一株利用水稻秸秆糖化液生产菌体蛋白的优势酵母菌

1.本发明涉及一株利用水稻秸秆糖化液生产菌体蛋白的优势酵母菌，属于微生物发酵领域。


背景技术：

2.菌体蛋白(microbial protein)，也就是生物菌体蛋白，又称微生物蛋白或单细胞蛋白，是指酵母菌、真菌、霉菌、非致病性细菌等单细胞微生物体内所产生的菌体蛋白质。菌体蛋白不是仅含蛋白质的物质，它实际上是一种细胞质团，由蛋白质、脂肪、核酸、维生素、等混合物组成。这样的细胞质团营养丰富，以蛋白质和脂肪为主，其中蛋白质含量高达40％～ 60％，是解决我国蛋白质资源短缺的有效途径之一。目前，可用于生产菌体蛋白的微生物种类良多，其中酵母菌(yeast)具有丰富的酶系，生命力旺盛，生产菌体蛋白的能力很高。酵母菌含丰富的维生素，其蛋白含量高达60％，几乎含所有的氨基酸，其中赖氨酸、亮氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸等必需氨基酸的含量很高。
3.当下蛋白质资源十分匮乏，生产菌体蛋白成为一种显著解决蛋白质缺乏问题的有效方法。菌体蛋白应用较广泛，其主要用途有：生产饲料蛋白；用作食品；作为食品添加剂，改善食物风味；从菌体蛋白中提取辅酶a、细胞色素等医药产品，为其他领域提供有用之物。
4.农业废弃物可作为原料用于生产菌体蛋白，如水稻秸秆、玉米芯、玉米叶等。水稻秸秆是世界三大农作物秸秆之一，其中的纤维素的结构复杂，结晶结构多，以及纤维素、半纤维素和木质素之间的氢键作用，使得水稻秸秆纤维素难溶于水和有机溶剂。现实中水稻秸秆很难被降解利用，易造成环境污染和资源浪费的情况。因此，采用较温和的常压常温低碱浓度的预处理对纤维质生物资源进行一定的预处理，可使纤维素的酶解率增大，提高纤维素的利用率。通过纤维素酶酶解则可为微生物产菌体蛋白提供碳源，满足微生物的生长繁殖的营养需要。
5.水稻秸秆所降解得到的糖化液中糖类多样，主要是低聚糖，但也含有戊糖、己糖和纤维二糖的混合物，而大多数酵母菌只能利用几种糖原，无法对其充分地利用，并且其中还存在着可能抑制菌株生长的抑制因子，从而限制了其转化和利用。


技术实现要素：

6.本研究筛选了一株metschnikowia pulcherrima(已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：cctcc no:m 20211249)，属于非酿酒酵母，与常用于产单细胞蛋白的酿酒酵母和产阮假丝酵母相比，能够更充分利用秸秆糖化液所得的还原糖等，产生更多的菌体蛋白，从而使秸秆资源得到了充分的利用，既对保护环境作出了重大贡献，又生产出了菌体蛋白，具有社会效益和经济效益。本发明为了实现水稻秸秆的资源化利用，减少饲料蛋白的成本等，补充酵母菌所需的少量营养元素，筛选出了一株利用水稻秸秆糖化液生产菌体蛋白的优势酵母菌，具体筛选方法及发酵产菌体蛋白工艺包括以下步骤：
7.本发明提供了一株美极梅奇酵母菌(metschnikowia pulcherrima)，已于2021年
10月11 日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no：m 20211249。
8.本发明提供了含有权利要求1所述美极梅奇酵母菌的微生物菌剂。
9.本发明提供了一种生产菌体蛋白的方法，所述方法为将权利要求1所述美极梅奇酵母菌或权利要求2所述微生物菌剂加入含有水稻秸秆糖化液的反应体系中培养，培养结束后的菌体中即含有菌体蛋白。
10.在一种实施方式中，将菌浓为1.05
×
107～1.05
×
109cfu/ml的美极梅奇酵母菌按照反应体系体积的5％～15％添加。
11.优选地，按照13％～15％的量添加。
12.在一种实施方式中，所述反应体系中还含有kh2po4、mgso4.7h2o，并以尿素为氮源。
13.在一种实施方式中，所述kh2po4、mgso4.7h2o的含量分别为1g/l和0.5g/l。
14.在一种实施方式中，所述反应体系中尿素的含量为1～3g/l。
15.优选地，所述尿素的含量为2g/l。
16.在一种实施方式中，所述水稻秸秆糖化液按如下步骤制备：
17.(1)将水稻秸秆切成小段后烘干，利用体积分数为1.0％～1.5％的naoh溶液在50～60℃下处理秸秆小段25～35h，结束后用水清洗并烘干；
18.(2)利用步骤(1)处理后的秸秆配制成产糖培养基，向其中加入1～5％(v/v)的黑曲霉cicc 40273的种子液，发酵30-36h产酶，然后调节ph至4.5～5.0，向其中加入发酵 5d的粗酶液或是加入纤维素酶，在45～55℃酶解不少于1d；所述产糖培养基中含有 (nh4)2so
4 2g/l、kh2po
4 3g/l、mgso4·
7h2o 0.5g/l、体积分数为1％的微量元素液、体积分数为0.05％的吐温-80。
19.(3)将步骤(2)得到的反应液离心后取上清液，即为水稻秸秆糖化液。
20.在一种实施方式中，将所述黑曲霉cicc 40273发酵5d得到发酵液，所述发酵液中含有0.312iu/ml的fpa酶、0.542iu/ml的β-葡萄糖苷酶、0.316iu/ml的cmc酶。
21.在一种实施方式中，所述黑曲霉种子液是取活化后的黑曲霉接种至cmc-na种子培养基中，150rpm、28℃发酵24h得到。
22.在一种实施方式中，所述水稻秸秆糖化液中还原糖浓度为8-10g/l。
23.在一种实施方式中，反应体系中的ph为4.0～5.0。
24.优选地，ph为5.0。
25.在一种实施方式中，反应温度为26～28℃、转速为150～200rpm。
26.优选地，反应温度为28℃、转速为200rpm。
27.本发明提供了所述的美极梅奇酵母菌或所述微生物菌剂在生产菌体蛋白中的应用。
28.本发明的有益效果：
29.本发明筛选的美极梅奇酵母菌为食品级安全菌株，其本身对葡萄酒的生产和风味有重要的影响，其独特的抗菌特点，能够抑制不良酵母菌、真菌和霉菌对葡萄酒的污染。所述美极梅奇酵母菌在ph值3-8都能良好的生长，并且可利用多种单糖、二糖等，能够在含有生长抑制因子的水稻秸秆糖化液中正常生长，并能够利用普通产蛋白酵母菌所无法利用的单糖、二糖等，从而能够充分利用秸秆糖化液得到更多的菌体蛋白。
30.本发明提供的产菌体蛋白的方法所使用的原材料低廉，不仅提高了秸秆资源的利
用率，减少秸秆的焚烧，缓解其带来的环境污染等，同时该菌体蛋白降低了饲料蛋白成本，也在酿酒风味物质和水果拮抗等方面有较好的应用。有着良好的经济效益和社会应用前景。
31.生物材料保藏
32.本发明所提供的美极梅奇酵母菌，分类命名为metschnikowia pulcherrima 31，已于2021 年10月11日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no：m 20211249，保藏地址为中国.武汉.武汉大学。
附图说明
33.图1为产菌体蛋白初筛和复筛图；a和b分别为初筛和复筛。
34.图2为yeast 31菌落形态图。
35.图3为yeast 31基于26s rdna序列的系统发育树。
36.图4为美极梅奇酵母菌生长曲线(a)和对数生长期od
600nm
值与干重的关系(b)。
37.图5为不同氮源和不同尿素添加量对yeast 31产菌体蛋白的影响图。
38.图6为不同发酵条件对美极梅奇酵母菌产菌体蛋白的影响图。
具体实施方式
39.麦芽汁培养基：麦芽汁，0.2％氨苄青霉素钠，1％丙酸钠，琼脂2％，自然ph值，115℃灭菌15min。
40.酵母浸出粉胨葡萄糖(yeast extract peptone dextrose，yepd)液体培养基：葡萄糖2％，蛋白胨2％，酵母浸出粉1％，琼脂2％，蒸馏水l 000ml，自然ph值，121℃灭菌20min。
41.cmc-na种子培养基：羧甲基纤维素钠(cmc-na)10g、蛋白胨3g、kh2po
4 1g、 mgso4
·
7h2o 0.5g、葡萄糖0.5g、h2o 1000ml、ph自然。
42.水稻秸秆产糖培养基：(nh4)2so
4 2g、kh2po
4 3g、mgso4·
7h2o 0.5g、微量元素液10ml、吐温-80 0.5ml、h2o 1000ml、ph 5，另外添加水稻秸秆30-35g。
43.碳源同化培养基(质量体积比)：(nh4)2so
4 0.5％，mgso4.7h2o0.05％，kh2po
4 0.1％，酵母膏0.02％、碳源2％，蒸馏水1l；12l℃灭菌20min。
44.氮源同化培养基(质量体积比)：葡萄糖2％，mgso4.7h2o 0.05％，kh2po
4 0.1％，酵母膏0.02％、氮源2％，蒸馏水1l；12l℃灭菌20min。
45.0.1％诺维信纤维素酶购自诺维信生物技术有限公司，产品型号为cellic ctec3 hs。
46.酿酒酵母cicc 32236、产阮假丝酵母cicc 32834和黑曲霉cicc 40273，均购于中国工业微生物菌种保藏管理中心。
47.实施例1：菌株的筛选
48.1、菌株的分离筛选与鉴定
49.(1)酵母菌的分离筛选
50.将酿酒的夏黑葡萄捏碎，取100ml葡萄汁带皮，常温下过夜自然发酵24-48h。用纱布过滤葡萄汁发酵液，取50ml滤液，先稀释3倍，得到150ml稀释液。再采用十倍稀释平板法，
取1ml上述稀释溶液十倍稀释到合适倍数。将原稀释液和不同倍数的稀释液涂布在麦芽汁培养基平板上，28℃恒温培养1-2d。挑选45株单菌落酵母菌在yepd固体培养基中培养48h，转接几代划纯，制作斜面，4℃冷藏保存，备用。
51.(2)秸秆糖化液制备
52.水稻秸秆预处理：将田间收集的水稻秸秆用铡刀铡成1-3cm的小段烘干，备用。按照固液比1:10的量加入浓度为1.3％的naoh溶液、55℃处理水稻秸秆段30h，水洗烘干备用。
53.糖化液制备：
54.①
黑曲霉粗酶液制备：用接种环取1-2环活化后的黑曲霉cicc 40273于cmc-na种子培养基中，150rpm、28℃发酵24h得种子液，接种5％黑曲霉种子液至产糖培养基培养5d 发酵产酶，发酵结束后离心提取粗酶液并测定粗酶液中的成分，粗酶液中主要含有纤维素酶、木聚糖酶、果胶酶，其中fpa酶活为0.312iu/ml；β-葡萄糖苷酶活为0.542iu/ml、cmc酶活为0.316iu/ml。
55.②
用预处理后的秸秆段配制液态产糖培养基：接种5％黑曲霉种子液至水稻秸秆产糖培养基，250ml锥形瓶装液100ml，水稻秸秆3g，发酵产酶30-36h，用盐酸或氢氧化钠溶液调节ph至4.5-5.0，同时加入10ml发酵5d的粗酶液或10ml浓度为0.1％(w/v)诺维信纤维素酶液，升温至50℃酶解1d，取样离心取上清液，dns法于540nm测还原糖，得还原糖含量为8-10g/l的糖化液，即为水稻秸秆糖化液培养基。
56.(3)产菌体蛋白菌株的筛选
57.将前面筛选到的45株酵母菌和常用于产单细胞蛋白的酵母菌酿酒酵母cicc 32236和产阮假丝酵母cicc 32834，分别接种于水稻秸秆糖化液培养基中，发酵24h，测od比较其利用秸秆糖化液的能力。由图1a结果可知，选择初筛的生长快且好的五株菌株：16、25、31、 43、产朊假丝酵母进行复筛。
58.由图1b结果可知，yeast 31生长最好且菌体干重达到最大。说明此菌株相比常用的产蛋白菌株-产阮假丝酵母和酿酒酵母更适用于发酵秸秆糖化液产菌体蛋白。
59.(4)菌株的形态观察
60.将yeast 31在yepd固体培养基中划线后于28℃恒温培养箱中培养2d，取出观察菌株的菌落形态。如图2所示，该菌落表面光滑、湿润，菌落质地均匀，呈粉红色，后期颜色变淡，呈乳白色；菌落隆起，边缘十分圆整。制水浸片，在光学显微镜10
×
100下观察，从图中可以清晰地看出，该菌株呈椭圆形，有大大的液泡。经分析可得，该酵母菌的繁殖方式是通过出芽的方式进行无性繁殖。
61.(5)菌株的分子生物学鉴定
62.将上海派森诺生物科技股份有限公司反馈回来的测序结果-基因序列上传至ncbi网站进行比对分析，用mega-x以邻接法对菌株26s rdna基因序列进行系统发育分析，构建菌株的系统发育树(图3)。由结果可得，yeast 31与metschnikowia pulcherrima序列相似度最大为99.60％。经查阅资料(国家标准品网)，美极梅奇酵母菌属于梅奇酵母菌属，菌落呈圆形的突起的粉红色菌落，繁殖方式是通过多边芽殖的方式进行无性繁殖，不产生子囊孢子，与上面形态观察时的结论一致。最终确定31号酵母菌为美极梅奇酵母菌(metschnikowiapulcherrima)。将所述菌株送至中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：cctcc no:m20211249。
63.实施例2：美极梅奇酵母菌的性能
64.(1)糖类发酵试验
65.鉴定所需化合物共有7种，为葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、半乳糖、可溶性淀粉。按培养液的2％(2g/100ml)分别加入上述糖到糖发酵培养基中(成分与碳源同化培养基相同)，分装到试管，试管内倒置杜式小管一支。将活化后的酵母菌接入到上述培养基中，28℃培养1-2周，观察菌株生长状况，是否有气泡，有气泡记为阳性(+)，无气泡记为阴性(一)。
66.(2)碳源同化试验
67.碳源有13种：葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、半乳糖、纤维二糖、核糖、木糖、棉子糖、海藻糖、d-甘露糖、l-鼠李糖。将上述糖加入到碳源同化培养基中，糖含量为 2％(2g/100ml)。将活化后的酵母菌接入到上述培养基中，28℃条件下培养2-3d，观察是否浑浊并于od
600nm
下测吸光值，另以不接种任何糖源作空白对照。
68.(3)氮源同化试验：氮源有5种，为硝酸铵钠、硫铵、硝酸钾、亚硝酸钠、蛋白胨。将上述氮源加入到氮源同化培养基中，氮含量为2％(2g/100ml)。将活化后的酵母菌接入到上述培养基中，28℃条件下培养2-3d，观察是否浑浊并于od
600nm
下测吸光值，另以不接种任何氮源作空白对照。
69.表1酵母菌生理生化实验
[0070][0071]
结果分析：筛选得到的美极梅奇酵母菌除了能利用葡萄糖、果糖发酵产气外，还能利用蔗糖和可溶性淀粉发酵产气，不能利用乳糖、半乳糖和麦芽糖。在有氧条件下，能同化葡萄糖、果糖、半乳糖、蔗糖、麦芽糖、纤维二糖、海藻糖、木糖、棉子糖、d-甘露糖、l-鼠李糖、可溶性淀粉等12种碳源；不能同化乳糖和核糖；能同化利用尿素、(nh4)2so4、kno3、蛋白胨，不能同化亚nano3。该酵母菌能够利用除乳糖和核糖外的多种c5-c6单糖和二糖等为主的糖类物质，其利用的碳源较丰富。
[0072]
实施例3：美极梅奇酵母菌发酵水稻秸秆糖化液产菌体蛋白
[0073]
(1)菌体蛋白发酵实验
[0074]
培养基：菌体蛋白发酵糖化液培养基(初始)：kh2po
4 1g、(nh4)2so
4 1g、mgso4.7h2o0.5g、1000ml秸秆糖化液，ph 5。
[0075]
向菌体蛋白发酵糖化液培养基(初始)中，接种10％美极梅奇酵母菌(菌液的浓度为 1.05
×
108cfu/ml)，在28℃、150r/min发酵2d。
[0076]
结果分析：对美极梅奇酵母菌利用秸秆糖化液进行生长曲线的测定，确定后面实
验的初始发酵时间。由图4a可知，美极梅奇酵母菌在12-48h时为对数生长期，48h菌体生物量达到最大，48-60h为稳定期，60h后菌体开始死亡，od值降低，菌体干重也随之减小。酵母菌在对数期时，其在od
600nm
值与干重有较好的线性关系，见图4b，回归方程为： y＝0.4478x-0.3705，相关系数r2＝0.9973。同时由图4a可知随着酵母菌的生长，还原糖也随着减少。
[0077]
(2)美极梅奇酵母菌培养基优化
[0078]
培养基：菌体蛋白发酵糖化液培养基(初始)：kh2po
4 1g、(nh4)2so
4 1g、mgso4.7h2o0.5g、1000ml秸秆糖化液，ph 5。
[0079]
向菌体蛋白发酵糖化液培养基(初始)中添加不同的氮源，不同氮源有：硫酸铵、硝酸铵、氯化铵、尿素、蛋白胨、酵母浸粉，无机氮源添加0.1％，有机氮源添加0.05％；配制菌体蛋白发酵糖化液培养基，接种10％美极梅奇酵母菌(菌液的浓度为1.05
×
108cfu/ml)，在 28℃、150r/min发酵2d。
[0080]
结果分析：对不同氮源和其添加量进行优化，由图5可知，美极梅奇酵母菌利用尿素的效果最好，od和干重都达到最大，分别为10.316和4.8g/l，其次是酵母浸粉，考虑成本因素，选择尿素。由于前期实验残留有氮源等，所以不需要添加太多的氮源，当尿素添加量为 2g/l时，yeast 31生长效果最好，od
600
为10.8375，干重达4.85g/l。
[0081]
(3)美极梅奇酵母菌发酵条件优化
[0082]
培养基：菌体蛋白发酵糖化液培养基：kh2po
4 1g、mgso4.7h2o 0.5g、尿素2g、1000 ml秸秆糖化液，ph 5。
[0083]
a)单因素优化
[0084]
①
发酵时间的优化
[0085]
接种菌浓为1.05
×
108cfu/ml的菌株，按10％(v/v)的量向培养基中接种美极梅奇酵母菌，在28℃、150r/min发酵5d。
[0086]
发酵后每一天从发酵液中取样，检测发酵液的od
600
和菌体干重，结果如图6a所示，发酵时间为2d时，yeast 31生长达到稳定期，2-3d的od和干重基本没变化，之后进入衰退期， od和干重都有所下降，因此选择2d作为最优发酵时间，其od
600
为11.051，干重达4.78g/l。
[0087]
②
发酵温度的优化
[0088]
接种菌浓为1.05
×
108cfu/ml的菌株，按10％(v/v)的量向培养基中接种美极梅奇酵母菌，在不同温度26-36℃、150r/min发酵2d。
[0089]
由图6b可知，发酵温度在26-30℃时，od和干重基本没变化，30℃以后，随着温度的升高，不利于yeast 31的生长。由于实验环境和条件等，选择28℃作为后续实验发酵温度，其od
600nm
为10.927，干重达4.98g/l。
[0090]
③
发酵体系中ph的优化
[0091]
接种菌浓为1.05
×
108cfu/ml的菌株，按10％(v/v)的量向不同ph(3-8)培养基中接种美极梅奇酵母菌，在28℃、150r/min发酵2d。
[0092]
由图6c可知，不同ph对yeast 31有一定的影响，当ph在4-6范围内，酵母菌都适合生长，较低或较高生长都较差。由图可知，ph为5时，yeast 31生长快且菌体量达到最大，其 od
600nm
为10.774，干重达4.85g/l。
[0093]
④
发酵时菌株接种量的优化
[0094]
接种菌浓为1.05
×
108cfu/ml的菌株，按5％-15％(v/v)的量向培养基中接种美极梅奇酵母菌，在28℃、150r/min发酵2d。
[0095]
接种量的大小对微生物发酵有不同影响。由图6d可知，随着接种量的增大yeast 31生长越好，接种量在13％-15％时，菌体量达到最大，为获得更多的菌体蛋白同时考虑成本因素，选择13％作为后续发酵接种量。
[0096]
⑤
发酵时转速的优化
[0097]
接种菌浓为1.05
×
108cfu/ml的菌株，按10％(v/v)的量向培养基中接种美极梅奇酵母菌，在不同转速0-200r/min下、28℃发酵2d。
[0098]
转速控制着供氧量，从而影响微生物的生长。由图6e可知，随着转速的升高，yeast 31 生长越好，说明此菌更喜好氧环境。当转速达到180r/min时，酵母菌生长最好，选择180r/min 作为后续实验发酵温度转速。
[0099]
b)正交设计
[0100]
根据单因素实验结果，选择ph、转速和接种量三个因素进行正交试验设计，从而确定美极梅奇酵母菌发酵水稻秸秆糖化液的最优发酵条件。
[0101]
正交试验结果见表2和表3。由表2可知，分析r值得到三个因素对酵母菌发酵产蛋白的影响程度分别为a》b》c，再根据k值可以确定yeast 31最佳发酵条件的组合是a2b3c3，即最优发酵条件为ph 5、转速200r/min，接种量15％，此时yeast 31的干重最大，可达5.42g/l。由表3方差分析可知，整体模型极显著，a(ph)因素影响极显著，b(转速)和c(接种量) 两因素影响显著。
[0102]
表2正交试验结果及极差分析
[0103][0104]
表3方差分析
[0105][0106]
实施例4：含有美极梅奇酵母菌的微生物菌剂的制备
[0107]
取400μl的美极梅奇酵母菌接种于20ml ypd液体培养基中，28℃下活化2至3代，待美极梅奇酵母菌达到108cfu/ml以上活菌数时，5000～10000rpm下离心10～20min，去除上清液后，在无菌环境下依次加入缓冲液和冻干保护剂，待细胞浓度不低于106cfu/ml时，真空冷冻干燥处理得到固体菌剂。
[0108]
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。