一种SARS-CoV-2细菌样颗粒及其在疫苗中的应用

一种sars-cov-2细菌样颗粒及其在疫苗中的应用
技术领域
1.本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种sars-cov-2rbd细菌样颗粒及其在疫苗中的应用。


背景技术：

2.新型冠状病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，sars-cov-2)是一种有囊膜的正链rna病毒，基因组在已知的rna病毒中最大，约30 000个核苷酸组成，病毒基因组rna与核蛋白构成螺旋对称的核衣壳，核衣壳外是脂质双层的病毒包膜，包膜中镶嵌着三种蛋白质：刺突蛋白(spike，s)、膜蛋白(membrane，m)和包膜蛋白(envelope，e)。
3.在sars-cov-2的病毒颗粒结构中，s蛋白为高糖基化蛋白，以三聚体形式在病毒颗粒表面形成特殊皇冠结构，其由1160～1400个氨基酸构成，包含21～35个n端糖基化位点，具有受体结合活性及膜融合活性，与病毒感染及致病密切相关。在宿主细胞蛋白酶的作用下，s蛋白会被裂解成s1及s2两部分。s蛋白主要通过位于s1亚单位的受体结合域(receptor-binding domain，rbd)与宿主细胞表面的血管紧张素转换酶2(angiotensin converting enzyme 2，ace2)受体结合，这也是sars-cov-2跨物种传播到人，并发生人与人之间的传播的主要原因。而s2主要介导病毒包膜与细胞膜或内体膜融合使病毒核衣壳进入细胞质。由于s蛋白全长有可能引起(antibody-dependent enhancement,ade)效应，而s1蛋白rbd区域能诱导机体产生强大的中和抗体反应。
4.因此，sars-cov-2疫苗设计的焦点主要是针rbd蛋白展开的。sars-cov-2感染人可引起新型冠状病毒肺炎(covid-19)，目前没有有效的药物治疗，抵御该病毒感染最有效的方式是接种疫苗。
5.目前，全球多家疫苗生产企业加入到sars-cov-2疫苗的研发中，截至6月16日，根据nyt实时数据显示，全球范围内新冠疫苗的研发情况中，共有50款疫苗正在进行i期临床试验，ii期临床试验(36)，iii期临床试验(31)。此外，更有8款疫苗已在有限的范围内进行使用；8款疫苗进入正常使用范围。
6.然而，现有的疫苗并没有针对老年群体的研究，而老年人免疫系统的老化会使身体容易受到感染，并削弱其对疫苗的反应，进而增大感染率、传播率和死亡率。
7.新冠疫苗技术路线包括灭活疫苗、重组亚单位疫苗、病毒载体疫苗和核酸疫苗。其中重组亚单位疫苗包括单纯重组蛋白或纳米颗粒等不同形式，病毒载体疫苗有腺病毒载体、痘病毒载体、流感病毒载体等，核酸疫苗有dna疫苗、非复制型mrna疫苗和复制型mrna疫苗等。
8.gem-pa表面展示系统是一种新型蛋白表面展示系统，由革兰氏阳性菌增强基质(gram positive enhancer matrix，gem)和锚定蛋白分子(protein anchor，pa)组成。抗原蛋白通过pa展示到gem颗粒表面，可有效提高疫苗的免疫效果。该展示系统有以下几个特点：一、安全性高。食品级乳酸菌不含任何核酸物质，最大程度地减少了重组dna向环境和其
他生物传播的风险；二、抗原展示密度大，gem-pa可高密度地展示外源蛋白，其负载能力远远超过母本活菌，能够有效递送抗原物质诱导机体产生免疫应答；三、具有自体佐剂效应。gem-pa的主要成分是肽聚糖，为tlr2的配体之一，其通过激活tlr2信号通路，诱导宿主树突状细胞成熟，高表达cd80、cd40和mhc
‑ⅱ
等表面分子，成熟的dc细胞分泌炎性细胞因子，平衡th1和th2型免疫，激发更有效的免疫应答反应。四、黏膜递送效率高。gem颗粒大小约1μm，是黏膜表面m细胞摄入外源抗原的理想大小，可被位于鼻咽上皮组织和肠道的m细胞有效摄入并转运至抗原递呈细胞，能有效诱导抗原特异性th细胞、细胞毒性t淋巴细胞和iga分泌b细胞反应，启动局部黏膜和全身系统性免疫应答反应。
9.因此，本发明利用gem-pa表面展示技术，提出了一种安全性更高、免疫性能更好、适用范围更广泛的疫苗。


技术实现要素：

10.本发明的目的之一是，提供一种sars-cov-2细菌样颗粒，通过将rbv-rbd-linker-pa3融合蛋白展示到gem颗粒表面制备得到。
11.上述的sars-cov-2细菌样颗粒，linker的蛋白序列为(gly-gly-ser-gly)2。
12.上述的sars-cov-2细菌样颗粒，rbv-rbd-linker-pa3融合蛋白氨基酸序列如seq no1所示。
13.上述的sars-cov-2细菌样颗粒，rbv-rbd-linker-pa3融合蛋白利用昆虫-杆状病毒表达系统表达。
14.本发明的目的之二是，提供了上述的sars-cov-2细菌样颗粒在制备sars-cov-2疫苗中的应用。
15.本发明的目的之三是，提供一种sars-cov-2疫苗，包括上述的sars-cov-2细菌样颗粒。
16.上述的sars-cov-2疫苗，linker的蛋白序列为(gly-gly-ser-gly)2。
17.上述的sars-cov-2疫苗，sars-cov-2细菌样颗粒的氨基酸序列如seq no1所示。
18.上述的sars-cov-2疫苗，rbv-rbd-linker-pa3融合蛋白利用昆虫-杆状病毒表达系统表达。
19.本发明的目的之四是，提供了上述的sars-cov-2疫苗的制备方法，利用昆虫-杆状病毒表达系统表达rbv-rbd-linker-pa3融合蛋白，linker的蛋白序列为(gly-gly-ser-gly)2，将rbv-rbd-linker-pa3融合蛋白与gem颗粒混匀，经离心并洗涤后制备sars-cov-2细菌样颗粒，添加药学上可接受的佐剂制备成疫苗。
20.gem颗粒表面展示系统作为一种抗原蛋白新型展示系统，由革兰氏阳性菌增强基质和锚定蛋白组成。gem颗粒是乳酸乳球菌经酸煮沸处理后的肽聚糖骨架。乳酸乳球菌是一种世界公认的安全性很高的益生菌，在食物中已有很长时间的应用历史。相对于乳酸乳球菌，经酸煮沸处理后的gem颗粒，主要含有细胞壁肽聚糖，不含细胞壁的其他组分和细胞内物质，具有更高的安全性。gem颗粒可通过pa蛋白高亲和力和高密度的展示外原蛋白分子(105～106个抗原分子/gem颗粒)。除此之外，gem颗粒可以在室温条件下高效结合培养液中的融合蛋白，从而达到一步纯化外原蛋白的目的。
21.通过一段适当的核苷酸序列将不同的目的基因连接起来，使其在一定的蛋白表达
系统中表达成为一条单一的肽链，其中起连接作用的氨基酸称为linker。linker作为重组融合蛋白中重要组成部分，在保持融合蛋白的稳定性和生物学活性方面具有重要作用。融合蛋白中的两种成分能否分别形成正确的空间结构、更好的发挥生物学活性，与连接融合蛋白中两种成分的linker密切相关。通常将linker分为三种：柔性linker、刚性linker和可剪切性linker。当连接的融合蛋白之间需要一定的活动和相互作用的时候，常常选用柔性linker。柔性linker常常由小的、极性(如gly)或非极性(如ser或thr)氨基酸分子组成。这些小的氨基酸片段可为融合蛋白各个区域提供一定的灵活性。ser或thr的加入可通过与水分子形成氢键来维持linker在水溶液中的稳定性，从而降低linker与蛋白质部分之间的不利相互作用。最常用的柔性linker主要包含gly和ser残基(“gs”linker)。
22.在本方案中，pa是acma的c末端肽聚糖结合域的lysm，而acma是一种来自乳球菌的自溶素，本发明考虑既要保证pa在与gem颗粒结合的过程中保持最佳方位，又要保持sars-cov-2 rbd蛋白构像不被影响，从而保证其免疫原性。经过多次试验筛选，本发明选用柔性linker序列(gly-gly-ser-gly)2，使pa以非共价方式与gem颗粒结合。lysm的数量是决定融合蛋白结合活性的重要因素之一。在天然条件下，lysm结构域之间通常通过富含丝氨酸、天冬酰胺和苏氨酸的linker链接形成多价结构域，提高lysm的移动性和灵活性，从而提高其锚定活性。本发明在融合蛋白中添加linker(gly-gly-ser-gly)2来提高融合蛋白结合gem颗粒的结合活性和抗原蛋白的免疫原性，并利用昆虫-杆状病毒表达系统表达融合蛋白，将表达的融合蛋白与gem颗粒混匀，经离心并洗涤后制备sars-cov-2细菌样颗粒，实验证明融合蛋白均能成功展示到gem颗粒的表面。
23.此外，本发明选择两种老年小鼠balb/c和c57bl/6n来评价sars-cov-2细菌样颗粒疫苗的免疫反应性，分别设计sars-cov-2 bma8感染老年的balb/c小鼠模型和cma14感染老年的c57bl/6n小鼠模型，实验结果表明，blp疫苗诱导了抗bma8和c57ma14的中和抗体应答，可以100％保护老龄balb/c和c57bl/6n小鼠抵抗小鼠适应性sars-cov-2的攻击，为老年新冠疫苗的开发提供了新的思路。
附图说明
24.为了更清楚地说明本技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，还可以根据这些附图获得其他的附图。
25.图1为本发明实施例1提供融合蛋白模式图。
26.图2为本发明实施例2提供的处理前和处理后乳酸乳球菌。
27.图3为本发明实施例3提供的不同离心转速下结合颗粒sds-page结果。
28.图4为本发明实施例3提供的结合后gem颗粒sds-page结果。
29.图5为本发明实施例3提供的结合后gem颗粒间接免疫荧光结果。
30.图6为本发明实施例3提供的结合后gem颗粒薄层扫描结果。
31.图7为本发明实施例4提供的balb/c和c57bl/6n小鼠的免疫接种程序及攻毒时间图。
32.图8为本发明实施例4提供的balb/c组攻毒后小鼠体重变化。
33.图9为本发明实施例4提供的c57bl/6n组攻毒后小鼠体重变化。
34.图10为本发明实施例4提供的balb/c组攻毒后小鼠体温变化。
35.图11为本发明实施例4提供的c57bl/6n组攻毒后小鼠体温变化。
36.图12为本发明实施例4提供的balb/c组攻毒后小鼠血清中和抗体水平变化。
37.图13为本发明实施例4提供的c57bl/6n组攻毒后小鼠血清中和抗体水平变化。
38.图14为本发明实施例4提供的balb/c组攻毒后小鼠血清中和抗体水平。
39.图15为本发明实施例4提供的c57bl/6n组攻毒后小鼠血清中和抗体水平。
具体实施方式
40.为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面将结合实施例和附图对本发明作进一步的详细介绍。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
41.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
42.下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。sars-cov-2 bma和c57ma14毒株由sars-cov-2 wuhan01毒株(betacov/wuhan/amms01/2020)分别在balb/c和c57bl/6n鼠体内连续传代获得，dh5αe.coli感受态细胞购自takara；spodoptera frugiperda 9(sf9)昆虫细胞、乳酸乳球菌(lactoccouslactis mg1363)、pfastbac1载体、dh10bac
tm e.coli感受态细胞均由中国农业科学院长春兽医研究所动物病毒学与特种动物疫病学实验室保存。3000reagent购自thermo fisher；dmem和胎牛血清购自gibco公司；phusion超保真dna聚合酶和t4 dna连接酶购自neb公司；dna胶回收试剂盒和质粒小提试剂盒购自axygen。
43.实施例1重组杆状病毒的构建
44.1、引物设计
45.设计引物序列如表1所示，以质粒puc57-s和puc57-pa为模板，合成rbd-linker-pa3基因片段。
46.表1引物名称及序列
[0047][0048][0049]
注：1斜体加粗为酶切位点基因序列
[0050]
2基因序列画线为middle linker(gly-gly-ser-gly)2[0051]
3基因序列加粗为his-tag
[0052]
2、重组杆粒的构建
[0053]
选取sars-cov-2 rbd作为目的基因进行扩增，设计linker序列连接pa3，具体模式
图见图2选取sars-cov-2 rbd作为目的基因进行扩增，设计linker序列连接pa3，具体模式图见图1。
[0054]
具体方法为：将rbd-linker-pa3基因片段及pfastbac1-hbm载体分别用xba i和xho i进行双酶切，胶回收后连接过夜，转化dh5αe.coli感受态细胞，构建重组转移质粒pfastbac1-rbd-linker-pa3，涂板，揺菌并进行菌液pcr鉴定，提取质粒并进行酶切鉴定，送库美生物科技有限公司测序。
[0055]
重组转移质粒pfastbac1-rbd-linker-pa3经测序正确后，转化dh10bac
tm
e.coli感受态细胞，涂三抗板进行蓝白斑筛选，纯化后进行鉴定，鉴定正确后命名为rbacmid-rbd-linker-pa3。
[0056]
3、重组杆状病毒的拯救
[0057]
利用转染试剂lipofectamine 3000reagent将重组杆粒rbacmid-rbd-linker-pa3转染sf9细胞，具体步骤如下：将贴壁培养的sf9细胞，加入6孔细胞板，27℃培养过夜，待长至80％～90％汇合度时进行转染；将2.5μg重组杆粒dna和5μl的p3000加入到125μl不含双抗和血清的grace培养基中，轻轻混合均匀；将5μl的lipofectamine 3000reagent转染试剂加入125μl不含双抗和血清的grace培养基中，轻轻混合均匀；将杆粒和转染试剂轻轻混合，在室温条件下孵育20min，形成杆粒和脂质体复合物；用无双抗和血清的grace培养基把6孔板内细胞洗三遍，加入500μl的grace培养基，将杆粒和脂质体复合物分别逐滴加至6孔板内中，27℃，培养5h；培养基更换为完全培养基(10％fbs+1％双抗+grace培养基)，27℃，继续培养至肉眼可见细胞产生明显病变(约4～5天)；收获转染细胞上清，获得第1代重组杆状病毒并命名为rbv-rbd-linker-pa3。
[0058]
4、重组杆状病毒的鉴定
[0059]
传代培养rbv-rbd-linker杆状病毒，提取第3代病毒的基因组dna，以杆状病毒野毒为对照进行pcr扩增。将贴壁的sf9细胞传入24孔细胞板，密度长至80％～90％汇合度时，以3％体积比分别接种p3代rbv-rbd-linker-pa3和杆状病毒野毒，在27℃继续培养48h后进行间接免疫荧光检测。
[0060]
实施例2gem颗粒的制备与鉴定
[0061]
将乳酸乳球菌接种于gm17培养基中，30℃条件下，180rpm培养12～16h。经6 000rpm离心15min，弃上清，用10mm pbs溶液重悬沉淀，6 000rpm离心15min，弃上清，重复洗涤一遍。用0.2倍培养液体积的10％三氯乙酸溶液重悬沉淀，煮沸30min，6 000rpm离心15min，弃上清，沉淀用10mm pbs溶液充分震荡混匀3～5min，洗涤3次。最后用10mm pbs溶液充分混匀并调整颗粒密度，以每毫升含2.5
×
109个gem颗粒为1u。
[0062]
将乳酸乳球菌处理前和处理后颗粒分别在室温条件下，3000rpm离心10min，去掉上清，冷冻组织切片，经透射电镜观察处理前和处理后颗粒形态。
[0063]
结果显示：处理前乳酸乳球菌细胞质颜色较深，内容物较多(图2左)，处理后的乳酸乳球菌，细胞内容物少，且保持细菌的骨架和形态大小(图2右)，表明gem颗粒制备成功，-80℃保存备用。
[0064]
实施例3融合蛋白与gem颗粒的结合及鉴定
[0065]
1、融合蛋白与gem颗粒的结合
[0066]
取实验室制备的1u gem颗粒分别与10ml经悬浮培养的p4代rbv-rbd-linker-pa3
上清液在室温下进行震荡结合60min，结合后，在4℃条件下，6000g离心10min，用10mm的pbs洗涤3遍并命名为sars-cov-2 blp。
[0067]
2、sars-cov-2 blp的鉴定
[0068]
2.1、离心速度
[0069]
取实验室制备的1u gem颗粒分别与10ml经悬浮培养的p4代rbv-rbd-linker-pa3上清液在室温下进行震荡结合60min，结合后，取2ml结合后液体加入2ml ep管中，在4℃条件下，分别经500g，1 500g，2 500g，3 500g和4 500g条件下离心15min，用10mm的pbs洗涤1遍，经sdsp-page观察目的条带的颜色深浅，分析目的蛋白量。
[0070]
实验结果显示，结合后的颗粒在1 500g离心15min即可获得结合后颗粒。表明gem颗粒与培养上清液室温混合后，经低速离心即可(图3)。
[0071]
2.2、sds-page鉴定
[0072]
为确定rbv-rbd-linker-pa3融合蛋白是否展示在gem颗粒表面，在制备好的blp与gem颗粒中分别加入蛋白上样缓冲液，通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)进行鉴定。
[0073]
sds-page结果显示：与rbd-linker-pa3结合后的gem颗粒泳道有特异性条带，大小约为60kda左右，与目的蛋白大小一致(图4)。
[0074]
2.3、间接免疫荧光鉴定
[0075]
为进一步确定rbv-rbd-linker-pa3融合蛋白是否展示在gem颗粒表面，本研究以小鼠抗sars-cov-2 s蛋白的多克隆抗体为一抗进行间接免疫荧光鉴定和薄层扫描分析。
[0076]
间接免疫荧光实验结果显示：与rbd-linker-pa3结合后的gem颗粒组在荧光显微镜下可看到颗粒状的绿色荧光信号(图5)。
[0077]
薄层扫描结果显示，rbd-linker-pa3结合后的gem颗粒与gem颗粒相比，有一条单独的峰，其余峰两者之间基本吻合(图6)。以上实验结果表明融合蛋白能结合到gem颗粒的表面，sars-cov-2 blp构建成功。
[0078]
实施例4sars-cov-2细菌样颗粒疫苗对小鼠的保护效果评价
[0079]
balb/c和c57bl/6n小鼠的免疫接种程序及攻毒时间图7。9月龄雌性balb/c小鼠和c57bl/6n小鼠，每组10只，取10ug blp联合弗氏不完全佐剂(fia)免疫3次，间隔3周，pbs+fia作为阴性对照，分别在末次免疫后14天和sars-cov-2攻毒后7天采集血清，检测血清中病毒中和抗体。在小鼠第3次免疫后21天，分别用50ld
50
的sars-cov-2 bma8毒株和cma14毒株通过滴鼻方式感染两组小鼠，感染后每天监测各组小鼠的体重、体温变化及存活情况。
[0080]
结果显示：balb/c小鼠的体重和体温均未见异常，但c57bl/6n小鼠体重在攻毒后2～4天时出现轻微的下降，而后又恢复正常，对照组体重减轻(图8和图9)，并且体温降低并死亡(图10和图11)。sars-cov-blp免疫小鼠对两种sars-cov-2致死性病毒均有100％的保护作用(图12和13)。
[0081]
balb/c和c57bl/6n小鼠第3次加强免疫后2周采集小鼠血清，检测sars-cov-2中和抗体水平，检测结果显示：balb/c小鼠平均中和抗体效价达1：830(图14)，c57bl/6n小鼠平均中和抗体效价达1：338(图15)。
[0082]
实验结果表明，blp疫苗诱导了抗bma8和c57ma14的中和抗体应答，可以100％保护老龄balb/c和c57bl/6n小鼠抵抗小鼠适应性sars-cov-2的攻击。
[0083]
以上只通过说明的方式描述了本发明的某些示范性实施例，毋庸置疑，对于本领域的普通技术人员，在不偏离本发明的精神和范围的情况下，可以用各种不同的方式对所描述的实施例进行修正。因此，上述附图和描述在本质上是说明性的，不应理解为对本发明权利要求保护范围的限制。