然费时费力。
4.因此，探索一种更加实用、快速、便捷、稳定、高效的粗提dna方法十分有必要。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种基于pcr的番茄枯萎病的快速鉴定方法，以解决上述现有技术存在的问题，该方法安全、廉价、简单、快速、高效，对番茄病害预测预报及病害预防具有重要意义。
6.为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
7.本发明提供一种基于pcr的番茄枯萎病的快速鉴定方法，包括以下步骤：
8.取待测植物材料，与研磨材料共同于液氮中进行冷冻，再进行充分研磨，得待测植物粉末；
9.在待测植物粉末中加入naoh溶液，混匀后立即离心，取上清液，加入te缓冲液中和，提取得到待测植物dna；
10.将待测植物dna进行pcr检测，根据凝胶电泳结果进行病原分子检测及病害诊断。
11.进一步地，所述待测植物材料选自番茄植株的维管束组织。
12.进一步地，所述待测植物材料选自番茄植株的根、茎基部、底叶叶柄、茎中或顶梢。
13.进一步地，所述研磨材料为钢珠或磁珠，直径5mm；所述研磨的时间为90-120s。
14.进一步地，所述naoh溶液的浓度为0.5m，所述待测植物粉末与naoh溶液的用量比为100mg:500μl。
15.进一步地，混匀后立即离心，离心转速12000rpm，离心时间不超过10min，离心后，迅速取10μl上清液，加入90μl te缓冲液中和。
16.进一步地，所述pcr检测采用如下引物：
17.(1)foltef2引物：
18.f：acctcattgtcgccat；r：tgatctcacgctcccaa；
19.(2)folhistone4引物：
20.f：ccaagcgtcaccgaaagatt；r：ccctcgaggaaggtcttgag；
21.(3)folsvp1引物：
22.f：atgaaggtctcttcttccgt；r：accggagtagtcaatgtcga。
23.本发明公开了以下技术效果：
24.本发明旨在建立一种更加简单、高效、快速的提取植物dna，并作为模板进行pcr扩增检测病原的方法。主要利用naoh使植物细胞处于强碱环境下，使细胞裂解暴露dna，高速离心除去蛋白等杂质，取上清液以tris-hcl中和，提供缓冲环境，防止核酸被破坏。本发明以番茄为材料，比较ctab法与naoh-tris法提取dna的异同，测定提取dna的浓度，并以其为模板进行pcr扩增，通过观察琼脂糖凝胶电泳条带比较两种方法提取dna的质量差别，以此确定naoh-tris法提取dna的稳定性和有效性。同时将naoh-tris法应用于感病番茄的病原快速检测鉴定，通过对番茄不同组织进行dna提取及pcr检测，提供了可检测番茄枯萎病病原的特异引物，及可检测番茄枯萎病的几种寄主组织。
25.在对植物病害分子检测过程中，提取植物基因组dna是对植物进行分子检测的重要环节。有关植物dna的提取方法很多，常采用ctab提取法破除细胞壁，再与有机溶剂抽提相结合的方式。这些方法所提取的dna质量高，稳定性好，但步骤繁琐，耗时长，在样本所需量较大时，耗费大量研究时间，效率低。在后续许多研究中，部分实验对dna的质量要求并非极其严格，可通过rcr对基因实现扩增即可达到研究目的，尤其是在病害诊断中，仅需要实现pcr的有效扩增即可。因此本发明提出了一种用naoh和te buffer(100mm tris-hcl ph8.0，1mm edta)快速粗提感病植物dna的方式，并将其与传统ctab法做对比。用两种方式提取dna的过程：
①
在耗时方面，ctab法多次离心静置，反复用有机溶剂抽提，其中还包括短时间的低温储藏，完成提取需2.5-3h，耗费时间长。在样本需求量大时，提取时长增加。naoh-tris法，操作简单，省去有机溶剂反复抽提和低温下冷藏静置，更无需在通风橱内操作，节省了大量时间。除去抽真空干燥处理，完成提取只需0.5h，耗时较少。
②
在试剂方面，ctab法所使用药品复杂多样，所需的氯仿异丙醇等药物均具有一定毒性，易对环境造成污染，对实验室有一定要求。而本发明提出的方法使用药品单一，所用naoh和tris属于实验室常备药品，成本低，安全系数高。
③
在操作方面，ctab法步骤繁琐，在提取过程中易出现操作失误而导致dna提取质量差，naoh-tris法步骤单一，减少了过程出错的风险。
④
通过电泳条带的亮度比较，经过pcr扩增，两种方式所提dna质量并无太大差别，均可满足后续pcr检测。
26.此外，为了进一步分析该方法对不同番茄组织dna提取及枯萎病病原检测的普适性，本发明还提取了番茄根、茎、叶柄等组织，并进行了pcr鉴定。这些结果表明该方法也能够对植物多种不同组织实现稳定的dna提取，并应用于基因克隆及pcr检测，因此本发明利用该方法可实现对植物不同组织进行病原检测和鉴定，确定了naoh方法在病害检测过程中的稳定性。
27.另外，本发明使用的naoh是一种强碱，对dna会造成一定损害，因此naoh在使用过程中时间不宜过长，且尽量不要剧烈混合，尽可能保证细胞破碎加入naoh后10分钟内完成离心，并最终以te缓冲液中和，否则可能因为长时间的碱性条件使基因组dna片段慢慢断裂，严重破坏dna完整性，导致无法进行有效基因克隆，造成病害检测假阴性。最后te缓冲液中通过edta的加入，可以螯合ca
2+
和mg
2+
等二价金属离子，抑制部分dnase的活性，避免中和的dna会被进一步降解，以便更好的保存dna。
28.综上所述，用naoh和tris提取植物的dna并进行病原的pcr检测是一种安全、廉价、简单、快速、高效的病害分子检测方法，利用该方法可节约实验成本，对病害预测预报及病害预防具有重要意义，在实际生产中具有广泛的应用前景和利用价值。
附图说明
29.图1为不同方法提取基因组的pcr检测。健康番茄叶片组织利用naoh和ctab法提取dna后，作为模板进行pcr检测，检测基因为番茄slactin。
30.图2为番茄幼苗病原接种实验。左图为番茄灌根接种fol孢子液15天后的症状观察，右图为水灌根，作为对照。
31.图3为番茄幼苗不同组织dna提取及pcr检测。a.番茄不同部位的组织；b.不同组织样品dna的pcr检测结果，上图为1级发病番茄，下图健康番茄为对照。
32.图4为番茄病株dna提取及病原pcr检测流程。
具体实施方式
33.现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
34.实施例1
35.1材料和方法
36.1.1植物材料及培养
37.本试验用番茄(solanum lycopersicum cv.alisa craig[ac])作为研究材料。将植物种子种植于草炭土：蛭石质量比例为3:1的土壤中，在28℃相对湿度为60％，光照时间16小时的温室内培养2-3周左右。
[0038]
1.2病原菌的接种
[0039]
采用灌根的方法进行侵染，病原菌在pda培养基上培养3天左右，打6-8个菌饼在10ml pdb培养基中28℃培养过夜，过滤收集孢子，将孢子液浓度用ddh2o调至1.0
×
107个/ml，选取健康番茄幼苗进行灌根侵染，灌根前控水2-3天，将50ml孢子悬浮液灌入番茄种植的营养钵中。接种后的番茄放在28℃、湿度约60％的培养室中，光暗交替(光照16h)继续培养15天，观察病害症状并拍照。
[0040]
1.3样品收集
[0041]
取新鲜健康及发病番茄植物的叶片大约0.05g，或者根、茎、叶柄等组织0.15g组织，放入2ml离心管中，加入1粒直径5mm钢珠或磁珠，盖上盖，放入液氮中冷冻，之后用全自动样品快速研磨仪(jxfstprp-48)快速研磨90s-120s，至粉状。
[0042]
1.4 dna提取
[0043]
1.4.1 ctab法
[0044]
①
在100mg植物粉末中加入1ml 2％ctab的提取液(2％ctab，100mm tris-hcl，20mm edta，1.4m nacl，2％β-巯基乙醇，ph值8.0)，加入研磨珠，剧烈振荡，于65℃水浴加热40min，期间每隔20min左右摇动1次，充分混合样品与提取液。
[0045]
②
将样品于室温下12000rpm，离心7min，吸上清(约0.7ml)在通风厨中加入等体积的氯仿，反复颠倒，充分混匀后室温下12000rpm，离心10min。
[0046]
③
吸上清液(约0.5ml)于新的离心管中，加入等体积的异戊醇轻摇混匀，置于-20℃冰箱20-30min。
[0047]
④
室温下12000rpm，离心10min，弃上清液，留沉淀。
[0048]
⑤
用75％乙醇洗沉淀2次，自然风干dna。
[0049]
⑥
dna干燥后，加入40ddh2o溶解dna，然后保存于-20℃冰箱备用。
[0050]
1.4.2 naoh法
[0051]
在100mg粉末中分别加入500μl 0.5m的naoh颠倒混匀，室温下12000rpm离心10min。迅速取10μl上清液转移到新鲜管中，加入90μl te缓冲液(100mm tris-hcl ph8.0；1mm edta)中和，保存于-20℃冰箱备用。
[0052]
1.5 dna浓度测定
[0053]
应用核酸蛋白测定仪(biophotometer d30)，将提取的植物dna样品做适当稀释后测量dna含量。
[0054]
1.6 pcr扩增以及电泳检测
[0055]
本实施例选取番茄的slactin(nm_001321306)基因部分序列(f:ttgctgaccgtatgagcaag；r:gtctggtccatccattgtcc)进行扩增，检测番茄基因组提取质量，采用病原真菌基因foltef2(foxg_03515t0)引物(f：acctcattgtcgccat；r：tgatctcacgctcccaa)，folhistone4(foxg_09402)引物(f：ccaagcgtcaccgaaagatt；r：ccctcgaggaaggtcttgag)及folsvp1(foxg_11456)基因引物(f：atgaaggtctcttcttccgt；r：accggagtagtcaatgtcga)检测病原在番茄不同组织中的存在情况。实验采用20μl反应体系，基因组dna取2μl作为模板，利用1.1
×
t3 super pcr mix(tse030)聚合酶按照产品推荐的标准程序进行扩增。反应结束后，使用1％琼脂糖凝胶电泳对反应体系进行电泳，经过紫外投射显示电泳结果进行分析。
[0056]
2结果与分析
[0057]
2.1dna提取方法流程比较
[0058]
在样品准备一致的前提下，获得液氮研磨破碎的粉状组织后，利用naoh法提取的dna的用时较短，约0.5小时，而利用ctab法提取dna用时较长，累计约2.5小时。naoh法提取dna不仅节约时间，且所用危险试剂数量少，仅用naoh，无需使用氯仿及异丙醇等有机试剂抽提，毒性低，对人身更加安全，因此本实施例采用开发简单的naoh法进行基因组提取及
pcr检测(表1)。
[0059]
表1 naoh法及ctab法提取dna的比较
[0060][0061]
2.2不同方法提取番茄dna浓度检测结果
[0062]
通过利用0.5m naoh及ctab提取的dna进行浓度检测，结果显示番茄用naoh法提取的量一般为300-1000μg/ml，用ctab法提取的量一般为2000-3000μg/ml。虽然ctab法提取的植物dna的量比利用naoh提取的量要多4倍左右，但鉴于naoh法更加经济、安全及高效等特点，同时naoh法提取的量满足常规pcr需求，因此本实施例进行的枯萎病病原pcr检测所利用基因组可以用naoh法提取。
[0063]
2.3利用naoh法提取番茄的dna进行pcr检测
[0064]
为了进一步确定上述步骤中naoh提取的dna浓度满足pcr分子检测的需求，利用番茄内参基因slactin检测naoh法提取的基因组，利用ctab法提取的基因组作为对照(图1)。结果表明，naoh法提取基因组进行pcr检测时，条带清晰明亮，几乎与ctab法提取基因组进行的pcr一致，因此完全可以利用naoh法提取基因组，并进行pcr检测。
[0065]
2.4番茄枯萎病早期植株获得
[0066]
为了确定上述步骤中可以利用naoh法及pcr检测到寄主中的枯萎病病原，本实施例在实验室条件下对番茄进行接种实验，并获得发病早期的番茄植株(图2)。按照黄化叶片占总叶片的比例，将枯萎病严重程度分为5个级别：0级(健康)，1级(25％)，2级(50％)，3级(75％)，4级(100％)。本实施例中，fol灌根侵染番茄15天后，对照(mock)番茄长势良好，底部叶片无黄化现象，为健康植物，病害级别为0级；而尖孢镰刀菌(fol)灌根侵染的番茄底部叶片出现黄化及萎焉脱落症状，出现明显病害症状，黄化病害叶片为整个植株叶片数量的25％，定为1级，为发病早期阶段，后续将以此发病阶段的番茄进行病原分子检测。
[0067]
2.5利用naoh提取番茄不同组织dna及病原菌pcr检测
[0068]
利用2.3中所述的naoh法提取2.4中番茄发病早期(1级)及健康番茄的不同组织基因组dna，利用fol特异性引物检测尖孢镰刀菌在番茄不同组织中的存在情况(图3)。结果显示，番茄内参基因slactin克隆显示番茄不同组织样品的dna提取良好，均可作为模板进行pcr检测。而利用fol特异性引物对foltef2，folhistone4及folsvp1基因扩增时，病原菌基因仅在番茄根部、茎基部、茎中、病叶叶柄及顶稍中能检测到，而在黄色病叶及中部健康叶片中无法检测到尖孢镰刀菌的特异性基因，纯培养的尖孢镰刀菌基因组dna作为pcr阳性对照。通过以上三个基因确定发病早期的番茄中尖孢镰刀菌可存在于多个寄主组织，主要在维管束组织发达的根，茎，及叶柄等部位，因此以上所提到的组织可用于尖孢镰刀菌快速诊断，而发病或其它叶片组织不适合病原的分子检测。同时说明以上3个基因特异性较好，番茄中不会造成pcr的假阳性，均可用于番茄枯萎病的pcr检测。
[0069]
2.6碱裂解法提取植物dna及pcr流程
[0070]
根据以上实验结果，番茄枯萎病病原pcr检测主要包括以下流程(图4)：选取病苗的维管束组织(优选顺序依次为根、茎基部、底叶叶柄、茎中、顶稍)；通过液氮进行组织破碎；利用0.5m naoh法快速提取dna，然后利用te缓冲液中和；进行pcr检测，根据凝胶电泳结果进行病原分子检测及病害诊断。
[0071]
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。