与甘蓝型油菜每角果粒数相关的分子标记45400Indel及其应用

本发明属于分子生物学及遗传育种，具体涉及与甘蓝型油菜每角果粒数相关的分子标记45400indel及其应用。

背景技术：

1、甘蓝型油菜(brassica napus l.,aacc,2n＝38)是世界上仅次于大豆的第二大油料作物，我国油菜种植面积和总产均占全世界的三分之一(www.fao.org)。随着对植物油需求的不断增长和油菜生产面积的不断减少，培育高产油菜品种一直是油菜育种学家的重要目标之一。每角果粒数是油菜产量的重要决定因子，由胚珠起始及随后的胚珠/种子发育过程共同决定。每角果粒数与油菜产量通常呈极显著正相关，说明提高每角果粒数是提高油菜产量的有效途径。油菜产油收获指数与油菜的单株每角果粒数存在显著正相关，这也表明了提高油菜每角果粒数是实现收获指数提高的关键(卢坤等，2017)。同时种子数量是与植物适应性、进化和作物驯化改良密切相关的关键性状。油菜每角果粒数存在丰富的变异，但现有品种的每角果粒数(～20)远低于其在种质资源中的最大值(>40)(chen et al.,2012)，表明每角果粒数在油菜增产中的潜力尚未得到有效发挥。

2、每角果粒数涉及多个生物学过程，受多个生物因素的影响，比如子房中的胚珠数目，可育胚珠的比例，受精胚的比例，以及受精胚发育成种子的比例(li et al.,2015)。每角果粒数及其相关构成因子是典型的多基因控制的复杂数量性状，受环境条件的高度影响。近年来，jiao et al.(2021)等人利用qtl定位和gwas分析在油菜基因组的19条染色体上共鉴定了100多个与每角果粒数相关的qtl(radoev et al.,2008；shi et al.,2009；wang et al.,2010；zhang et al.,2010；ding et al.,2012；shi et al.,2013；cai etal.,2014；qi et al.,2014；fu et al.,2014；shi et al.,2015；lu et al.,2017；khan etal.,2019；xin et al.,2021；jiao et al.,2021)，其中只有4个(分别位于a1、a6、c1和c9染色体上)表现出主效，表型变异范围为23.5％～57.8％。其中主效qtl qsn.a6被成功定位在a6染色体上267kb的区域，对每角果粒数的增产作用为17.4％(yang et al.,2016)。目前，仅有c09上的一个与每角果粒数相关的主效qtl内的bnac9.smg7b基因被克隆，对每角果粒数的增产作用为58.7％(li et al.,2015)。因此，挖掘并克隆控制每角果粒数的基因、构建每角果粒数的分子调控网络，才能更好地理解油菜每角果粒数形成的生物学基础，才能对油菜产量和品质的改良提供理论支撑。

3、拟南芥作为模式植物，已有超过300个基因被报道调控每角果粒数，这些基因涉及胚囊发育、胚胎发育、胚珠发育、花粉发育、双受精等过程(yang et al.,2016)。基于甘蓝型油菜与拟南芥的近缘关系，这些基因被比对至油菜基因组(darmor)，得到大约900个每角果粒数调控基因的同源基因。然而，有两个问题阻碍了根据拟南芥的基因功能推测油菜基因功能的实施。首先，每个拟南芥基因在油菜基因组中大约有3到6个同源基因(parkin etal.,2005；levasseur and pontarotti,2011)，一些同源基因可能在进化过程中已经失活或经历了新功能化过程。此外，大约三分之一的拟南芥蛋白编码基因仍有待功能表征(wanget al.,2019)，因此仅利用基于与拟南芥的同源性推断它们在油菜中的功能存在较大风险。

4、近年来，一些重要农作物参考基因组先后被释放(bayer et al.,2017；chalhoubet al.,2014；liu et al.,2014；wang et al.,2011；sun et al.,2017)，为一些重要农艺性状在多组学水平上的研究创造了条件。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种油菜每角果粒数的主效qtl位点，应用于油菜每角果粒数的分子育种及遗传改良。

2、本发明的技术方案是甘蓝型油菜每角果粒数相关的分子标记45400indel，其核苷酸序列如seq id no.1和/或seq id no.2所示。

3、本发明还提供了扩增所述分子标记的引物对，其核苷酸序列如seq id no.3和seqid no.4所示。

4、本发明还提供所述分子标记或引物对在甘蓝型油菜育种中的用途。

5、进一步，所述用途为在预测或筛选不同每角果粒数的甘蓝型油菜中的用途。

6、具体的，所述用途为在改良甘蓝型油菜每角果粒数中的用途。

7、本发明还提供了采用所述分子标记预测或筛选不同每角果粒数的甘蓝型油菜的方法，包括如下步骤：以甘蓝型油菜的dna为模板，seq id no.3和seq id no.4所示引物对进行扩增；对扩增产物进行分离；出现seq id no.1和seq id no.2所示序列的为杂合基因型多粒植株，仅出现seq id no.1所述序列的为纯合基因型多粒植株，仅出现seq id no.2所述序列的为纯合基因型少粒植株。

8、本发明还提供了所述分子标记的获得方法，包括如下步骤：

9、(1)利用每角果粒数表型有极显著差异的油菜品种6q006(约40粒)和6w26(约15粒)杂交，杂种f1代加倍得到一个包含152个基因型的dh群体，f1代自交产生f2群体；

10、(2)在亲本和dh群体幼苗期取每个单株的叶片，进行全基因组油菜60k snp芯片测序，获得基因型数据；构建遗传连锁图谱；

11、(3)根据dh群体的遗传连锁图谱上的标记和每角果粒数性状的表型数据进行qtl定位，获得17个控制每角果粒数的qtl；其中位于c09连锁群上的qtl可以在不同环境中重复检测到，而且效应值和贡献率较大；

12、(4)选取dh群体中每角果粒数具有显著差异的株系组成两个极端混池进行基因组重测序，利用bsa分析缩小初步定位的qtl区间；

13、(5)对dh群体和f2群体中每角果粒数具有显著差异的株系的子房(开花后0天)、角果(开花后7)及种子(开花后14和21天)进行转录组测序，通过转录组分析预测候选基因；得到了2个仅在开花后14天和21天存在的差异表达基因bnac09g44500d和bnac09.apt5(bnac09g45400d)；

14、(6)差异表达基因bnac09g44500d和bnac09.apt5的序列分析表明在两亲本中bnac09g44500d的基因全长和启动子序列间均无差异，bnac09.apt5基因在启动子区域存在一个48bp的插入缺失突变；

15、(7)根据bnac09.apt5基因启动子区域的48bp序列差异设计了45400indel标记；其核苷酸序列如seq id no.1和/或seq id no.2所示。

16、本发明的申请人经过多年育种试验，筛选到一个每角果粒数约40粒的自交系6q006。利用该自交系与一个每角果粒数仅有15粒左右的品系6w26杂交，创建了dh群体。申请人利用芯片测序、基因组重测序、转录组测序等方法，定位到一个控制每角果粒数的主效qtl、对预测的候选基因进行了功能验证，并开发了一个与每角果粒数紧密连锁的功能标记，为甘蓝型油菜每角果粒数的遗传改良提供了新基因资源。

17、本发明的有益效果：本发明定位了与每角果粒数相关的主效qtl，并通过重测序分析和转录组分析等多组学方法，快速预测了与每角果粒数性状相关的候选基因。避免了利用高世代分离群体进行精细定位和图位克隆，节省了人力物力。本发明开发了与每角果粒数性状紧密连锁的分子标记，可以在苗期进行选择，不仅节约生产成本而且大大提高选择效率。每角果粒数表型受环境影响较大，通过该检测方法可以快速准确的筛选每角果粒数多的材料，且不受环境影响。