鉴别或辅助鉴别番茄颈腐根腐病抗性的分子标记及其应用的制作方法

本发明涉及生物中鉴别或辅助鉴别番茄颈腐根腐病抗性的分子标记及其应用。

背景技术：

1、番茄颈腐根腐病(fusarium crown androot rot)是由死体营养型病原菌尖孢镰刀菌番茄颈腐根腐病专化型(fusarium oxysporum f.sp.radicis-lycopersici,forl)引起的一种毁灭性土传病害，可造成番茄减产65％以上甚至绝收。该病于20世纪70年代在日本被首次发现，随后蔓延至多个国家，目前已成为威胁番茄冬春生产的最严重病害之一。

2、frl是目前所知唯一的颈腐根腐病高抗基因，来源于野生秘鲁番茄(solanumperuvianum)。含有frl基因的番茄材料对forl的侵染表现接近免疫的高抗水平。前期在frl基因没有被克隆时，人们陆续开发了ubc#194、116、655和c2-25等与frl连锁较为紧密的分子标记用于其辅助选择(staniaszek,m.,szczechura,w.,and marczewski,w.2014.identification ofa new molecularmarker c2-25 linked to the fusariumoxysporum f.sp.radicis-lycopersici resistancefrlgene in tomato.czechj.genet.plant breed.50,285-287)。由于上述分子标记均为frl连锁分子标记，与frl基因有一定的遗传距离，因此利用这些分子标记对frl基因进行辅助选择存在准确率不高的问题。以育种上使用最多的c2-25为例，该分子标记辅助选择的确率为95.83％(刘蕾,王辉,李文丽,王富2018.与番茄颈腐根腐病抗病基因frl连锁的标记及应用.江苏农业科学46,91-93)。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是如何准确鉴定番茄颈腐根腐病抗性。

2、为了解决上述技术问题，本发明提供检测茄基因组中snp的多态性或基因型的物质在a1-a3中的任一种应用，所述snp为snp-frl60，位于frl基因的第60位，为seq id no.1的第229位核苷酸，其核苷酸种类为a或g；

3、a1、在鉴定或辅助鉴定番茄颈腐根腐病抗性中的应用；

4、a2、在制备鉴定或辅助鉴定番茄颈腐根腐病抗性产品中的应用；

5、a3、在番茄育种中的应用或在制备番茄育种产品中的应用。

6、番茄基因组中所述snp的基因型可为frl/frl、frl/frl或frl/frl。所述frl/frl是番茄基因组中所述snp为g的纯合型，所述frl/frl是番茄基因组中所述snp为a的纯合型，所述frl/frl是番茄基因组中所述snp为a和g的杂合型。基因型为frl/frl或frl/frl的待测番茄颈腐根腐病抗性高于或候选高于基因型为frl/frl的待测番茄颈腐根腐病的抗性。

7、上述应用中，所述物质为下述任一种：

8、d1)所述物质含有扩增包括所述snp在内的番茄基因组dna片段的pcr引物；

9、d2)所述物质为含有d1)所述pcr引物的pcr试剂；

10、d3)所述物质为含有d1)所述pcr引物或d2)所述pcr试剂的试剂盒；

11、d4)所述物质含有d1)所述pcr引物和限制性内切酶saci；

12、d5)所述物质为含有d2)所述pcr试剂和限制性内切酶saci的试剂。

13、上述应用中，所述pcr引物为p1和p2组成的引物对；所述p1为与seq id no.1所示的双链dna的第229位上游特异结合的单链dna；所述p2为与seq id no.1所示的双链dna的第229位下游特异结合的单链dna。

14、上述应用中，所述p1为seq id no.3所示的单链dna，所述p2为seq id no.4所示的单链dna。

15、上文中，所述检测番茄基因组中所述snp的多态性或基因型(即等位基因)的物质可为通过下述至少一种方法确定所述snp的多态性或基因型所需的试剂和/或仪器：dna测序、限制性酶切片段长度多态性、单链构象多态性、变性高效液相色谱和snp芯片。其中，snp芯片包括基于核酸杂交反应的芯片、基于单碱基延伸反应的芯片、基于等位基因特异性引物延伸反应的芯片、基于“一步法”反应的芯片、基于引物连接反应的芯片、基于限制性内切酶反应的芯片、基于蛋白dna结合反应的芯片，及基于荧光分子dna结合反应的芯片。

16、本发明还提供产品，所述产品含有所述检测番茄基因组中所述snp的多态性或基因型的物质，所述产品为c1)-c3)中任一种产品：

17、c1)检测与番茄抗颈腐根腐病相关的单核苷酸多态性或基因型的产品；

18、c2)鉴定或辅助鉴定番茄颈腐根腐病抗性的产品；

19、c3)用于番茄育种的产品。

20、本发明还提供检测番茄基因组中所述snp的多态性或基因型的方法。

21、本发明所提供的检测番茄基因组中所述snp的基因型的方法为如下ⅰ或ⅱ：

22、ⅰ、包括如下k1)和k2)：

23、k1)以待测番茄的基因组dna为模板，采用上述引物对进行pcr扩增得到pcr产物；

24、k2)检测步骤k1)得到的pcr产物，根据所述pcr产物确定待测番茄所述snp的基因型：

25、所述pcr产物对应seq id no.1第229位的核苷酸只为g的所述待测番茄的基因型为frl/frl；所述pcr产物对应seq id no.1第229位的核苷酸只为a的所述待测番茄的基因型为frl/frl；所述pcr产物对应seq id no.1第229位的核苷酸为g和a的所述待测番茄的基因型为frl/frl；

26、ⅱ、包括如下l1)和l2)：

27、l1)以待测番茄基因组dna为模板，采用p1和p2组成的引物对进行pcr扩增得到pcr产物；

28、l2)下述l21)或l22)：

29、l21)以saci酶切步骤l1)所得的pcr产物，检测酶切产物的大小，根据所述酶切产物的大小确定待测番茄所述snp的基因型：

30、所述酶切产物只为479bp的dna片段的所述待测番茄的基因型为frl/frl；所述酶切产物只为228bp的dna片段和247bp的dna片段的所述待测番茄的基因型为frl/frl；所述酶切产物为479bp的dna，228bp的dna片段和247bp的dna片段的所述待测番茄的基因型为frl/frl；

31、l22)检测步骤l1)得到的pcr产物的序列，根据所述序列确定待测番茄所述snp的基因型：

32、所述pcr产物对应seq id no.1第229位的核苷酸为g的所述待测番茄的基因型为frl/frl；所述pcr产物对应seq id no.1第229位的核苷酸为a的所所述待测番茄的基因型为frl/frl；所述pcr产物对应seq id no.1第229位的核苷酸为g和a的所述待测番茄的基因型为frl/frl。

33、本发明还提供鉴定或辅助鉴定番茄颈腐根腐病抗性的方法，包括以上述检测番茄基因组中所述的snp的基因型的方法检测待测番茄基因型，根据待测番茄的基因型鉴定或辅助鉴定番茄的颈腐根腐病抗性；基因型为frl/frl或frl/frl的待测番茄颈腐根腐病抗性高于或候选高于基因型为frl/frl的待测番茄颈腐根腐病的抗性。

34、本发明所要解决的另一个技术问题是如何进行番茄育种。

35、为了解决上述技术问题，本发明提供了番茄育种的方法，包括以上述检测番茄基因组中所述的snp的基因型的方法检测待测番茄基因型，选择基因型为frl/frl或frl/frl的番茄作为亲本进行育种。

36、本发明还提供所述引物对的下述a1-a3的任一种应用：

37、a1、在鉴定或辅助鉴定番茄颈腐根腐病抗性中的应用；

38、a2、在制备鉴定或辅助鉴定番茄颈腐根腐病抗性产品中的应用；

39、a3、在番茄育种中的应用或在制备番茄育种产品中的应用。

40、上述应用，所述番茄育种为培育抗颈腐根腐病番茄或选育抗颈腐根腐病番茄。

41、上文中，所述番茄可为凯文的自交后代。

42、本发明的一个实施例中，使用引物扩增包括snp-frl60位点在内的番茄基因组dna，以saci对反应产物进行酶切，酶切产物进行凝胶电泳确定了snp-frl60位点的核苷酸类型。实验证明，无论是针对5份商业番茄品种及其中一个商业品种的24份f2代后代组成的待测群体，还是针对1000份待测番茄组成的群体，使用本发明的引物对snp-frl60位点分型结果与表型抗性测定的结果均完全一致，准确率为100％，显著高于现有c2-25分子标记检测的准确率。说明本发明的引物对可以有效地检测snp-frl60位点的单核苷酸类型。其中snp-frl60位点为g的纯合型(基因型frl/frl)待测番茄品种和snp-frl60位点为g和a的杂合型(基因型frl/frl)待测番茄品种的颈腐根腐病抗性显著高于或候选高于snp-frl60位点为a的纯合型(基因型frl/frl)的待测番茄品种，说明snp-frl60是与番茄颈腐根腐病抗性相关的snp分子标记，可用于鉴定或辅助鉴定番茄颈腐根腐病抗性，可用于番茄颈腐根腐病抗性品种的筛选，可用于番茄分子标记辅助育种，可用于抗颈腐根腐病番茄的选育和培育。