一种利用具有pH响应型的聚合物固定化阿魏酸酯酶的方法

一种利用具有ph响应型的聚合物固定化阿魏酸酯酶的方法
技术领域
[0001][0002]
本发明涉及酶工程及材料科学技术领域，尤其涉及一种利用具有ph响应型的聚合物固定化阿魏酸酯酶的方法。


背景技术：

[0003][0004]
阿魏酸酯酶（ec3.1.1.73）又称为肉桂酸酯酶或肉桂酰酯酶，广泛存在于植物、微生物中，能够水解植物细胞壁中阿魏酸与阿拉伯木聚糖及果胶间的酯键，释放出阿魏酸或阿魏酸二聚体（具有抗血栓、降血脂、抗氧化和清除自由基等功能），被广泛应用于食品、造纸、饲料、化妆品、医药等领域。
[0005]
由于游离的阿魏酸酯酶价格昂贵且不能回收使用，增加了生产成本，使阿魏酸酯酶的大规模应用受到极大限制。对阿魏酸酯酶进行固定化是改善其催化性能、降低应用成本的关键。近些年来，随着材料科学的发展，各种应用前景广泛的新材料被用于阿魏酸酯酶的固定化。但是大部分研究是采用固定化阿魏酸酯酶在油水界面或微水相合成脂类物质。鲜有报道采用固定化阿魏酸酯酶在水相中的催化反应，究其原因阿魏酸酯酶通常用于降解含纤维素的固体底物，反应结束后难以实现固体底物与固定化酶的彻底分离。
[0006]
近些年出现的基于ph敏感型聚合物制备固定化酶的技术，则实现了固定化酶的均相催化和异相分离，并且在提高酶的稳定性的同时显著改善了酶的活性。该固定化酶技术是采用ph敏感型聚合物对ph敏感，可发生固-液态相变这一原理实现固定化酶的催化和分离。例如，燕杰善等人采用ph敏感型聚合物eudragit l-100固定化β-葡萄糖苷酶，由于载体表面含有大量羧酸基团，当ph＜4.5时，载体完全沉淀；当ph＞5.2时，载体完全溶解，采用ph敏感型聚合物eudragit l-100固定化β-葡萄糖苷酶保持了较高酶活力和稳定性（具体可见参考文献：燕杰善, 秦瑞霞, 李露. eudragit l-100固定β-葡萄糖苷酶的性能研究. 化工科技 2018, 26(3): 5-10.）。
[0007]
针对阿魏酸酯酶水相催化限制性因素（针对一般性载体，难以实现底物与固定化酶的彻底分离），本技术以ph敏感型聚合物eudragit l-100为载体固定化阿魏酸酯酶，制备了一种易于回收重复使用且催化性能优越的固定化阿魏酸酯酶。


技术实现要素：

[0008][0009]
针对现有技术中阿魏酸酯酶水相催化限制性因素，针对一般性载体，难以实现底物与固定化酶的彻底分离的不足，本发明公开了一种利用具有ph响应型的聚合物固定化阿魏酸酯酶的方法，本发明的目的在于提供一种固定化阿魏酸酯酶的技术，根据选用的载体材料eudragit l-100具有ph敏感性的特性，制备了一种易于回收重复使用且催化性能优越的固定化阿魏酸酯酶。
[0010]
本发明提出的一种利用具有ph响应型的聚合物固定化阿魏酸酯酶的方法，用
eudragit l-100固定化阿魏酸酯酶，包括如下步骤：第一步，酶的固定化：将eudragit l-100用蒸馏水溶解成0.5%（w/v）浓度的溶液，用3m的氢氧化钠将溶液ph调整为11，待完全溶解后，再用3m的盐酸将溶液ph调整为6，超声10 min，获得溶液；第二步：取10 ml第一步获得的溶液，称取1%(w/v)碳二亚胺与6u阿魏酸酯酶同时加入溶液中，30℃条件下150 rpm处理3小时，得到固定化酶溶液；第三步：用3m盐酸将固定化酶溶液ph调至4，再用高速离心机10000 rpm、4℃离心5分钟，取沉淀；第四步：用10 ml ph为4的柠檬酸pbs缓冲液洗涤后10000 rpm 4℃离心5分钟，取沉淀，用ph为6的pbs缓冲液保存固定化酶制得酶液；第五步，固定化酶条件优化：酶活检测；第六步：固定化酶ph优化：确保其它参数不变，在不同ph值的eudragit l-100溶液中固定化酶，确定最佳固定化酶ph；第七步，交联剂含量优化：确保其它参数不变，采用不同比例的交联剂碳二亚胺edc进行固定化酶，确定最佳交联剂添加含量；第八步，交联时间优化：确保其它参数不变，采用1-5h不同时间进行交联固定化酶，确定最佳交联时间；第九步，固定化温度优化：确保其它参数不变，在不同温度条件下进行固定化酶，确定最佳交联温度；第十步，最适ph值测定：分别配制ph为4、5、6、7、8、9的1mm阿魏酸甲酯溶液，将酶与底物分别40℃保温10分钟，取5%固定化酶与95%不同ph阿魏酸甲酯溶液反应5min，煮沸5min进行酶灭活，高效液相色谱检测阿魏酸含量；第十一步，ph稳定性测定：取5%第四步制得固定化酶分别溶解于ph为4、5、6、7、8、9的10%的100 mm的pbs缓冲液中，40℃保温1小时，加入95%的1mm阿魏酸甲酯溶液反应5min，煮沸5min进行酶灭活，高效液相色谱检测阿魏酸含量；第十二步，最适反应温度测定：取5%第四步制得固定化酶与95%的ph为6的1mm阿魏酸甲酯溶液在20、30、40、50、60℃下保温10min后反应5min，煮沸5min进行酶灭活，高效液相色谱进行检测阿魏酸含量；第十三步，热稳定性测定：将5%第四步制得固定化酶在20、30、40、50、60℃下保温1小时后在40℃下与95%的ph为6的1mm阿魏酸甲酯溶液反应5分钟，煮沸灭活5分钟，高效液相色谱检测阿魏酸含量。
[0011]
进一步的，利用具有ph响应型的聚合物固定化阿魏酸酯酶的方法还含有可重复使用性测定：以降解去淀粉麦麸产阿魏酸为模式反应，检测固定化阿魏酸酯酶可重复使用性能，在20 ml的麦麸溶液与固定化酶混合反应体系中，加入200 mg的麦麸与3.24 u的固定化酶进行反应，200 rpm，37℃培养12 h，调节反应体系ph为4回收固定化酶，并用ph为6磷酸盐缓冲液溶解后进行下一轮分解麦麸产阿魏酸实验，重复五次后根据产生阿魏酸的量计算酶活性。
[0012]
进一步的，所述ph为4的柠檬酸pbs缓冲液配制方法为385.5 ml 0.2m na2hpo4溶液与614.5 ml 0.1m柠檬酸溶液混合后，用柠檬酸微调ph值；ph为6的pbs缓冲液配制方法为
123ml 0.2m na2hpo4与877ml 0.2m nah2po4混合，用盐酸或氢氧化钠微调ph值。
[0013]
进一步的，所述第五步中固定化酶条件优化中酶活检测具体步骤为：1mm阿魏酸甲酯溶液40℃保温10 min后，取50μl酶液与950μl阿魏酸甲酯40℃反应5分钟，反应结束后煮沸5 min进行酶灭活，用高效液相色谱检测阿魏酸含量。
[0014]
进一步的，所述第六步中固定化ph优化具体步骤为：将活化好的0.5%的eudragit l-100用3m盐酸与氢氧化钠调整ph分别为5、6、7、8、9，加入edc（1% w/v），及6u阿魏酸酯酶溶液，30℃条件下150 rpm处理3h；固定化完成后用3m盐酸调整溶液ph为4，6000 rpm离心3min取沉淀，再用ph为4的100 mm pbs充分洗涤，6000 rpm离心3min取沉淀，再用ph为6的100 mm pbs保存固定化酶。
[0015]
进一步的，所述第七步中交联剂含量优化具体步骤为：将活化好的0.5%的eudragit l-100用3m盐酸调整ph为7，加入0%、0.5%、1%、2%、5%的edc，及6u阿魏酸酯酶溶液，30℃条件下150 rpm处理3h；固定化完成后用3m盐酸调整溶液ph为4，6000 rpm离心3min取沉淀，再用ph为4的100 mm pbs充分洗涤，6000 rpm离心3min取沉淀，再用ph为6的100 mm pbs保存固定化酶。
[0016]
进一步的，所述第八步中交联时间优化具体步骤为：将活化好的0.5%的eudragit l-100用3m盐酸调整ph为7，加入1%的edc，及6u阿魏酸酯酶溶液，30℃条件下150 rpm处理1-5h；固定化完成后用3m盐酸调整溶液ph为4，6000 rpm离心3min取沉淀，再用ph为4的100 mm pbs充分洗涤，6000 rpm离心3min取沉淀，再用ph为6的100 mm pbs保存固定化酶。
[0017]
进一步的，所述第九步中固定化温度优化具体步骤为：将活化好的0.5%的eudragit l-100用3m盐酸调整ph为7，加入1% edc，及6u阿魏酸酯酶溶液，分别于20、30、40、50、60℃进行固定化，150 rpm固定化2h；固定化完成后用3m盐酸调整溶液ph为4，6000 rpm离心3min取沉淀，再用ph为4的100 mm pbs充分洗涤，6000 rpm离心3min取沉淀，再用ph为6的100 mm pbs保存固定化酶。
[0018]
进一步的，所述第十步不同的ph值阿魏酸甲酯溶液配置方法是：0.0208g阿魏酸甲酯加入90ml蒸馏水中，调ph至4后定容至100ml，其他ph值阿魏酸甲酯溶液同样方法。
[0019]
进一步的，所述第十一步中不同的ph值缓冲液配制方法为，ph 5 pbs缓冲液：90ml ph 4柠檬酸pbs缓冲液用naoh溶液调整ph至5后定容至100ml；ph 7 pbs缓冲液：610ml 0.2m na2hpo4与390ml 0.2m nah2po4混合，用盐酸或氢氧化钠微调ph值；ph 8 pbs缓冲液：947ml 0.2m na2hpo4与5.3ml 0.2m nah2po4混合，用盐酸或氢氧化钠微调ph值；ph 9 pbs缓冲液：取90ml ph 8 pbs缓冲液，用氢氧化钠溶液调节ph至9,后定容至100ml。
[0020]
有益效果：本发明提供的一种利用具有ph响应型的聚合物固定化阿魏酸酯酶的方法和现有技术相比具有以下优点：1. 本发明提供了一种固定化阿魏酸酯酶的技术。将阿魏酸酯酶固定化在eudragit l-100上，与游离阿魏酸酯酶相比，使用本发明制备的固定化酶具有更高的热稳定性和ph稳定性；2. 在20-60℃时，固定化酶的热稳定性相较于游离酶都有所提升，相比于游离酶在60℃时10%左右的活性，固定化酶仍有85%以上活性；3. 在ph 4-9时，固定化酶的ph稳定性相较于游离酶都有所提升，当ph接近4时，游
离酶活性保留5%，而固定化酶仍能保持50%以上的活性。
附图说明
[0021][0022]
图1为固定化酶ph优化图；图2为固定化酶交联剂含量优化图；图3为固定化酶交联时间优化图；图4为固定化酶交联温度优化图；图5为固定化酶与游离酶最适ph比较图；图6为固定化酶与游离酶ph稳定性比较图；图7为固定化酶与游离酶最适温度比较图；图8为固定化酶与游离酶热稳定性比较图；图9为固定化酶可重复使用性图。
具体实施方式
[0023][0024]
以下举例具体实施例对本发明进行说明。需要指出的是，以下实施例只用于对本发明作进一步说明，不代表本发明的保护范围，其他人根据本发明的提示进行的非本质的修改和调整，仍属于本发明的保护范围。
[0025]
试剂材料：下述实施例中涉及的阿魏酸酯酶购至爱尔兰megazyme公司；下述实施例中涉及的eudragit l-100购至上海麦克林生化科技有限公司；下述实施例中涉及的碳二亚胺edc为1-乙基-3-（3-二甲氨丙基）碳二亚胺盐酸盐购至上海源叶生物科技有限公司。
[0026]
实施例1本实施例提供一种利用具有ph响应型的聚合物固定化阿魏酸酯酶的方法，具体步骤如下：第一步，酶的固定化：将eudragit l-100用蒸馏水溶解成0.5%（w/v）浓度的溶液，用3m的氢氧化钠将溶液ph调整为11，待完全溶解后，再用3m的盐酸将溶液ph调整为6，超声10 min，获得溶液；第二步：取10 ml第一步获得的溶液，称取1%(w/v)碳二亚胺与6u阿魏酸酯酶同时加入溶液中，30℃条件下150 rpm处理3小时，得到固定化酶溶液；第三步：用3m盐酸将固定化酶溶液ph调至4，再用高速离心机10000 rpm、4℃离心5分钟，取沉淀；第四步：用10 ml ph为4的pbs缓冲液（385.5 ml 0.2m na2hpo4溶液与614.5 ml 0.1m柠檬酸溶液混合后，用柠檬酸微调ph值）洗涤后10000 rpm4℃离心5分钟，取沉淀，用ph为6的pbs缓冲液（123ml 0.2m na2hpo4与877ml 0.2m nah2po4混合，用盐酸或氢氧化钠微调ph值）保存固定化酶；第五步，固定化酶条件优化，酶活检测：1mm阿魏酸甲酯溶液40℃保温10 min后，取50μl酶液与950μl阿魏酸甲酯40℃反应5分钟，反应结束后煮沸5 min进行酶灭活，用高效液
相色谱检测阿魏酸含量；第六步，固定化酶ph优化：确保其它参数不变，在不同ph值的eudragit l-100溶液固定化酶，确定最佳固定化酶ph：将活化好的0.5%的eudragit l-100用3m盐酸调整ph分别为5、6、7、8、9，加入edc（1% w/v），及6u阿魏酸酯酶溶液，30℃条件下150 rpm处理3h；固定化完成后用3m盐酸调整溶液ph为4，6000 rpm离心3min取沉淀，再用ph为4的100 mm pbs充分洗涤，6000 rpm离心3min取沉淀，再用ph为6的100 mm pbs保存固定化酶。由图1可知，在ph为7时，固定化酶有最高活性，因此确定固定化最佳ph为7；第七步，交联剂含量优化：确保其它参数不变，采用不同比例(0%-5%)的交联剂edc进行固定化酶，确定最佳交联剂添加含量：将活化好的0.5%的eudragit l-100用3m盐酸调整ph为7，加入0%、0.5%、1%、2%、5%的edc，及6u阿魏酸酯酶溶液，30℃条件下150 rpm处理3h；固定化完成后用3m盐酸调整溶液ph为4，6000 rpm/离心3min取沉淀，再用ph为4的100 mm pbs充分洗涤，6000 rpm离心3min取沉淀，再用ph为6的100 mm pbs保存固定化酶。由图2可知，在交联剂含量为1%时，固定化酶有最高活性，因此确定固定化最佳交联剂添加量为1%；第八步，交联时间优化：确保其它参数不变，采用1-5h不同时间进行交联固定化酶，确定最佳交联时间：将活化好的0.5%的eudragit l-100用3m盐酸调整ph为7，加入1%的edc，及6u阿魏酸酯酶溶液，30℃条件下150 rpm处理1-5h；固定化完成后用3m盐酸调整溶液ph为4，6000 rpm离心3min取沉淀，再用ph为4的100 mm pbs充分洗涤，6000 rpm离心3min取沉淀，再用ph为6的100 mm pbs保存固定化酶。由图3可知，在固定化交联时间为2h时，固定化酶有最高活性，因此确定固定化最佳交联时间为2h；第九步，固定化温度优化：确保其它参数不变，在不同温度条件（20-60℃）下进行固定化酶，确定最佳交联温度：将活化好的0.5%的eudragit l-100用3m盐酸调整ph为7，加入1% edc，及6u阿魏酸酯酶溶液，分别于20、30、40、50、60℃进行固定化，150 rpm固定化2h；固定化完成后用3m盐酸调整溶液ph为4，6000 rpm离心3min取沉淀，再用ph为4的100 mm pbs充分洗涤，6000 rpm离心3min取沉淀，再用ph为6的100 mm pbs保存固定化酶。由图4可知，在交联剂温度为30℃时，固定化酶有最高活性，因此确定固定化最佳温度为30℃；第十步，固定化酶酶学性质检测：最适ph值测定：分别配制ph为4、5、6、7、8、9的1mm阿魏酸甲酯溶液（0.0208g阿魏酸甲酯加入90ml蒸馏水中，调ph至4后定容至100ml，其他ph值阿魏酸甲酯溶液同样方法），将酶与底物分别40℃保温10分钟，取5%固定化酶与95%不同ph阿魏酸甲酯溶液反应5min，煮沸5min进行酶灭活，高效液相色谱检测阿魏酸含量。由图5可知，固定化酶的最适反应ph相比于游离酶由7改变为8；第十一步，ph稳定性测定：取5%第四步制得固定化酶分别溶解于ph为4、5、6、7、8、9（ph 5 pbs缓冲液：90ml ph 4柠檬酸pbs缓冲液用naoh溶液调整ph至5后定容至100ml；ph 7 pbs缓冲液：610ml 0.2m na2hpo4与390ml 0.2m nah2po4混合，用盐酸或氢氧化钠微调ph值；ph 8 pbs缓冲液：947ml 0.2m na2hpo4与5.3ml 0.2m nah2po4混合，用盐酸或氢氧化钠微调ph值；ph 9 pbs缓冲液：取90ml ph 8 pbs缓冲液，用氢氧化钠溶液调节ph至9,后定容至100ml）的10%的100 mm的pbs缓冲液中，40℃保温1小时，加入95%的1mm阿魏酸甲酯溶液反应5min，煮沸5min进行酶灭活，高效液相色谱检测阿魏酸含量。由图6可知，固定化酶在ph 4-9的相对活性均比游离酶高，且当ph为4时，游离酶相对活性为5%，而固定化酶相对活性保留50%以上。说明固定化后，酶的ph稳定性显著提升；
第十二步，最适反应温度测定：取5%第四步制得固定化酶与95%的ph为6的1mm阿魏酸甲酯溶液在20、30、40、50、60℃下保温10min后反应5min，煮沸5min进行酶灭活，高效液相色谱进行检测阿魏酸含量。由图7可知，固定化后酶的最适反应温度没有改变；第十三步，热稳定性测定：将5%第四步制得固定化酶在20、30、40、50、60℃下保温1小时后在40℃下与95%的ph为6的1mm阿魏酸甲酯溶液反应5分钟，煮沸灭活5分钟，高效液相色谱检测阿魏酸含量。由图8可知，在20-60℃时，固定化酶的热稳定性相较于游离酶都有所提升，相比于游离酶在60℃时10%左右的活性，固定化酶仍有85%以上活性；第十四步，可重复使用性：以降解去淀粉麦麸产阿魏酸为模式反应，检测固定化阿魏酸酯酶可重复使用性能，在20 ml的麦麸溶液与固定化酶混合反应体系中，加入200 mg的麦麸与3.24 u的固定化酶进行反应，200 rpm，37℃培养12 h，调节反应体系ph为4回收固定化酶，并用ph为6磷酸盐缓冲液溶解后进行下一轮分解麦麸产阿魏酸实验，重复五次后根据产生阿魏酸的量计算酶活性。
[0027]
综上所述，固定化酶的最佳条件是ph为7、交联剂含量为1%、交联时间为2h、交联温度为30℃。
[0028]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。