一株蚕沙来源的纤维素降解菌DC11及其筛选方法和应用

一株蚕沙来源的纤维素降解菌dc11及其筛选方法和应用
技术领域
1.本发明属于微生物学技术领域，涉及一种功能性菌株，具体为一株蚕沙来源的纤维素降解菌dc11及其筛选方法和应用。


背景技术：

2.目前农业生产过程中产生的废弃物利用率极低，闲置状况严重，造成大量资源浪费和环境污染，农业废弃物已经成为最大的环境污染源之一。目前，农业废弃物资源化利用主要方式为堆肥发酵，但由于农业废弃物中存在着大量难降解的纤维素，严重限制了农业废弃物的堆肥效率。因此，加速纤维素的分解便成了农业废弃物快速充分腐熟资源化的关键。高产纤维素酶的功能菌株常作为外源微生物菌剂，用于高纤维农业废弃物的高效无害化处理，具有生态兼容性好、成本低、使用方便、无二次污染等优点，在高纤维素农业废弃物资源化和无害化处理领域具有天然的优势，备受重视和期待。许多微生物包括许多细菌、真菌和放线菌都有产纤维素酶的能力。但目前获得的菌株其纤维素酶活力普遍较低，即使酶活力很高的菌株在后续培养时也存在不稳定的现象。因此，从不同环境中筛选高效纤维素酶活力的菌株，并进一步开发成高效纤维素降解微生物菌剂仍然是人们努力的目标。
3.蚕沙，又名原蚕沙、原蚕屎、晚蚕沙、马鸣肝、晚蚕矢，是养蚕过程中由蚕的幼虫所排泄的固体粪便和食剩的残桑的统称。蚕沙是一种富含粗蛋白和碳水化合物的多组分物质。长期以来，蚕沙一般多直接用作农田肥料或被丢弃，随意丢弃的蚕沙废弃物因富含纤维素，降解缓慢，降解周期甚至长达数年。干蚕沙中含粗蛋白15.4％，粗脂肪3.88％，粗纤维含量更是高达19.6％，属于典型的高纤维素农业废弃物资源。大量研究表明，从富含纤维素的废弃物环境中分离降解纤维素的功能菌能显著提高纤维素废弃物堆肥转化效率。刘鹏等人将从泰山林地腐殖土中筛选到的纤维素降解菌c2菌株接种到蚕沙中进行堆肥腐熟试验，结果表明，蚕沙堆肥添加c2菌株能加快蚕沙的腐熟进程，提高堆肥的质量。岑贞陆等对蚕沙堆肥中可培养微生物菌群进行分离，结果发现，50℃下蚕沙堆肥中可培养纤维素降解菌群中细菌为优势菌群，同时证明放线菌t-1菌株具有最好的产纤维素酶条件，可作为微生物菌剂用于蚕沙堆肥处理。因此，筛选和分离高产纤维素酶的功能菌，尤其是从富含纤维素的废弃物环境中筛选分离降解纤维素的功能菌，通过对其纤维素降解能力和生物学特性测定，旨在获得能够高效、快速降解纤维素的优良菌种，对富含纤维素的农业废弃物的无害化处理微生物菌剂的研发及高效资源化循环利用具有重要意义。


技术实现要素：

4.解决的技术问题：为了克服现有技术的不足，本研究旨在从中国农业科学院蚕业研究所桑蚕基地的蚕沙化粪坑内采集的蚕沙样品中，分离筛选出可降解纤维素的菌株，并通过酶活性测定，筛选出纤维素降解能力高、易于培养和繁殖的优势菌株，为农作物秸秆、经济作物与药用植物废弃物等农业废弃物的资源化循环再利用提供有效的技术支撑。鉴于此，本发明提供了一株蚕沙来源的纤维素降解菌dc11及其筛选方法和应用。
5.技术方案：一株产纤维素酶的枯草芽孢杆菌dc11，所述枯草芽孢杆菌dc11是从蚕沙中分离、纯化获得，分类命名为枯草芽孢杆菌dc11 bacillus subtilis dc11，保藏编号为cgmcc no.23618，保藏日期为2021年10月18日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地点为中国北京。
6.优选的，所述枯草芽孢杆菌dc11为革兰氏阳性杆菌，有芽孢，无荚膜，周生鞭毛，能运动；菌落表面粗糙不透明，菌落单独或连接片状，菌落颜色为污白色或微黄色，菌落边缘完整。
7.优选的，所述枯草芽孢杆菌dc11为兼性厌氧菌株，在48h内该菌株的纤维素内切酶(cmcase)酶活为24.27iu/ml，纤维素外切酶(cx)活力为26.34iu/ml，滤纸总纤维素酶(fpase)活力37.87iu/ml。
8.以上任一所述产纤维素酶的枯草芽孢杆菌dc11的筛选方法，所述方法包括以下步骤：
9.s1、初筛
10.以牛肉膏蛋白胨和cmc-na为基质，采用cmc-na刚果红培养基法和赫奇逊滤纸崩解法对分离的菌种进行纤维素降解能力测定，通过比较各细菌透明水解圈与菌落直径的比值和滤纸崩解程度初步筛选出高产纤维素酶的菌株；
11.s2、复筛
12.通过测定初筛菌株中纤维素内切酶、滤纸酶及纤维素外切酶三种酶系的酶活，并将这三种酶活力叠加进行大小比较，对初筛的菌株进一步筛选；
13.s3、纯化
14.挑取经复筛后的单个菌落，点种于初筛培养基上，在37℃连续划线培养3次，挑取生长状态良好的单个菌落，划线培养于cmc-na培养基上，经刚果红染色后，对有明显的透明圈的菌株进行革兰氏染色与镜检，观察细菌染色特性、形态特征的均一性，并进行编号。
15.以上任一所述产纤维素酶的枯草芽孢杆菌dc11在降解蚕沙废弃物中的应用。
16.以上任一所述产纤维素酶的枯草芽孢杆菌dc11在富含纤维素的农作物秸秆发酵再利用中的应用。
17.以上任一所述产纤维素酶的枯草芽孢杆菌dc11在药用植物废弃物发酵再利用中的应用。
18.以上任一所述产纤维素酶的枯草芽孢杆菌dc11在经济作物废弃物发酵再利用中的应用。
19.以上任一所述产纤维素酶的枯草芽孢杆菌dc11在木质纤维素转化为生物乙醇中的应用。
20.有益效果：(1)本发明所述枯草芽孢杆菌dc11在产纤维素酶、酶活性及生长性能方面都有很大优势；其在48h内该菌株的纤维素内切酶(cmcase)酶活为24.27iu/ml，纤维素外切酶(cx)活力为26.34iu/ml，滤纸总纤维素酶(fpase)活力37.87iu/ml。(2)所述枯草芽孢杆菌dc11具有很高的生物多样性价值，在富含纤维素的农作物秸秆、经济作物与药用植物废弃物等农业废弃物再利用技术中的开发与应用存在进一步研究的科学价值。
附图说明
21.图1是本发明分离的菌株的透明水解圈；
22.图2是本发明分离菌株滤纸崩解电镜图；
23.图3是测纤维素酶的活力时的葡萄糖标准曲线；
24.图4是本发明的菌株发酵后的酶活力测定；
25.图5是本发明的菌株的16s rdna基因pcr扩增；其中1泳道为2000bp dna maker，2泳道菌株dc11；
26.图6是本发明的菌株的显微形态；
27.图7是菌株dc11系统进化树；
28.图8是dc11菌株生长曲线；
29.图9是不同接种量对本发明菌株三种纤维素酶活的影响。
具体实施方式
30.以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改和替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
31.实施例1
32.1材料与方法
33.1.1试验材料
34.所用蚕沙废弃物采集自江苏省镇江市中国农业科学院蚕业研究所桑蚕基地蚕沙化粪池，新鲜采集的蚕沙样品，置于4℃冰箱保存备用。
35.1.1.1主要试剂及仪器
36.lb琼脂培养基、营养肉汤基、细菌基因组dna试剂盒、细菌pcr试剂盒、革兰氏染色液均购于上海生工生物工程有限公司；羧甲基纤维素钠培养基(cmc-na)、羧甲基纤维素钠刚果红培养(cmc-na刚果红培养基)、刚果红购于上海生物工程有限公司；主要仪器有电子天平bsa124s(北京赛多利科学仪器有限公司)，培养箱gnp9270(上海精密实验设备有限公司)，生物安全柜hfsafe-1500(力康生物医疗科技有限公司)，电泳仪power pac universal(bio-rad)，紫外分光光度计shimadzu uv-2450型(日本岛津公司)，酶标仪spectramax i3(上海美谷分子仪器有限公司)，pcr仪genesy 96t型(西安天隆科技有限公司)。
37.1.2实验方法
38.1.2.1菌株富集初筛
39.称取5g蚕沙化粪池样品加入到100ml以羧甲基纤维素钠为唯一碳源的cmc液体培养基中，置于摇床中，30℃，180r/min振荡培养6天。6天之后将培养液以10％接种到相同的液体培养基中，继续培养。3次富集培养之后，将菌液分别稀释至10-3
、10-4
、10-5
，划线培养于牛肉膏蛋白胨固体培养基中，每个稀释梯度做3个平行试验。涂布后的固体平板分别放入37℃恒温培养箱，倒置培养72h，观察细菌的生长状况，挑取颜色、形态不相同、生长状态良好的菌株进一步复筛。
40.1.2.2菌株复筛
41.将挑选得到的纯培养菌落在cmc-na固体培养基划线，在37℃培养24h，然后挑取单
个菌落点种于cmc-na刚果红固体平板上，每个平板点种3株菌株，并做3个平行试验。分别测量透明水解圈直径(d)和菌落直径(d),并计算每种菌株的d/d比值。
42.赫奇逊滤纸崩解实验作为刚果红培养基复筛后的验证方法，观察菌株对于滤纸的崩解能力。将初筛后的菌株的孢子悬浮液离心并使用1
×
m9缓冲液重悬洗涤两次后，接种到以滤纸(无淀粉滤纸，2
×
5cm，三条/瓶)为唯一碳源的培养液中，以加灭活菌液为控制组，37℃，200rpm振荡培养。每24h观察记录滤纸的崩解情况。将崩解实验中部分滤纸碎片样品以及控制组中的完整滤纸用镊子取出，使用乙醇梯度脱水法制样，即用浓度逐渐增加(体积分数为20％逐渐增加至100％)的乙醇梯度脱水。脱水时间随体积分数的增加而减少，从开始的30min减少到3～4min。最后再将其冷冻干燥24h后，喷金制样，使用场发射扫描电镜(fe-sem)观察滤纸表面形貌变化。
43.最后，挑选菌落周围有明显透明水解圈的菌株和滤纸崩解明显的菌株进行纯化。
44.1.2.3纯化
45.挑取经复筛后的单个菌落，点种于初筛培养基上，在37℃连续划线培养3次，挑取生长状态良好的单个菌落，划线培养于cmc-na培养基上，经刚果红染色后，对有明显的透明圈的菌株进行革兰氏染色与镜检，观察细菌染色特性、形态特征的均一性，并进行编号。
46.1.3纤维素酶活力测定
47.1.3.1粗酶液的制备
48.取每个纯化培养菌种，按10％的接菌量分别接种于装有100ml cmc-na液体发酵培养基、滤纸培养基和脱脂棉球培养基的锥形瓶中，37℃，120r/min,恒温摇床震荡培养。48h后取发酵液2ml 10000r/min条件下离心5min去除菌体，取上清液即为粗酶液。
49.1.3.2葡萄糖标准曲线的绘制
50.表1葡萄糖标准曲线绘制
[0051][0052]
a.在25ml比色柱中使用50mm柠檬酸缓冲液配制一系列稀释的葡萄糖标准溶液。
[0053]
b.在每个标准葡萄糖溶液中加入dns试剂3ml，搅拌均匀。
[0054]
c.放入沸水中，保持反应10分钟。将所有比色柱放入自来水中，冷却至室温。用去离子水将反应混合物稀释至25ml，混匀。
[0055]
d.每个样品吸取0.2ml至96孔板中，在a540 nm处测定吸光度(od)。
[0056]
e.以540nm下吸光度为横坐标，葡萄糖的含量(mg/ml)为纵坐标，绘制葡萄糖标准曲线.1.3.3纤维素酶活力的测定
[0057]
以灭活的粗酶液作为对照，采用dns法分别检测纤维素内切葡聚糖酶(cmcase)、滤纸酶(fpa)、纤维素外切葡聚糖酶(cx)活力。三种酶酶活测定方法如下。
[0058]
1.3.3.1纤维素内切酶(cmcase)酶活的测定:
[0059]
取1ml上清液(粗酶液)与1ml，1％，cmc-na(ph 4.5)底物于50℃水浴反应60min，用dns法测定其反应后体系产生的还原糖含量。以灭活后的酶为空白对照，计算cmcase活力。定义在测定条件下，每分钟产生1μmol葡萄糖的酶量为1u。
[0060]
1.3.3.2滤纸酶活(fpase)的测定:
[0061]
取1ml上清液(粗酶液)，加入0.1g经打孔准备好的滤纸片，加入1ml ph 4.5缓冲液于50℃水浴反应60min，用dns法测定其反应后体系产生的还原糖含量。以灭活后的酶为空白对照，计算fpase活力。定义在测定条件下，每分钟产生1μmol葡萄糖的酶量为1u。1.3.3.3纤维素外切酶(cx)酶活的测定:
[0062]
取1ml上清液(粗酶液)与1ml，1％，avicelase(ph 4.5)底物于50℃水浴反应60min，用dns法测定其反应后体系产生的还原糖含量。以灭活后的酶为空白对照，计算cx活力。定义在测定条件下，每分钟产生1μmol葡萄糖的酶量为1u。
[0063]
酶活定义：在一定温度及ph条件下，1min使底物生成1μmol葡萄糖所需的酶量为一个酶活单位，以u/ml表示。
[0064]
酶活力计算公式：酶活力(u)＝还原糖的量
×
稀释倍数
×
1000/酶用量(ml)
×
反应时间1000－酶活单位转换因子
[0065]
1.3.4菌株生长曲线的测定
[0066]
将dc11菌株在100ml cmc-na液体培养基中以1％接菌量，将纯化后的菌株传代4次后，在37℃条件培养，每隔8h测定菌液od 600nm，连续测定48h，每组设置3个平行，绘制菌株生长曲线，如图8所示。
[0067]
1.4纤维素降解菌种类鉴定
[0068]
1.4.1菌株形态学特征及生化鉴定
[0069]
将待测菌株接种于lb固体平板上，形态学观察、生理生化试验及生长特性测定参照bergey’s manual of dterminative bacteriology进行鉴定。
[0070]
1.4.2分子生物学鉴定
[0071]
由于同一种、属间细菌的16s rdna序列直接具有高度的保守性，所以16s rdna序列的同源性分析通常被用作细菌之间的系统分类。以菌株的总dna为模板，采用pcr技术对分离筛选的纤维素降解菌纯培养菌株进行16s rdna序列扩增，扩增引物采取通用引物：seq id no:1，27f(5
’‑
agagtttgatcctggctcag-3’)和seq id no:2，1492r(5
’‑
taccttgttacgactt-3’)。总反应体积为50μl，模板dna为2.0μl，pcr premix 25μl，forward premix 1.0μl，reverse primer 1.0μl，ddh2o 21μl。pcr扩增条件为94℃预变性3min，94℃变性30s，55℃退火20s，72℃复性1.5min，32个循环；最后在72℃下延伸5min。扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，紫外灯下采集图片。将扩增产物置于-20℃下保存，送上海生工基因测序公司检测。测序结果在genbank数据库中进行blast同源性比较，根据序列分析结果构建系统发育树进行菌种鉴定。该菌株16s rdna序列为seq id no:3，gcatgcgcagctataatgcagtcgagcggaagatgggagcttgctccctgatgttagcggcggacgggtgagtaacacgtgggtaacctgcctgtaagactgggataactccgggaaaccggggctaataccggatggttgtttgaaccgcatggttcaaacataaaaggtggcttcggctaccacttacagatggacccgcggcgcattagctagttggtgaggtaacggctcaccaaggcaacgatgcgtagccgacctgagagggtgatcggccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagca
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[0072]
1.5不同接种量对dc11菌株三种纤维素酶活的影响
[0073]
100ml三角瓶，装入20ml液体培养基,分别按1％，2％，3％，4％，5％，6％的接种量接种，37℃,200r/min摇振培养20h，测定纤维素内切葡聚糖酶(cmcase)、滤纸酶(fpa)、纤维素外切葡聚糖酶(cx)活力。
[0074]
2结果与分析
[0075]
2.1纤维素降解菌的筛选
[0076]
采用cmc-na培养基，牛肉膏蛋白胨培养基和lb培养基3种培养基，在37℃有氧条件下对蚕沙废弃物进行菌株初筛，选择生长状态良好的6株细菌，分别测量菌株透明水解圈与菌落直径的比值(d/d)比值，将分离出的细菌依次命名，结果如表2所示，由表可知dc11所产生的透明圈d/d最大，说明该菌株纤维素降解能力最强。图1为dc11刚果红染色后的结果，由图可知该菌株在cmc-na培养基上有明显的水解圈。图2为该菌株处理后的滤纸崩解电镜图，由图可知，滤纸表面纤维素结构被显著破坏，综上可知，新分离菌株dc11具有较强的纤维素降解能力。
[0077]
表2蚕沙纤维素降解菌菌落透明圈特征
[0078][0079]
2.2纤维素酶活力测定标准曲线
[0080]
如图3所示，根据dns法制作葡萄糖标准曲线，所得标准曲线的线性方程为y＝
[0081]
0.5996x-0.08676，相关系数r2为0.9965，线性相关度好，可用作分离出的蚕沙纤维素降解菌的纤维素酶活力测定。
[0082]
2.3酶活力测定
[0083]
将蚕沙废弃物中分离筛选出的6株菌株分别接种到cmc-na液体发酵培养基中，在37℃，150rpm条件下培养，分别在48h测定纤维素内切酶(cmcase)、滤纸酶活(fpa)及外切酶活(cx)，并依据酶活大小进一步筛选。由图4可知：dc11菌株的cmcase酶活为24.27u/ml，滤纸酶活(fpa)为37.87u/ml，cx酶活为和26.34u/ml，该菌株三种纤维素酶活力均较强，表明该菌株纤维素酶系能起到较强的协同作用，综上分析可知:同一菌株底物不同，3种酶活力也不同，不同菌株之间的酶活力也存在显著的差异。
[0084]
2.3蚕沙纤维素降解菌菌株鉴定
[0085]
2.3.1菌株形态及生化实验鉴定
[0086]
将分离纯化出的单一菌落涂片，在酒精灯上固定，进行革兰氏染色，经鉴定dc11为革兰氏阳性杆菌，结果如图6所示。
[0087]
表3 dc11菌株生化鉴定
[0088][0089]
对dc11的生化特性进行分析与鉴定,结果如表3所示，参考《伯杰氏系统细菌学手
册》，初步判断dc11为芽孢杆菌科芽孢杆菌属(bacillus)。
[0090]
2.3.2降解菌16s rdna的pcr扩增及系统发育树的构建
[0091]
提取dc11菌株的dna，采用细菌通用引物27f和1492r扩增16srdna基因，目的片段大小在1500bp左右，扩增结果如图5所示。将克隆得到的菌株16s rdna基因扩增产物进行测序，在ncbi数据库中进行blast比对，构建系统进化树，结果如图7显示，在genbank中将所获得序列的同源性较高菌株进行比较，可知dc11与来源于芽孢杆菌属的基因序列，同源性大于95％，dc11菌株与bacillus subtills gx s-15同源性高达96％。
[0092]
2.3.3蚕沙纤维素降解菌菌株dc11降解性能
[0093]
由图9可知不同接种量对dc11纤维素内切酶(cmcase)、滤纸酶活(fpa)及纤维素外切酶活(cx)均有一定影响，其中dc11最适接种量为2％。
[0094]
目前，已有多种降解纤维素的菌株被国内外研究人员从不同环境中筛选出，虽然大多数菌株能够降解纤维素，但是，在通常情况下这些降解菌的降解效率都不是很高。本实验筛选出的降解纤维素菌株dc11具有很好的纤维素内切酶(cmcase)、滤纸酶活(fpa)及纤维素外切酶活活力(cx)，与降解纤维效果不好的菌株相比，具有明显的降解优势和实际价值。所以，降解纤维素菌株dc11是一种重要的降解纤维素的菌株。本实验通过富集培养法，通过羧甲基纤维素钠培养基分离筛选出菌株dc-11，该菌株dc-11分泌的与纤维素降解相关的酶活力均较强。根据生理生化鉴定和16s rdna序列分析，将菌株鉴定为bacillus subtilis dc-11，保藏编号：cgmcc no.23618。目前，现有技术中纤维素酶的应用相对成熟，纤维素降解菌最大的差别在其产酶特性，有的菌酶活高，有的菌酶活低。酶活高的菌株属于高产纤维素酶，应用价值也更大，本技术分离的菌株经产酶特性及酶活表征，可以确定其相较于现有技术中的纤维素酶具有更大的应用价值。