蛹虫草Ptrpc重叠启动子文库及其应用

本发明属于食用菌合成生物学领域，具体涉及蛹虫草中不同基因表达启动强度的启动子文库及其构建方法，特别涉及基于biobrick法串联的1至9个拷贝的蛹虫草ptrpc重叠启动子文库。

背景技术：

1、蛹虫草(cordyceps militaris)又名北冬虫夏草，属子囊菌门(ascomycota)、麦角菌科(clavicipitaceae)、虫草属(cordyceps)，是我国常见的食药用真菌。蛹虫草富含虫草素[1]、多糖[2]等具有抗癌、抗肿瘤[3]、抗光老化功效的生物活性物质[4,5]，且是目前已报道的350余种虫草属菌种中唯一能大量形成虫草素的物种。过往受制于寄生宿主数目的有限性和生长环境的特殊性，天然蛹虫草子实体是难以获得的。80年代末，人工培养蛹虫草获得成功[6]。其后经过40余年的发展，培养基组成、培养条件等参数得到完善[7,8]，静置菌丝体发酵、振荡菌丝体发酵、固体子实体培养等多种蛹虫草人工培养技术趋于成熟[9,10]。至2015年，我国蛹虫草大规模工厂化种植产量已达到7.4万吨[11]，并形成了全球75％的蛹虫草相关专利。

2、随着代谢工程与合成生物学的发展，基于天然合成代谢网络的自上而下的菌株改造研究已成为热点。近年来，以蛹虫草为材料的dna元件挖掘、基因编辑技术及基因组代谢模型的开发已取得一定程度的进步。这使得基于蛹虫草和虫草素为核心的代谢工程研究成为可能。但由于遗传背景和生长形态的复杂性，相对于大肠杆菌、酿酒酵母、米曲霉等模式微生物，食用菌的代谢工程与合成生物学研究进展相对缓慢。

3、dna元件的多样性是代谢工程与合成生物学研究的核心。启动子是基因表达的转录起始位点上游的一段序列，其自身强度和数量可显著影响下游基因表达水平。目前蛹虫草常用的启动子包括从u6小核糖核蛋白基因中发现组成型启动子pcmlsm3[12]、源自35s rna的组成型启动子pcamv[13,14]、从3-磷酸甘油醛脱氢酶基因中发现的组成型启动子pgpd[15]及3-吲哚-磷酸甘油合酶基因的组成型启动子ptrpc[16]。在表达强度方面，pcmlsm3、pcamv以及ptrpc等3种启动子属于中等强度启动子，而pgpd属于高强度启动子。在尺寸方面，ptrpc长度为369bp，pcmlsm3长度为547bp，pcamv长度为678bp，他们三者的的大小均远小于pgpd(1035bp)。在进行基因载体构建时，较小的启动子具有更好的便利性，更易被连入目标载体。目前蛹虫草存在已发掘的启动子种类少、尺寸大，且缺少基因表达强度的定量分析，难以对目标基因的表达水平进行精准调控。山东大学祁庆生课题组[17]曾报道在大肠杆菌中通过串联多个组成型启动子，最终实现了随着拷贝数增加而启动强度线性增强的大肠杆菌启动子文库。因此，构建蛹虫草重叠组成型启动子，有望实现蛹虫草中目标基因表达水平的精准调控。

技术实现思路

1、为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种蛹虫草ptrpc重叠启动子文库。

2、本发明的另一目的在于提供上述蛹虫草ptrpc重叠启动子文库的应用。

3、本发明的目的通过下述技术方案实现：

4、本发明提供一种蛹虫草ptrpc重叠启动子文库，由1个拷贝的ptrpc启动子、2个拷贝的ptrpc启动子、3个拷贝的ptrpc启动子、4个拷贝的ptrpc启动子、5个拷贝的ptrpc启动子、6个拷贝的ptrpc启动子、7个拷贝的ptrpc启动子、8个拷贝的ptrpc启动子、9个拷贝的ptrpc启动子组成。

5、优选的，所述的1个拷贝的ptrpc启动子、2个拷贝的ptrpc启动子、3个拷贝的ptrpc启动子、4个拷贝的ptrpc启动子、5个拷贝的ptrpc启动子、6个拷贝的ptrpc启动子、7个拷贝的ptrpc启动子具有依次增强的启动目的基因表达的强度；所述的7个拷贝的ptrpc启动子、8个拷贝的ptrpc启动子、9个拷贝的ptrpc启动子具有依次减弱的启动目的基因表达的强度。

6、进一步的，所述的2个拷贝的ptrpc启动子中每个拷贝之间的间隔小于等于100bp，较佳的小于等于50bp，再佳的为6～50bp，更佳的为6bp；3-9个拷贝的ptrpc启动子同理。

7、再进一步的，由seq id no：1、seq id no：2、seq id no：3、seq id no：4、seq idno：5、seq id no：6、seq id no：7、seq id no：8和seq id no：9所示的核苷酸序列的启动子组成。

8、本发明还提供一种载体，所述的载体含有1个拷贝的ptrpc启动子、2个拷贝的ptrpc启动子、3个拷贝的ptrpc启动子、4个拷贝的ptrpc启动子、5个拷贝的ptrpc启动子、6个拷贝的ptrpc启动子、7个拷贝的ptrpc启动子、8个拷贝的ptrpc启动子或9个拷贝的ptrpc启动子，作为启动子元件。

9、优选的，所述的载体含有seq id no：1、seq id no：2、seq id no：3、seq id no：4、seq id no：5、seq id no：6、seq id no：7、seq id no：8或seq id no：9所示的核苷酸序列，作为启动子元件。

10、优选的，所述的载体还含有与所述的启动子元件可操作地连接的目的基因。

11、进一步的，所述的目的基因包括(但不限于)：结构基因、编码具有特定功能的蛋白的基因、报告基因(如绿色荧光蛋白、荧光素酶基因或半乳糖苷酶基因lacz)。

12、再进一步的，所述的目的基因位于启动子元件的下游，且与所述启动子的间隔小于等于2000bp；较佳的小于等于1000bp；更佳地小于等于500bp，如小于等于200bp，小于等于100bp，小于等于50bp，6～50bp。

13、本发明还提供一种遗传工程化的重组菌株，所述的重组菌株：

14、含有所述的载体；或其基因组中整合有1个拷贝的ptrpc启动子、2个拷贝的ptrpc启动子、3个拷贝的ptrpc启动子、4个拷贝的ptrpc启动子、5个拷贝的ptrpc启动子、6个拷贝的ptrpc启动子、7个拷贝的ptrpc启动子、8个拷贝的ptrpc启动子或9个拷贝的ptrpc启动子的核酸。

15、优选的，或其基因组中整合有seq id no：1、seq id no：2、seq id no：3、seq idno：4、seq id no：5、seq id no：6、seq id no：7、seq id no：8或seq id no：9所述的核苷酸序列的核酸。

16、所述的重组菌株的宿主菌是蛹虫草。

17、本发明还提供一种上述蛹虫草ptrpc重叠启动子文库的应用，用于提供ptrpc重叠启动子，将所述ptrpc重叠启动子可操作性地与目的基因连接，调节目的基因的表达。

18、本发明还提供一种强启动子，为4个拷贝的ptrpc启动子、5个拷贝的ptrpc启动子、6个拷贝的ptrpc启动子或7个拷贝的ptrpc启动子。

19、优选的，所述的强启动子，为seq id no：4、seq id no：5、seq id no：6或seq idno：7所述的核苷酸序列。

20、上述强启动子在蛹虫草中表达蛋白中的应用。

21、上述载体或重组菌株在蛹虫草中表达蛋白中的应用。

22、本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

23、本发明选用了ptrpc这一强度适中、尺寸较小(369bp)的启动子，通过biobrick法构建了分别含有1-9个拷贝的ptrpc启动子组成的具有不同启动强度的重叠启动子文库，实现了随着启动子拷贝数增加而启动强度线性增强的启动子文库，为在蛹虫草中定量控制不同基因的表达水平比例奠定基础。