一种比率荧光探针的制备方法和应用

1.本发明属于化学分析检测技术领域，具体涉及一种比率荧光探针的制备方法和应用。


背景技术：

2.公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
3.硫化氢具有强烈的腐蚀性和刺激性，对人体伤害很大，对其有效检测迫在眉睫。硫化氢的传统检测方法有吸收光谱法、电化学法、气相色谱法和硫沉淀法等，上述方法对检测标样的预处理过程较为复杂且通常会对样品造成破坏，限制了其在硫化氢检测方面的应用。荧光探针法可以通过荧光强度的变化直观体现离子的存在，对样品的破坏性也很小，但是现有技术中的荧光探针对硫化氢的检测需要较长的响应时间，合成过程复杂、灵敏度低，检测范围有一定局限性，使用受到场地设备限制，无法大规模生产，此外稳定性差，保存较短时间的荧光探针即影响检测效果。


技术实现要素：

4.为了克服上述问题，本发明设计了一种比率荧光探针，可快速、灵敏检测硫化氢，具有检测限低、灵敏度高、用量少、检测范围广的优势。
5.基于上述研究成果，本公开提供以下技术方案：
6.本公开第一方面，提供一种比率荧光探针的制备方法，包括：以tcpp、硝酸铜和异硫氰酸荧光素为原料，进行两步溶剂热反应，即得。
7.本公开第二方面，提供上述制备方法制备得到的比率荧光探针。
8.本发明第三方面，提供上述比率荧光探针在识别和检测硫化氢分子方面的应用。
9.本发明第四方面，提供一种快速检测硫化氢浓度的方法，包括：将荧光探针加入到待测溶液中，混合均匀后检测荧光响应，得到荧光强度比值并计算出硫化氢浓度，即得。
10.本公开一个或多个具体实施方式至少取得了以下技术效果：
11.(1)本发明采用两步溶剂热法，且通过实践证明，一步溶剂热法和二步溶剂热法制备得到的荧光探针的结构存在一定的差异，因而在检测硫化氢方面的灵敏度、稳定性、检测范围和响应时间上均存在差异，采用一步溶剂热法制备得到的产物fitc峰很弱，而两步法中fitc在第一步生成了mof的基础上结合，结合的更加稳定，fitc的荧光更强。本发明发现两步溶剂热法制备得到的荧光探针能够具有灵敏度高、稳定性好、响应时间短、检测范围广的优势。
12.(2)本发明通过两步溶剂热法合成mof材料cu-tcpp(fitc)，该mof材料中卟啉tcpp由于其电子转移到金属离子cu
2+
上(lmct效应)而发生荧光猝灭作用。该材料可以识别并结合硫化氢分子，进而使荧光恢复作为响应信号。这种技术方法具有检测速度快，灵敏度高，
操作简单，成本低廉等优点。
13.(3)本发明的卟啉基mof合成时间短，原料廉价易得，且用量极少。该材料中的卟啉配体决定了其荧光性质十分突出。通过修饰形成的mof探针本身荧光几乎可以全部掩蔽，与硫化氢作用数秒钟后，荧光强度迅速增强，且增强幅度大。该mof材料具有检测限低(3.2μm)，灵敏度高，用量少(10μg/ml)，检测范围广(5～400μm)，比率荧光抗干扰性强的优点。
14.(4)本发明的荧光探针的稳定性研究显示，材料保存150天后不影响探针对硫化氢的检测，具有优异的稳定性。
15.(5)本发明操作方法简单、成本低、具有普适性，易于规模化生成。
附图说明
16.构成本公开的一部分的说明书附图用来提供对本公开的进一步理解，本公开的示意性实施例及其说明用于解释本公开，并不构成对本公开的不当限定。
17.图1为实施例1制备的cu-tcpp(fitc)合成及传感机理图；
18.图2为实施例1各材料的紫外光谱图，其中，(1)fitc的紫外光谱图，(2)tcpp的紫外光谱图，(3)cu-tcpp(fitc)的紫外光谱；(4)两步合成法和一步合成法的荧光谱图。
19.图3为实施例1制备的cu-tcpp(fitc)在不同硫化氢浓度中的荧光光谱图(1)，荧光强度比率和硫化氢浓度线性关系图(2)。
具体实施方式
20.应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本公开提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
21.需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本公开的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
22.正如背景技术所介绍的，现有的荧光探针对硫化氢的检测需要较长的响应时间，合成过程复杂、灵敏度低，检测范围有一定局限性，使用受到场地设备限制，无法大规模生产。因此，本发明提出了一种比率荧光探针的制备方法，制备的荧光探针mof检测硫化氢具有荧光增强幅度大、灵敏度高、检测限低，使用量少，比率荧光抗干扰性强等优势。
23.本公开第一方面，提供一种比率荧光探针的制备方法，包括：以tcpp、硝酸铜和异硫氰酸荧光素为原料，进行两步溶剂热反应，即得。
24.在一种典型实施方式中，所述两次溶剂热反应过程为：tcpp和硝酸铜两者进行第一次溶剂热反应后加入fitc进行第二次溶剂热反应；进一步，所述第一步溶剂热具体条件为：所述加热时间为85-100℃，时间为3-4.5h，优选为，加热时间为90℃，时间为4h；所述第二步溶剂热具体条件为：在30-50℃下搅拌反应20-28h，优选为35℃搅拌反应24h。
25.在一种典型实施方式中，所述tcpp、硝酸铜和异硫氰酸荧光素的质量比为：(1.5-2.6)mg:(5.4-7.5)mg:(3.5-5.8)mg，优选为2mg:6.3mg:5mg。
26.在一种典型实施方式中，所述以tcpp、硝酸铜和异硫氰酸荧光素为原料的具体步
骤为：将tcpp溶解于n,n-二甲基甲酰胺中，硝酸铜溶解于水中，混合后加入苯甲酸加热搅拌处理，随后加入fitc。
27.在一种典型实施方式中，所述tcpp与n,n-二甲基甲酰胺的比例为(1.5-2.6)mg:(8-15)ml，优选为2mg:12ml；所述硝酸铜与水的比例为(5.4-7.5)mg:(0.6-1.4)ml，优选为6.3mg:1ml；所述苯甲酸的质量为7-12mg，优选为10mg。
28.在一种典型实施方式中，第一次溶剂热加热搅拌后的反应液还需经历冷却、离心、洗涤过程，离心转速为10000r/min，采用乙醇洗涤3-5次。
29.在一种典型实施方式中，将洗涤产物加入乙醇后加入氢氧化钠的乙醇溶液，再加入fitc，随后均匀混合。进一步，所述fitc质量为3.5-5.8mg，所述乙醇体积为2.5-5.5ml，优选为4ml；所述氢氧化钠乙醇溶液浓度为8-12mm，体积为0.2-0.6ml，优选为氢氧化钠溶液浓度为10mm，体积为0.4ml。
30.在一种典型实施方式中，第二次溶剂热反应后冷却、洗涤、干燥后即得cu-tcpp(fitc)，进一步，采用乙醇洗涤5～6次，真空干燥10～12h。
31.本公开第二方面，提供上述制备方法制备得到的比率荧光探针。
32.本发明的荧光探针其本身具有荧光素fitc的荧光，在与硫化氢作用后，fitc的荧光强度小幅度变化，而卟啉tcpp的荧光迅速增强，最大发射波长为650nm(λex＝420nm)，具有优异的检测效果。
33.本发明第三方面，提供上述比率荧光探针在识别和检测硫化氢分子方面的应用，进一步，所述应用是将荧光探针用于水体系、有机溶剂体系或生物体中识别和检测硫化氢分子。
34.本发明第四方面，提供一种快速检测硫化氢浓度的方法，包括：将荧光探针加入到待测溶液中，混合均匀后检测荧光响应，得到荧光强度比值并计算出硫化氢浓度，即得；进一步，将荧光探针溶液加入到待测溶液中后测定荧光强度，所述探针溶液为cu-tcpp(fitc)的乙醇溶液，所述待测溶液为将硫化氢加入到hepes缓冲溶液中配制的溶液；进一步，所述cu-tcpp(fitc)最终浓度为10μg/ml，激发波长为420nm，发射波长选择为525nm和650nm，硫化氢的含量范围为5～400μm。
35.进一步，根据测定的650nm和525nm荧光强度的比值，建立硫化氢浓度和荧光强度比值的对应关系。
36.在一种典型实施方式中，所述缓冲溶液的ph为7.2，浓度为0.1m；所述待测溶液体积为2ml；进一步，采用振荡的方式搅拌均匀。
37.为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本公开的技术方案，以下将结合具体的实施例与对比例详细说明本公开的技术方案。
38.实施例1
39.如图1所示，cu-tcpp(fitc)的制备过程具体如下：
40.(1)将2mg tcpp溶解于12ml n,n-二甲基甲酰胺(dmf)，6.3mg硝酸铜溶解1ml h2o中，两者混合后加入10mg苯甲酸，将混合物在90℃加热搅拌4h。
41.(2)冷却至室温的反应液经离心(转速10000r/min)，乙醇洗涤3次。
42.(3)将(2)得到的产物加入乙醇(4ml)和氢氧化钠乙醇溶液(10mm，0.4ml)，加入fitc(5mg)，将混合物在35℃搅拌反应24h。
43.(4)冷却至室温，乙醇洗涤5次。真空干燥10h后获得cu-tcpp(fitc)。
44.将实施例1制得的mof探针cu-tcpp(fitc)使用紫外光谱进行结构解析。如图2中(3)所示，从图2中(3)可以看出mof具有419.4nm和544nm的卟啉特征峰。mof中仅有419nm sore带证实卟啉在mof中均匀分布，且没有生成分子级别的二聚体，sore带相对于415nm tcpp卟啉峰红移以及544nm新q带的出现和原先500nm到700nm之间4个q带的消失，确定了卟啉中心结合了铜离子。此外，包括mof中200nm到250nm之间的高吸收峰也证实材料cu-tcpp(fitc)中荧光素fitc的存在。从图2(4)中可以看出，采用一步溶剂热法制备得到的产物fitc峰很弱，而两步法中fitc在第一步生成了mof的基础上结合，结合的更加稳定，fitc的荧光更强。
45.实施例2
46.(1)将1.5mg tcpp溶解于15ml n,n-二甲基甲酰胺(dmf)，5.7mg硝酸铜溶解1.2ml h2o中，两者混合后加入8mg苯甲酸，将混合物在100℃加热搅拌3h。
47.(2)冷却至室温的反应液经离心(转速10000r/min)，乙醇洗涤3次。
48.(3)将(2)得到的产物加入乙醇(3ml)和氢氧化钠乙醇溶液(12mm，0.2ml)，加入fitc(4mg)，将混合物在40℃搅拌反应20h。
49.(4)冷却至室温，乙醇洗涤5次。真空干燥10h后获得cu-tcpp(fitc)。
50.实施例3
51.(1)将2.5mg tcpp溶解于10ml n,n-二甲基甲酰胺(dmf)，7.2mg硝酸铜溶解0.8ml h2o中，两者混合后加入12mg苯甲酸，将混合物在85℃加热搅拌4.5h。
52.(2)冷却至室温的反应液经离心(转速10000r/min)，乙醇洗涤3次。
53.(3)将(2)得到的产物加入乙醇(5ml)和氢氧化钠乙醇溶液(8mm，0.6ml)，加入fitc(5.5mg)，将混合物在50℃搅拌反应24h。
54.(4)冷却至室温，乙醇洗涤5次。真空干燥10h后获得cu-tcpp(fitc)。
55.实施例4
56.将实施例1制备得到的cu-tcpp(fitc)探针超声分散于乙醇中备用，其浓度为1mg/ml，制备得到探针溶液，将硫化氢加入到hepes缓冲溶液中配制待测液，硫化氢浓度为5～400μm，缓冲溶液的ph为7.2，浓度为0.1m。取20μl探针溶液，加入2ml待测液，常温震荡5min，转移至石英比色皿，于激发波长为420nm下测定其600～800nm的荧光光谱。
57.检测结果如图3中(1)所示，探针加入到低浓度硫化氢的缓冲溶液中后，在365nm紫外灯下可以看到微弱的荧光，这是因为少量硫化氢结合卟啉中心的铜离子,阻止了配体对金属电荷的转移，使荧光微弱恢复。当硫化氢浓度较高时，进一步结合了金属铜离子生成硫化铜沉淀，抑制了lmct作用，进而使荧光剧烈增强。
58.本发明的荧光探针对硫化氢的检测表现出很高的灵敏度。探针溶液的荧光强度，随着硫化氢浓度的增加而递增。大约在硫化氢浓度为400μm，荧光强度达到顶峰值。在0到400μm硫化氢浓度区间内，探针溶液荧光强度比值与硫化氢浓度有很好的线性关系。本发明荧光探针在对待测液的检测限为3.2μm。
59.随着检测液中硫化氢浓度的不断增大，溶液的荧光强度也不断增大，大约在硫化氢浓度为400μm，荧光强度达到顶峰值。在0到400μm硫化氢浓度区间内，硫化氢浓度与650nm和525nm荧光强度的比值呈良好的线性关系(图3中(2))，线性方程为y＝0.02233x
–
0.42082
(r2＝0.993)，线性范围为5～400μm。最低检测限为3.2μm。说明mof材料cu-tcpp(fitc)对于硫化氢的荧光检测下限低，检测范围广，有很好的应用价值。
60.以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。